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本文作者：張利王碩劉寶祥姚繼兵董亮趙長新作者單位：大連工業大學生物工程學院

釀酒酵母是與人類關系最廣泛的酵母，傳統上用于制作面包和饅頭等食品，工業上，主要應用于發酵谷類釀造酒類[1]。釀酒酵母的老化問題直接影響發酵的效率和產物，但目前沒有明確的方法來鑒定酵母的老化程度，因此，研究釀酒酵母酶老化過程中活力的變化趨勢，對于現代化工業生產有著極其深遠的意義。酵母細胞內含有多種酶，如：蛋白酶、蔗糖酶、核酸酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、乳糖酶、脂肪酶等[2-4]。本實驗通過蛋白酶、蔗糖酶、脂肪酶和核酸酶進行測定分析，最終確定酵母老化過程收稿日期：2011-11-28*通訊作者作者簡介：張利(1986—)，男，遼寧寬甸人，碩士研究生，研究方向為發酵工程。中酶活力的變化趨勢，為酵母老化的鑒定奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1試劑和設備

氫氧化鈉、福林試劑、酪蛋白、三氯乙酸、碳酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、可溶性淀粉、葡萄糖、醋酸鈉、鄰硝基苯酚(ONP)。B-22M高速冷凍離心機：ThermoIEC；超聲波細胞破碎儀：寧波新芝科器研究所；恒溫水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；紫外分光光度計：上海洪福儀器儀表有限公司；PHS-3C型精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；微量天平：上海方瑞儀器廠；恒溫培養振蕩器：上海智城分析有限公司。

1.2菌種

釀酒酵母FCC2144：大連工業大學菌種保藏所提供。

1.3實驗方法

1.3.1培養條件及代數的定義

本實驗將從菌種保藏中心斜面上接下的菌種定義為第1代菌種。采用L-B培養基進行液體培養，24h轉接1次，并且定義為1代。將種子液接于發酵培養基中于29.5℃、180r/min搖床培養60h。

1.3.2粗酶液的制備

將發酵液于4℃、10000r/min離心15min，收集菌體，并用去離子水洗滌菌體沉淀3次，將菌體放入冷凍干燥機中進行干燥處理。然后稱取干燥后的菌體按5%(w/v)的比例溶于pH8.8的磷酸緩沖液中，菌懸液在冰浴中進行超聲波破碎，超聲波條件為：工作3s，間歇5s，功率550W，溫度4℃，全程時間10min。將細胞破碎液于4℃、10000r/min離心15min，收集上清液，上清液即為粗酶液。

1.3.3乳糖酶活力測定方法

乳糖酶又稱β-D乳糖苷酶，能催化鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)水解生成鄰硝基苯酚(ONP)，ONP在中性和堿性范圍呈黃色，在420nm處有最大吸收峰。取3個15×100的試管，分別加入pH7.0的磷酸緩沖液2.8mL，37.5℃恒溫水浴5min，加入100μL濃度為4mg/mL的ONPG溶液和100μL粗酶液，37.5℃恒溫反應5min，于420nm處比色取平均值[5]。乳糖酶活力定義：在37.5℃下，1mL乳糖酶每分鐘催化ONPG水解生成1μmol鄰硝基酚(ONP)定義為1個酶活力單位。

1.3.4蛋白酶活力測定方法

采用國標法測定蛋白酶活力。取3個15×100的試管，加入粗酶液1mL，置于40℃水浴中預熱5min，然后在各試管中加入經同樣預熱的酪蛋白1mL，精確反應10min，時間到后馬上再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以終止反應。繼續放置在水浴鍋中保溫20min，時間到后立即4000r/min離心10min取上清液。然后另取3個試管，分別加入上清液1mL，再加入0.4mol碳酸鈉5mL、已稀釋的福林試劑1mL，搖勻后置于40℃水浴鍋中保溫20min后在660nm出測定吸光值[6-7]。參比實驗操作方法同上，唯在加入酪蛋白前先加入0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。樣品的平均光密度-參比的平均光密度=凈OD值蛋白酶活力定義：在40℃下，每分鐘蛋白酶水解酪蛋白產生1μg酪氨酸定義為1個活力單位。

1.3.5α-淀粉酶活力測定

通過3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖的含量來反映α-淀粉酶的活力。取1mL酶液于15×100的試管中，70℃放置15min，迅速冷卻后40℃預熱15min后，加入含量為1%的可溶性淀粉(40℃預熱)2mL，搖勻，40℃反應5min，加入0.4mol/L氫氧化鈉4mL，搖勻，取1mL反應液加1mLDNS，沸水浴顯色5min，迅速冷卻，蒸餾水定容至10mL，520nm下測定OD值[8-9]。參比：1mL酶液，70℃放置15min迅速冷卻后，40℃預熱15min，加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液，搖勻，加入1%可溶性淀粉2mL(40℃預熱)，其余同上。空白：1mL蒸餾水+1mLDNS，其余同上。酶活力定義：在上述條件下，每分鐘由底物催化生產1μg還原糖的酶量定義為1個酶活力單位。

1.3.6核酸酶活力測定方法

核酸降解后，降解產物的吸光值會增加，即所謂的增色效應，通過OD260值的改變來鑒定核酸酶的活力大小。參照Yasuda等[10]方法，在4mL反應體系中加入1mL酵母胞內核酸酶提取液，與3mL底物迅速混勻，在3min內迅速測定混合液OD260值的變化。底物液的配制：2mg放線菌DNA，60mL去離子水，0.1mol/L的醋酸鈉緩沖液10mL，混勻。酶活力定義：25℃下，每分鐘降解放線菌DNA的產物使260nm處吸光值變化0.01所需要的酶量定義為1個活力單位。

2結果與討論

2.1酵母生長曲線

本實驗對酵母進行老化培養，分別對第1代、第5代、第10代、第15代酵母的發酵液進行每3h取1次樣品，在600nm出測定光密度(OD值)，結果見圖1。由圖1可知，釀酒酵母在8h進入對數生長期，24h進入穩定期，不同代數之間有輕微的差異性，即隨著代數的升高，酵母進入對數生長期和穩定生長期的時間提前了，但酵母在穩定生長期的菌濃度隨著代數的增加而減小。

2.2釀酒酵母老化過程中乳糖酶活力的變化

本實驗對酶液進行3次平行測定，取平均值所得結果見表1。以鄰硝基苯酚的濃度為橫坐標、OD值(420nm)為縱坐標，得鄰硝基苯酚標準曲線如圖2所示。根據酶活力定義及鄰硝基苯酚標準曲線計算結果如圖3所示。由圖3可知，酵母乳糖酶活力在酵母老化過程中降低，從第1代的4.286降低到15代的1.261，大約降低70%。酵母乳糖酶活力的減弱說明酵母細胞在老化過程中對乳糖的利用能力在逐漸下降。

2.3釀酒酵母老化過程中蛋白酶活力的變化

本實驗對酶液進行3次平行測定，所得結果見表2。根據酶活力定義及酪氨酸標準曲線計算結果如圖5所示。由圖5可知，酵母蛋白酶活力在酵母老化過程中逐漸增加，從第1代的50.25升高到15代的82.16，大約升高65%。蛋白酶活力的明顯增加，加速催化水解酵母細胞膜和細胞壁上的蛋白質，使細胞失去穩定的結構和活性，這與細胞衰老的理論相吻合。

2.4釀酒酵母老化過程中α-淀粉酶活力的變化

本實驗對酶液進行3次平行測定，取平均值所得結果見表3。根據α-淀粉酶活力定義及葡萄糖標準曲線計算結果見圖7所示。由圖7可知，在釀酒酵母老化過程中，α-淀粉酶的活力在逐漸下降，從第1代的3.362下降到第15代的1.100，α-淀粉酶活力的降低，說明酵母細胞老化過程中，對于淀粉的分解和利用率在逐漸下降。

2.5釀酒酵母老化過程中核酸酶活力的變化

通過3min內A260值的變化來鑒定核酸酶的作用，所得結果如表4。根據核酸酶活力定義及酶活力計算公式得：酶活力=△OD260(3min)/(3×0.001)由圖8可知：在酵母老化過程中，酵母核酸酶的活力在逐漸下降，從第1代的31.4降低到第15代的7.8，大約降低75%。

3結論

經過多次實驗證明：在酵母老化過程中，蛋白酶的活力逐漸升高，乳糖酶、α-淀粉酶、核酸酶的活力逐漸降低。目前國內尚未見有報道關于酵母老化與酶活力變化關系的研究，本實驗通過酵母代數為載體針對酵母老化過程中酶活力的變化做了細致的研究，為酵母老化程度的鑒定提供有力依據。