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HSP70是HSP家族中最保守和最重要的一類應激蛋白，其自身表達水平與生物體受環境脅迫時細胞組織損傷及自身防御能力關系密切［9］．鈣網蛋白(calretuculin，CRT)是動物和高等植物體內普遍存在且高度保守的一種內質網鈣結合蛋白，具有維系細胞Ca2+穩態、調節蛋白質折疊和細胞凋亡等多種生物學功能［10］．ilerová等［11］首次克隆蚯蚓Eiseniafetida的CRT基因并鑒定其生物功能．親環素A(cyclophilinA，cyPA)作為一類具有肽基脯氨酸順反異構酶活性的免疫親和素，主要參與免疫調節和信號轉導，并發揮細胞因子的功能，在細胞生命活動中發揮重要作用，且對生物體炎癥的發生、細胞凋亡等具有調控作用．翻譯控制腫瘤蛋白(translationallycontrolledtumorprotein，TCTP)最初發現于腫瘤組織，被認為是一個在翻譯水平受到抑制的腫瘤相關蛋白，而后被發現是一種普遍存在并且大量表達的蛋白，在進化上高度保守，主要參與細胞周期的調控，對腫瘤細胞增殖和凋亡具有雙重作用．目前，關于外源污染物暴露脅迫下蚯蚓特異性蛋白基因表達的研究還較為缺乏．鑒于污染物與生物體之間的相互作用始于分子水平［12，13］，因此，有必要開展分子水平上多環麝香土壤污染脅迫蚯蚓特異性蛋白基因響應表達的研究．本研究以蚯蚓HSP70、CRT、cyPA、TCTP等脅迫蛋白類基因為主要對象，通過檢測分析低劑量AHTN或HHCB長期暴露脅迫下各特異性蛋白基因在轉錄水平上的表達量，以期篩選出敏感的分子生物標志物，應用于多環麝香污染土壤中亞急性毒性效應的早期分子診斷和生態風險評價中．

1材料與方法

1.1供試污染物和供試動物吐納麝香(7-乙?；?1，1，3，4，4，6-六甲基-1，2，3，4-四氫萘，AHTN)購自上海力智生化科技有限公司，純度99%;佳樂麝香(1，3，4，6，7，8-六氫-4，6，6，7，8，8-六甲基環五-γ-2-苯并吡喃，HHCB)購自天津中科健化工有限公司，純度99%．毒理實驗中采用的蚯蚓為赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)，是國際標準毒理試驗模式生物之一，購自南開大學教研基地天津蘆臺賈立明蚯蚓養殖場．選擇2～3個月齡、有明顯生殖環帶、體重為400～450mg的已篩選馴化后的成年蚯蚓作為供試受體生物．

1.2實驗方法

1.2.1蚯蚓特異性蛋白基因mRNA表達的RT-qPCR檢測按照試劑盒說明書Trizol法提取蚯蚓總RNA［14］．取1μg總RNA，采用逆轉錄酶ReverTraAce-a-(Toyobo，日本)合成cDNA．根據GenBank已發表的蚯蚓HSP70、CRT、TCTP、cyPA等基因cDNA序列信息，采用PrimerExpress3.0設計RT-qPCR擴增引物(表1)．RT-qPCR擴增反應體系為20μL，其中SYBRGreenⅠMix(Bio-rad，美國)10μL，ddH2O6.4μL，上下游引物(10μmmol•L－1)各0.8μL，cDNA2.0μL．反應條件為95℃預變性2min，45個循環(95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸采集熒光信號30s)．PCR反應結束后熔解曲線分析:95℃1min;60℃1min，60℃30s后，溫度0.5℃•s－1遞升至95℃結束．PCR產物經純化、連接轉化、克隆篩選等操作步驟，任選3個重組質粒由北京華大基因公司測序．采用NCBI數據庫中BlastX程序將供試基因與已發表基因間序列進行同源性比較．

1.2.2AHTN或HHCB28d暴露脅迫下蚯蚓特異性蛋白基因表達供試自然土壤取自天津塘沽森林公園，為未受工農業污染的潔凈表層土壤(0～20cm)，風干后過2mm篩待用，土壤理化性狀、污染物土壤背景值以及土壤染毒與配制具體方法見筆者前期研究［7］．根據AHTN與HHCB土壤亞急性毒性的效應濃度［7］，土壤長期暴露實驗染毒濃度設置5個梯度水平，分別為3、10、30、50和100μg•g－1．早期研究表明［17］，丙酮經過充分揮發后對蚯蚓幾乎無毒性影響，而且去離子水與丙酮對照組中基因表達水平無差異變化，因此，本研究僅設置丙酮試劑空白作為對照組．每個濃度處理組與對照組均設置4個平行．暴露28d結束后，分別于各處理組中任意挑選4條蚯蚓，即每條蚯蚓作為一個待測樣品，重復4次，進行基因表達水平的定量分析．1.2.3數據處理與分析以β-actin作為持家基因，對各供試目的基因mRNA表達水平進行定量分析?；虮磉_數據以平均值±標準偏差(mean±SD)的方式表示．數理統計均采用SPSS13.0軟件包分析．不同處理組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，多重比較采用Duncan法，顯著性差異水平為P＜0.05。

2結果與分析

2.1蚯蚓總RNA的純度與完整度由圖1可見，蚯蚓總RNA完整性較好，其28S與18S條帶清晰;并且RNA的A260/A280比值均在1.8～2.0之間，表明抽提的總RNA純度較高．因此，Trizol法提取RNA可滿足cDNA合成和RT-qPCR反應需求．

2.2RT-qPCR引物設計合理性的驗證通過測序比對結果可知(表2)，供試基因分別與已收錄的HSP70、CRT、cyPA和TCTP基因序列信息高度相似，表明RT-qPCR引物的設計可滿足目的供試基因片段擴增檢測要求．各供試基因的熔解曲線皆為特異的單個峰(圖2)，沒有出現引物二聚體與非特異性擴增，更加說明本研究引物設計以及RT-qPCR反應體系條件的建立適用于供試基因的特異性檢測．

2.3AHTN、HHCB28d暴露脅迫下蚯蚓特異性蛋白基因mRNA的響應表達暴露于AHTN或HHCB污染土壤28d后，蚯蚓各目的基因HSP70、CRT、cyPA和TCTPmRNA表達變化趨勢如圖3所示．當蚯蚓暴露于較低染毒劑量的AHTN(3μg•g－1和10μg•g－1)或HHCB(3、10和30μg•g－1)處理組時，其HSP70基因表達水平無明顯變化;而暴露于較高濃度AHTN(30、50和100μg•g－1)或HHCB(50μg•g－1和100μg•g－1)處理組時，HSP70基因表達水平分別較對照組水平顯著下調(P＜0.05)．總體而言，AHTN或HHCB長期污染對HSP70基因表達水平均有顯著下調抑制作用(P＜0.01)．且HSP70基因表達水平與AHTN或HHCB暴露濃度呈負相關關系(AHTN:r=－0.829;HHCB:r=－0.717，P＜0.01)．當蚯蚓暴露于3、10、50和100μg•g－1的AHTN污染土壤28d后，CRT基因表達量較對照組均顯著性上調(P＜0.05)，分別為對照組水平的2.2、1.8、5.0和2.0倍．10、30、50和100μg•g－1HHCB暴露處理組中的CRT基因表達水平也均顯著性上調(P＜0.05)，分別為對照組的2.9、3.2、1.8和2.3倍．與對照組相比較，蚯蚓暴露于AHTN或HHCB污染土壤28d后，各濃度處理組的cyPA和TCTP基因表達水平均無顯著性差異(P＞0.05)．

3討論

目前，由于暫時無法完全獲知污染物脅迫毒性作用的早期反應及真正靶位，于是難以對污染物的環境暴露水平與生態毒性效應給予準確、及時的預測評估，而以特定污染物所致生物體表達譜(基因或蛋白質水平表達)的改變作為污染物專一暴露的分子生物標記物，可以更加靈敏準確地對環境中一些持久性有機污染物的生態安全性做出早期預警和監測評價［19］．本研究發現暴露于高濃度AHTN或HHCB污染土壤28d后，蚯蚓HSP70基因表達水平受到顯著抑制;與之前濾紙急性毒性試驗結果相一致，高濃度AHTN或HHCB濾紙接觸染毒48h后，蚯蚓HSP70基因下調表達，主要是由活性氧自由基引起的氧化應激水平所誘導［17］．此外，在某些水生毒理學研究中也發現HSP70下調表達的現象．Lee等［20］研究發現四氯化碳、殺螟硫磷、壬基苯酚等污染物可抑制水生生物搖蚊幼蟲Chironomustentans的HSP70基因表達．Rhee等發現壬基酚、辛基酚等脅迫下HSP70基因表達表現為下調抑制，而雙酚A暴露則會誘導HSP70基因上調表達，認為其原因是不同種類分泌干擾物暴露脅迫對HSP70基因表達方式可能存在差異［21］．蚯蚓CRT基因表達水平在AHTN或HHCB土壤污染脅迫下表現為顯著誘導上調，其原因可能是CRT為了行使“分子伴侶”的生理功能或維系機體內Ca2+動態平衡而激發誘導CRT基因表達［22］．CRT基因的上調表達也是生物體應對氧化應激壓力的響應方式，是為了防御或降低細胞氧化應激損傷效應．多環麝香污染脅迫引起的蚯蚓體內活性氧自由基累積，可以起脂質過氧化并導致內質網的損傷，從而誘導蚯蚓機體內Ca2+水平的迅速提升，而CRT作為Ca2+的調控基因則表現位持續的上調表達［23］．不同種類外源污染物暴露脅迫對cyPA基因表達方式并沒有表現出一定的規律．Stürzenbaum等［24］研究發現暴露于Cd、Pb、Zn、Cu等混合重金屬污染土壤6周后，蚯蚓L．rubellus的cyPA基因表達水平顯著增加;而Brulle等［16］研究認為Cd土壤暴露6d后，蚯蚓E．fetida的cyPA基因表達卻被抑制顯著下調．本研究結果顯示AHTN和HHCB長期(28d)污染暴露對蚯蚓cyPA基因表達無顯著性影響．因此，cyPA基因尚且不具備作為分子生物標志物的特征，不適合用于多環麝香生態毒理效應的分子診斷．Api等［25］早期研究認為，多環麝香AHTN或HHCB不具備遺傳毒性致癌物的一些基本特性．本研究也發現，在AHTN或HHCB污染土壤長期暴露下，蚯蚓翻譯控制腫瘤蛋白基因(TCTP)的表達水平無顯著性變化差異，從側面說明了AHTN或HHCB沒有顯現可能致癌的特性．

綜上分析，HSP70mRNA水平下調與CRTmRNA水平上調的響應表達是為了保護蚯蚓抵御自由基氧化應激損傷，兩基因有望成為表征多環麝香土壤污染暴露水平及生態毒理效應的潛在生物標志物．考慮到分子毒理學研究中蚯蚓基因數據庫信息相對較少，對于具備潛在分子生物標志物特征的特異性基因，還需要開展cDNA全序列克隆及其編碼蛋白質的結構分析，為豐富蚯蚓基因序列數據庫和構建蚯蚓基因芯片檢測平臺奠定基礎，進而更有利于拓展多環麝香污染脅迫下高通量基因表達譜的研究．今后，還必須從生態毒理基因組學和蛋白質組學角度，綜合分析多環麝香污染物脅迫下蚯蚓特異性基因表達與調控的變化，揭示多環麝香的毒理機制與毒性作用靶位，從而構建多環麝香土壤污染早期預警的蚯蚓分子診斷技術體系．

4結論

(1)RT-qPCR引物的設計以及PCR反應體系條件的建立適用于各供試基因轉錄水平表達的特異性檢測．(2)AHTN或HHCB土壤污染暴露脅迫下，蚯蚓HSP70基因表達水平受到顯著抑制，而CRT基因表達水平顯著誘導上調;cyPA和TCTP基因表達水平均無顯著性變化．(3)HSP70與CRT兩基因將有可能作為潛在生物標志物，可應用于預測和評估土壤多環麝香污染水平及生態毒性效應．

作者：陳春劉瀟威鄭順安周啟星李松單位：農業部環境保護科研監測所農業部產地環境與農產品安全重點開放實驗室南開大學環境科學與工程學院環境污染過程與基準教育部重點實驗室中國石油冀東油田公司油氣集輸公司