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本文作者：孫占斌1袁行方1王音嫻1張輝2張文會2馮永君1

作者單位：1.北京理工大學生命學院2.聊城大學生命科學學院

植物內生菌能定殖在健康植物組織內并與植物建立和諧聯合關系,它們能通過產生IAA、細胞激動素等物質,促進植物生長發育;還可通過產生抗生素、生物堿類物質與病原菌競爭生態位等起到對植物的保護作用[1],甚至能夠誘導植物產生系統抗性來增強宿主的生存適應性[2]。植物-內生菌這種和諧共生、互利共棲的生命形式,是“資源節約型,環境友好型”生態型農業發展的一條重要思路。

黃瓜是世界上分布最廣泛、最重要的蔬菜栽培作物之一,在我國蔬菜周年供應中同樣占有極其重要的地位。據聯合國糧農組織統計,2004年我國黃瓜栽培面積已達1502900hm2,產量達到25558000Mt[3]。黃瓜生長周期主要包括營養和生殖生長兩個階段。前者包括發芽和幼苗期;后者包括初花和結瓜期,該階段占據了大部分生育期且與產量形成密切相關。影響初花和結瓜期的因素除了環境因素(如溫度、光照、水分),還有生物因素如植物自身分泌的激素及內生菌的影響等[4]。由于植物與內生菌的作用是相互的,因此由于植物生長發育階段更替帶來的生理生化變化,必然會影響到定殖微生物的種群與數量等[5],相關研究對從微生態角度研究作物生長、產量形成具有重要意義,備受關注。目前國內外關于黃瓜內生菌的研究相對較少,且主要集中在內生真菌和放線菌方面,其研究目的也主要是在抗病與促生方面[6],關于黃瓜內生細菌的多樣性研究尚未見報到。本文則主要探索黃瓜初花和結瓜期內葉片可培養內生細菌的種類、數量及優勢菌的種類變化,為黃瓜促生內生細菌的理論探索和生產應用提供一定的研究基礎。

1材料和方法

1.1黃瓜品種與植株

黃瓜為“中農16”品種,由中國農業科學院蔬菜花卉研究所研制,抗多種病害,為目前華北地區瓜農種植主栽品種。黃瓜植株,于2010年4月中旬至5月中旬分3次采自北京市平谷區農業推廣學校蔬菜大棚。取樣階段為初花期和結瓜期,試驗對象為植株葉片。

1.2內生菌的分離與培養

分別取初花和結瓜期的黃瓜植株葉片各1g,用無菌水沖洗干凈,無菌濾紙吸干后,分別用75%酒精浸泡2min,2.6%NaClO浸泡5min,75%酒精浸泡1min進行表面消毒,再用無菌水沖6次,將最后一次沖洗液涂營養瓊脂(NA)培養基(g/L):牛肉膏3,蛋白胨10,氯化鈉5,瓊脂1820,pH6.87.0,1105Pa高壓蒸汽滅菌20min。平板檢查表面消毒效果,要求對照平板無菌落生長,確保表面消毒徹底。將消毒后的樣品放在加有9mL無菌水的無菌研缽充分研磨,靜置20min,再稀釋3個濃度梯度,各取0.1mL涂布到NA培養基中,每個梯度3個重復,置于恒溫培養箱中30°C培養13d。每個葉片樣品做3個重復。

1.3內生菌的純化與保存

細菌培養13d后分別記錄各平板的菌落數量,根據菌落形態(大小、形狀、顏色、表面光澤度、邊緣整齊度、透明度和質地等),鏡檢菌體形態(形狀、革蘭氏染色反應、排列方式和有無芽孢等);分別挑取有差異的菌落,在NA平板上劃線純化3次,將純化后的內生細菌編號后接種到相應培養基斜面上4°C冰箱保存,同時采用80°C甘油管凍存。

1.4內生細菌DNA模板的提取與16SrDN段擴增

將內生細菌培養至指數期,取1.5mL菌液用基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)提取基因組DNA,進行16SrDNA序列擴增。擴增選用通用引物[7],由上海生工生物工程技術服務有限公司合成：P1:27f(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3),P2:1492r(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)。PCR擴增時,94°C4min;94°C1min,55°C1min,72°C2min,共30個循環;72°C10min。PCR擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5細菌16SrDNA序列測定與同源性比對

PCR擴增產物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序后,用CHECK-CHIMERA進行嵌合體序列的鑒定,除去嵌合體及怪異序列,再與GenBank數據庫中的已知序列進行NCBIBLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對分析,尋找具有較高同源性的16SrDNA序列。確定各菌株有效序列后用ClustalX進行多序列比對[8],再用Megaversion4.1進行系統發育分析,其中系統進化矩陣按Kimura2-Parameter模型計估算[9],采用鄰接法(Neighbor-Joining)聚類分析[10],構建系統發育樹。重復取樣1000次進行自展值(Bootstrapvalue)分析評估系統進化樹的拓撲結構的穩定。

根據文獻,定義16SrDNA序列相似性大于98%歸于同一個物種[11]。

2結果與分析

2.1初花期和結瓜期黃瓜葉片內生菌的分離

將初花和結瓜期兩時期的黃瓜葉片表面消毒后,進行組織內生細菌的分離培養,結果表明,在NA平板上長出大量菌落,菌落形態存在明顯差異,說明黃瓜葉片中不僅存在大量內生細菌,且種類豐富。菌落計數得到兩時期內生菌數量分別為:初花期為(2.6±0.18)106CFU/g鮮重,結瓜期為(5.2±0.42)105CFU/g鮮重(顯著性水平P＜0.05),前者是后者的5倍。選擇差異明顯的菌落進行平板劃線純化,共得到81株內生菌;其中,初花期38株,結瓜期43株。

2.216SrDNA序列擴增及菌種鑒定

將兩個時期分離的81株內生細菌成功提取基因組DNA,對其16SrDNA序列進行PCR擴增均得到片段約1.5kb的單一條帶(圖1,圖中僅列出兩個時期部分內生菌的電泳條帶,其它菌的條帶位置與圖中一致)。將PCR產物測序并將測得的序列提交登陸GenBank并獲得登錄號(JN084129-JN084164,HQ874629)。

2.3系統發育分析

對上述初花期的38株和結瓜期的43株內生細菌的16SrDNA序列進行比對分析,結果見表1和2以及圖2和4。從分析結果(表1和圖2)看,初花期的38株內生細菌分別屬于4個細菌類群中的14個已知屬。其中放線菌類(Actinobacteria)最多,占60.5%,為優勢菌群,包含7屬。其次是厚壁菌類(Firmicutes),占28.9%,包含2屬。剩余的兩類：伽馬變形桿菌類(Gammaproteobacteria)和阿爾法變形桿菌類(Alphaproteobacteria)各占7.9%和2.7%,分別包含2屬和1屬(圖3A)。其中,短小桿菌屬(Curtobacterium)含有7株細菌,在初花期為優勢屬,其次是芽孢桿菌屬(Bacillus),含有6株細菌。其中,隸屬于短小桿菌屬的菌株Y1為最優勢種,占初花期分離內生菌總量(以CFU計)的57.6%。此外,隸屬于藤黃單胞菌屬(Luteimonas)的一株編號Y4的內生菌與已知序列同源性為96.8%,通過分子生物學及生理生化指標測定確定其為一新種,將在近期另文發表。需要指出的是,鑒于優勢種在所有分離菌的比例僅是依據形態學特征來區分和計算的,其統計數量和比例僅供參考之用。

從表2和圖4可以看出,結瓜期的43株內生細菌分別屬于5個細菌類群中的11個已知屬。其中伽馬變形桿菌類細菌最多,占46.5%,為優勢菌群,包含3屬。其次是阿爾法變形桿菌類,占23.3%,包含2屬,放線菌類和厚壁菌類占有相同的比例13.9%,分別包含3屬和2屬。異常球菌類(Deinococci)含量最少,為2.4%,僅含有1屬(圖3B)。其中,泛菌屬(Pantoea)含有15株細菌,是結瓜期的優勢菌屬,其次是農桿菌屬(Aqrobacterium),含有9株細菌。其中,隸屬于泛菌屬的菌株CE1為最優勢種,占結瓜期分離內生菌總量(以CFU計)的65.0%。

3討論

植物內生菌的分離鑒定是內生菌研究的首要問題,是內生菌與植物的互作研究、發現重要功效內生菌的前提,一直受到高度重視。本文選用在我國蔬菜種植中占有重要地位的黃瓜“

中農16”品種為研究對象,探究初花期和結瓜期葉片內生菌的多樣性,并對這些內生菌進行了16SrDNA鑒定。兩時期共分離到內生菌81株,初花期38株,分屬于14個已知屬,其中隸屬于短小桿菌屬的菌株Y1為最優勢種,占57.6%,發現Y4菌株屬于新種Luteimonassp.。結瓜期43株分屬于11個已知屬,其中隸屬于泛菌屬的菌株CE1為最優勢種,占65.0%。顯示出兩個時期黃瓜葉片組織內生菌的多樣性。

內生菌數量方面,初花期內生菌含量是結瓜期的近5倍,體現出不同生育期內生菌數量的顯著差異。這種變化可能與植物不同生長期的生理生化變化有關,或由于內生菌群之間出現競爭導致種類和數量發生變化。初花期的某些內生菌群可能與莖葉的形成、根系的發展和花的開放相關;結瓜期的某些內生菌群可能與結瓜期果實的發育成熟有關。因此,了解生殖生長期內生菌多樣性及動態變化,對于研究內生菌群和產量的關系十分重要。這種在不同生長時期,植物內生菌的種類和數量會發生變化的現象也在其它一些植物中發現。McInroy報道,棉花內生菌數量在不同生育期存在明顯差異：從苗期開始增加,到成株期達到最大,然后到成熟期又開始下降[12]。此外,在水稻[5]、番茄[13]、豆科植物[14]和花生[15]中也發現此類現象。

本研究顯示,黃瓜葉片內生菌種類豐富,表現出很強的多樣性,其中很多很可能具有一定的應用價值。結瓜期的優勢菌株CE1,占分離內生菌數量的65.0%,與其同源性最高的成團泛菌具有潛在的促生作用,例如我們前期研究發現與CE1同源性較高的成團泛菌YS19是水稻優勢菌群,它可以通過固氮或產生四種植物激素來促進水稻的生長[16]。有些則與抗病相關,與Y22菌株同源的蘇云金芽孢桿菌有殺蟲作用[17];與CE42菌株同源的多粘類芽孢桿菌有很高的殺菌抗病活性[18]。還有一些在環境治理修復方面具有重要的應用價值,比如與Y20菌株同源的裂解烴微桿菌,與Y37菌株同源的藤黃微球菌,與CE27菌株同源的簡單芽孢桿菌等[1920]。在初花期占分離菌總數的57.6%的優勢種Y1菌株,與其同源性最近的海洋短小桿菌在應用價值方面目前缺乏相關報道。本研究所獲得的內生菌在與黃瓜互作中的生物學效應,以及潛在的環境應用價值等都值得進一步研究。