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1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)飼料以大豆粕、次粉、米糠等配制全植物性基礎(chǔ)飼料(陰性對(duì)照組)，在基礎(chǔ)飼料中添加2%磷酸氫鈣(dibasiccalciumphosphate，DCP)作為陽(yáng)性對(duì)照組。飼料原料購(gòu)自上海農(nóng)好飼料有限公司，植酸酶活力為5000U/g(Danisco公司，所用植酸酶適宜pH。

1.2實(shí)驗(yàn)用魚(yú)實(shí)驗(yàn)用草魚(yú)幼魚(yú)為規(guī)格相近的當(dāng)年同批魚(yú)種，取自上海海洋大學(xué)南匯濱海養(yǎng)殖基地，新吉富羅非魚(yú)購(gòu)自海南寶路水產(chǎn)科技有限公司，兩種魚(yú)在上海海洋大學(xué)濱海養(yǎng)殖基地暫養(yǎng)1周后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.3飼養(yǎng)管理挑選健壯、規(guī)格整齊、平均體質(zhì)量為(12.59±0.09)g的草魚(yú)和平均體質(zhì)量為(9.59±0.12)g的新吉富羅非魚(yú)隨機(jī)分入200L的塑料圓桶中，每種魚(yú)分6個(gè)組，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾魚(yú)。用上述對(duì)照飼料和實(shí)驗(yàn)飼料飽食投喂草魚(yú)和羅非魚(yú)，每天投喂2次(07:30時(shí)、17:30時(shí))，投喂量為體重的3%～5%，隨魚(yú)體重量、天氣及攝食情況加以調(diào)整。養(yǎng)殖周期為8周，養(yǎng)殖期間，水溫25～30℃，NH+4-N＜0.4mg/L，溶解氧(dissolvedoxygen，DO)＞5mg/L。

1.4樣品的采集與處理養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束前饑餓1d后取樣，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾魚(yú)，每3尾魚(yú)合并成一個(gè)樣本，取肝胰臟、腸(去除內(nèi)容物)、胃(羅非魚(yú)，去除內(nèi)容物)分別裝入1.5ml離心管中，置于－20℃保存。酶活測(cè)定時(shí)，pH7.2的磷酸鹽緩沖液與所取內(nèi)臟樣品以9∶1［體積(ml)∶重量(g)］移入勻漿管，按2000r/min的速度在勻漿機(jī)上勻漿，4000r/min4℃離心10min，取上清，置于4℃保存?zhèn)錅y(cè)，24h內(nèi)測(cè)完。

1.5消化酶比活力的測(cè)定蛋白酶活力采用福林-酚法測(cè)定，總蛋白試劑盒(雙縮脲法)購(gòu)自邁瑞公司。蛋白酶比活力定義:在pH=7.2(胃蛋白酶為pH=2.5)40℃條件下，組織中每克蛋白1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸定為一個(gè)蛋白酶比活力單位(U/gprot)。淀粉酶比活力采用碘-淀粉比色法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。淀粉酶比活力定義:組織中每克蛋白在pH=7.2溫度37℃條件下與底物作用30min，水解10mg淀粉定義為一個(gè)淀粉酶比活力單位(U/gprot)。

1.6數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，先進(jìn)行單因素方差分析(one-wayanalysis，ANOVA)，影響顯著者再進(jìn)行Duncan’s多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2結(jié)果

2.1植酸酶對(duì)草魚(yú)和羅非魚(yú)淀粉酶比活力的影響表3顯示，草魚(yú)腸淀粉酶比活力各組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。草魚(yú)陽(yáng)性對(duì)照組肝胰臟淀粉酶比活力顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05)，但與1000U/kg和2000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組差異不顯著(P＞0.05);肝胰臟淀粉酶比活力1000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組比陰性對(duì)照組、250U/kg和500U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組分別提高57.85%、37.28%和50.22%(P＜0.05);2000U/kg與1000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組肝胰臟淀粉酶比活力差異不顯著(P＞0.05);250U/kg和500U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組肝胰臟淀粉酶比活力比陰性對(duì)照組略有升高，但差異不顯著(P＞0.05)。羅非魚(yú)腸淀粉酶比活力陰性對(duì)照組顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05);250U/kg和500U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組比陰性對(duì)照組略有升高，但差異不顯著(P＞0.05);1000U/kg和2000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組淀粉酶比活力比陰性對(duì)照組分別提高了53.37%和51.17%(P＜0.05)。肝胰臟淀粉酶比活力各組之間差異不顯著(P＞0.05)。胃淀粉酶比活力，植酸酶實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著，但均顯著高于陰性對(duì)照組，250U/kg、500U/kg、1000U/kg和2000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組比陰性對(duì)照組分別升高27.15%、37.22%、39.48%和26.54%(P＜0.05)。

2.2植酸酶對(duì)草魚(yú)和羅非魚(yú)蛋白酶比活力的影響，草魚(yú)腸蛋白酶比活力250U/kg和500U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組差異不顯著;1000U/kg和2000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組比陰性對(duì)照組分別提高了15.33%和16.69%(P＜0.05)，且與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。草魚(yú)肝胰臟蛋白酶比活力250U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組比陰性對(duì)照組提高7.91%(P＞0.05);500U/kg、1000U/kg和2000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組比陰性對(duì)照組分別提1000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組比陽(yáng)性對(duì)照組提高60.64%(P＜0.05)。羅非魚(yú)腸蛋白酶比活力各實(shí)驗(yàn)組之間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。羅非魚(yú)肝胰臟蛋白酶比活力各植酸酶添加組與陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);1000U/kg和2000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組可以達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組水平(P＞0.05)。羅非魚(yú)胃蛋白酶比活力250U/kg、500U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組略高于陰性對(duì)照組(P＞0.05);1000U/kg和2000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組顯著高于陰性對(duì)照組38.21%和41.12%(P＜0.05)，但與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)，4個(gè)植酸酶實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著(P＜0.05)。

3討論

植酸是植物細(xì)胞壁的組成成分，植酸酶的添加能破解細(xì)胞壁，水解植酸，消除其對(duì)消化酶的抑制作用，促進(jìn)消化酶和底物的作用(祁艷霞等2004);植酸酶作為外源酶，適量添加能夠促進(jìn)內(nèi)源酶的分泌(黎軍勝等2005);同時(shí)植酸酶添加前后磷的吸收量變化也會(huì)因魚(yú)體內(nèi)的能量代謝影響魚(yú)類(lèi)消化酶的代謝過(guò)程。酸、堿、重金屬等是蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的破壞體，二價(jià)金屬離子如Ca2+、Mg2+、Fe2+等對(duì)消化酶具有抑制作用(吳尚忠1983)。但不同的金屬離子對(duì)肝胰臟淀粉對(duì)不同部位消化酶的影響也不同(黎軍勝2004)。隨著植酸酶添加量的增加，原被螯合的金屬離子和重金屬離子被釋放，且濃度越來(lái)越高，成為抑制劑或激活劑(辛碧芬等2009)。本研究發(fā)現(xiàn)，植酸酶對(duì)草魚(yú)和羅非魚(yú)的消化酶比活力的影響隨著酶量和消化系統(tǒng)部位的變化而變化，如淀粉酶比活力在草魚(yú)肝胰臟中和羅非魚(yú)腸中變化顯著;而蛋白酶比活力除在羅非魚(yú)腸中變化不顯著外，在羅非魚(yú)的肝胰臟、胃以及草魚(yú)的腸、肝胰臟變化顯著，可能是植酸酶釋放了被植酸絡(luò)合的金屬離子，這些金屬離子對(duì)草魚(yú)和羅非魚(yú)各部位消化酶的影響不同所致。當(dāng)植酸酶超過(guò)一定量后，消化酶比活力并不隨著植酸酶添加量的增加而繼續(xù)升高，這可能是消化酶在金屬離子作為抑制劑和激活劑雙重作用下表現(xiàn)出不同活性的結(jié)果。

3.1植酸酶對(duì)草魚(yú)和羅非魚(yú)淀粉酶比活力的影響本實(shí)驗(yàn)中，草魚(yú)腸淀粉酶比活力各組之間無(wú)顯著性差異，而馬恒甲等(2011)認(rèn)為當(dāng)植酸酶添加量達(dá)到1000U/kg時(shí)，腸淀粉酶活力顯著高于陰性對(duì)照組，這種差異可能是兩者植酸酶品種或草魚(yú)規(guī)格不同所致。本實(shí)驗(yàn)中，草魚(yú)肝胰臟淀粉酶比活力1000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組最高，與陽(yáng)性對(duì)照組的效果相近，說(shuō)明植酸酶在草魚(yú)中可部分替代磷酸氫鈣，用于生產(chǎn)飼料中不會(huì)影響淀粉酶比活力。植酸酶添加量到達(dá)2000U/kg時(shí)，草魚(yú)腸道和肝胰臟淀粉酶比活力與1000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組比無(wú)顯著變化，說(shuō)明草魚(yú)的淀粉酶比活力對(duì)高水平植酸酶有一定的適應(yīng)性。真骨魚(yú)類(lèi)胃中發(fā)現(xiàn)有微弱淀粉酶活性，很可能是因?yàn)橥僖旱矸勖鸽S食物進(jìn)入胃中，剛攝入食物時(shí)，胃內(nèi)容物的pH接近中性，隨著唾液淀粉酶繼續(xù)發(fā)揮作用，一直到胃內(nèi)容物的pH變?yōu)?.5，唾液淀粉酶失活(孟慶聞等1987)。胃內(nèi)低pH環(huán)境不利于淀粉酶起作用，因此，自然條件下羅非魚(yú)等有胃魚(yú)主要依靠肝胰腺和腸的淀粉酶對(duì)糖類(lèi)起消化作用。羅非魚(yú)飼料中添加250U/kg植酸酶，腸淀粉酶比活力顯著提高，添加量達(dá)到1000U/kg時(shí)，腸淀粉酶比活力已經(jīng)略超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照組，比直接添加無(wú)機(jī)磷源的效果更好，說(shuō)明就淀粉酶比活力而言，在羅非魚(yú)飼料中用植酸酶全部替代磷酸氫鈣是可行的。研究認(rèn)為植酸酶添加量在1000U/kg時(shí)，奧尼羅非魚(yú)前腸淀粉酶活性最高(姚瑞清等2008)，這與本研究結(jié)果類(lèi)似，但1500U/kg和2000U/kg植酸酶劑量組的前腸淀粉酶活力顯著下降，這與本實(shí)驗(yàn)?zāi)c淀粉酶活力在2000U/kg時(shí)維持穩(wěn)定的結(jié)果不一致，可能是因?yàn)橄冈谌c中呈不均勻分布，前腸的消化酶活力并不能代表全腸(朱愛(ài)意等2010)。

3.2植酸酶對(duì)草魚(yú)和羅非魚(yú)蛋白酶比活力的影響本實(shí)驗(yàn)中，草魚(yú)蛋白酶比活力腸＞肝胰臟。1000U/kg組為最佳添加組，其肝胰臟蛋白酶比活力顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組，比直接添加無(wú)機(jī)磷源的效果更好，此結(jié)果和馬恒甲等(2011)在草魚(yú)中的研究結(jié)果一致。羅非魚(yú)蛋白酶比活力肝胰臟＞胃＞腸，腸蛋白酶和肝胰臟蛋白酶比活力在各植酸酶實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明植酸酶對(duì)羅非魚(yú)的腸蛋白酶和肝胰臟蛋白酶很敏感，并可能已作為底物被這兩種蛋白酶部分分解而造成植酸酶和蛋白酶活性的削弱(付石軍等2005)，抑或植酸酶經(jīng)過(guò)胃時(shí)，在胃中發(fā)揮作用的同時(shí)作為底物被胃蛋白酶部分分解。胃是進(jìn)行消化作用的重要場(chǎng)所，胃內(nèi)壁具有胃腺，主要功能是分泌胃蛋白酶。本實(shí)驗(yàn)中羅非魚(yú)胃蛋白酶比活力在1000U/kg和2000U/kg植酸酶實(shí)驗(yàn)組中得到顯著提高，說(shuō)明植酸酶對(duì)羅非魚(yú)蛋白酶比活力的影響主要發(fā)生在胃且對(duì)胃蛋白酶有很強(qiáng)的抵抗力，沒(méi)有或者很少被胃蛋白酶分解，此結(jié)果和前腸蛋白酶比活力在植酸酶1000U/kg時(shí)達(dá)到最大(姚瑞清等2008)的結(jié)果有一定差異，其原因可能與對(duì)淀粉酶的影響相似，即前腸的消化酶活力并不代表全腸。

3.3魚(yú)類(lèi)食性對(duì)植酸酶作用效果的影響食物消化時(shí)間在不同食性魚(yú)類(lèi)中長(zhǎng)短不一，常會(huì)影響外源酶的消化作用。草魚(yú)是典型的草食性無(wú)胃魚(yú)類(lèi)，草食性魚(yú)類(lèi)比雜食性魚(yú)類(lèi)的比腸值大，食物在其腸中的停留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，且腸絨毛發(fā)達(dá)，吸收能力強(qiáng)(畢冰等2011)，因此在草魚(yú)消化道呈堿性的情況下，植酸酶在單位時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用小，但隨著作用時(shí)間的積累，或能有效影響消化酶比活力。羅非魚(yú)是典型的雜食性有胃魚(yú)類(lèi)，食物停留在胃內(nèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，其胃排空時(shí)間為9h(孫曉鋒等2011)，所以消化時(shí)間較長(zhǎng)，有利于植酸酶的作用。消化酶的活性強(qiáng)弱與魚(yú)的食性密切相關(guān)，草魚(yú)的消化道中淀粉酶活性較高，羅非魚(yú)消化道中蛋白酶活性較草魚(yú)高。

作者：華雪銘陳瑤琴王世忠鐘國(guó)防周洪琪單位：上海海洋大學(xué)上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心