前言：本站為你精心整理了桿狀病毒基因傳遞攻擊的方法范文，希望能為你的創作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

本文作者：萬婧、周向陽、周秀錦、邵宏宏單位：舟山出入境檢驗檢疫局

目前使用昆蟲桿狀病毒作為基因傳遞的載體用于基因治療受到了廣泛關注,其中研究最為深入的是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedro-virus,AcMNPV)[1]。桿狀病毒基因組較大且可操作性好,可以容納多個基因或較大的基因,而且桿狀病毒在哺乳動物細胞中不能復制,并對哺乳動物細胞有較高的轉導效率,使得桿狀病毒成為基因治療的潛在載體。桿狀病毒雖然能夠在體外對多種細胞系實現有效的基因轉導和表達,但其介導的體內基因轉導卻很少有成功的例子,這其中抑制桿狀病毒介導的基因傳遞效率的主要因素是血清補體系統[2]。補體是構成宿主先天性免疫的重要組成部分,并在先天性免疫和適應性免疫之間起著一定的聯系作用。補體可通過經典、替代和凝集素3條既獨立又交叉的途徑激活[3]。補體蛋白C1q可結合IgG或IgM分子的Fc區激活補體的經典途徑。補體的C3蛋白自發地水解為C3a和C3b,C3b暴露出具有反應性的硫酯鍵,與病原表面的氨基和糖基進行共價結合從而引發補體的替代途徑。當血清中存在的甘露糖結合凝集素(Mannan-bindinglectin,MBL)或纖維蛋白膠凝素(Ficolin)與細菌或病毒表面的甘露糖殘基結合后,激活MBL-相關絲氨酸蛋白酶,進而激活凝集素途徑。在所有途徑中,補體蛋白水解引起一連串級聯放大的連鎖反應,導致溶膜復合物(Membraneattackcomplex,MAC)的形成而引起膜穿孔[3]。補體系統的級聯激活受表面結合調節因子和可溶調節因子的嚴格控制,以免發生不適當的補體激活,導致宿主自身細胞受到損傷。表面結合調節因子包括補體受體1(Complementreceptor1,CR1)和補體促衰變因子(Decayacceleratingfactor,DAF),它們是引起C3b和C4b快速降解的輔因子,能阻止溶膜復合物的形成[34]。可溶調節因子如C4b-結合蛋白(C4BP)、H因子、FHL-1等,其中H因子和FHL-1是替代途徑中的特異性調節因子,而C4BP是經典途徑中的調節因子[5]。補體調節因子含有多個拷貝的短序列重復結構(Shortconsensusrepeats,SCRs)。許多哺乳動物病毒利用補體調節因子陷阱來逃避補體的攻擊。而且一些病毒產生的可溶蛋白與宿主的補體調節因子的結構和功能極為相似,例如正痘病毒和牛痘病毒[6]。利用可溶的補體抑制劑sCR1能抑制人體血清對桿狀病毒的滅活,使人們認為桿狀病毒通過經典途徑引起補體激活[2]。然而有研究表明,抑制補體激活的經典途徑和凝集素途徑僅僅提高了桿狀病毒30%的存活率,將所有途徑全部中和可以達到100%的存活率,而且桿狀病毒在缺少了C1q蛋白的病人血液中的存活率僅有25%[7]。最近有研究人員利用體外血液循環系統進一步闡明了補體激活的機制,表明桿狀病毒粒子可以與IgM和C3b結合[8]。上述結果表明替代途徑和經典途徑同時在桿狀病毒失活過程中起作用。在此結合國內外研究進展,概述了桿狀病毒逃避補體攻擊的多種策略,使桿狀病毒能夠有效地介導基因傳遞而達到基因治療的目的。

1免疫赦免位點作為基因傳遞的靶標體內存在一些稱作免疫赦免的位點,例如眼睛、腦和睪丸,這些位點不能針對抗原產生適應性激活和先天性免疫反應[9]。

1.1眼睛對角膜和眼前房的免疫赦免已有數十年的研究,認為其可以避免眼睛發炎而造成組織受損或視力下降。眼睛中存在補體激活的替代途徑和經典途徑,但卻受到多種補體調節因子,例如,DAF、MCP、CD59、I因子和H因子的嚴格控制,另外血眼屏障也限制了眼睛先天免疫系統的激活[10]。已有許多利用桿狀病毒載體高效轉導眼睛的報道。Haeseleer等首先利用表達GFP的桿狀病毒通過玻璃體內注射和視網膜下注射小鼠眼睛,闡明了傳遞方法之間轉導模式的差異[11]。視網膜下注射桿狀病毒限制了視網膜色素上皮細胞的轉導,而玻璃體內注射桿狀病毒導致基因在角膜內皮、晶狀體、視網膜色素上皮細胞和視網膜內表達。相似的研究證明,將桿狀病毒通過玻璃體內注射兔眼后,視網膜色素上皮細胞、視網膜和光感受器細胞能夠得到有效的轉導[12]。另外有研究利用玻璃體內注射桿狀病毒到大鼠眼睛,從內皮和神經元特異性的啟動子來闡明轉基因表達的特異性[1314]。這些結果表明桿狀病毒介導的基因傳遞可能在治療眼部疾病方面具有廣泛的用途。

1.2腦由于血腦屏障、缺少淋巴流和免疫調節特性的居留細胞導致中樞神經系統的免疫赦免。研究表明免疫赦免僅限于軟細胞組織,而不包括腦室、脈絡叢、腦脊膜和腦室周圍器官[15]。許多研究利用桿狀病毒作為載體將基因傳遞到腦組織。Sarkis等證明紋狀體注射桿狀病毒后,能夠轉導大鼠和小鼠的神經系統的細胞,而且注射補體C3蛋白抑制劑——眼鏡蛇毒因子的小鼠與對照組之間桿狀病毒介導的基因傳遞無明顯差異,因此該研究也首次證明了腦對桿狀病毒轉導的免疫赦免[16]。利用3個不同的立體定位圖譜:一個接近側腦室前角,一個是軟細胞組織的內部和紋狀體,進一步分析了桿狀病毒介導的轉導在小鼠腦內的偏愛性,結果表明對脈絡叢上皮細胞和微脈管內皮細胞具有較強的偏愛性,而紋狀體注射導致注射位點僅僅有很少的轉導細胞,而且桿狀病毒并未引起顯著的小神經膠質反應和臨床生化影響[17]。利用腦室內注射水泡性口膜炎病毒G蛋白胞外域(VesicularstomatitisvirusGpro-teinectodomain,VSV-G)假型化的桿狀病毒后,發現側腦室的上皮細胞、大腦導水管和蛛網膜的上皮細胞都能夠檢測到轉基因的大量表達[18]。研究人員用VSV-G修飾的桿狀病毒直接轉導鼠腦皮層后發現該假病毒對血液補體有很大的抗性[19]。Boulaire等對大鼠的腦、人的星狀細胞和神經元細胞注射桿狀病毒后,描述了宿主的反應,其中針對桿狀病毒的轉導,星狀細胞特異性的激活補體系統,選擇神經元特異性的啟動子可能避免轉導星狀細胞,而補體激活到何種程度才能影響體內轉基因的水平以及持續表達的能力還有待進一步論證[20]。這些結果為臨床治療腦部疾病提供了光明的前景。

1.3睪丸血睪屏障物理性的將血管和輸精管分開,使得睪丸也是一個免疫赦免組織[21]。目前利用桿狀病毒將基因傳遞到小鼠睪丸組織的研究報告僅有兩例:Tani等通過輸精管傳送表達GFP的桿狀病毒,發現基部的細胞和塞爾托利細胞有轉基因的表達[19];而Park等將桿狀病毒注射到白膜,使得外部的輸精管細胞有高水平的轉基因的表達[22]。在研究中未檢測到精母細胞和精細胞的轉導,表明了桿狀病毒可以被用來介導基因傳遞到睪丸組織,而且沒有種系傳播的風險。2體外轉導為提高基因傳遞效率,亦可人工創造免疫赦免條件。研究人員將桿狀病毒注射到兔頸動脈處的硅橡膠環內,避免了桿狀病毒與血液補體的接觸,使得外膜細胞內轉基因的表達水平明顯高于腺病毒介導的基因表達水平[23]。體外轉導是隔絕補體的有效措施,首次理論論證的結果表明在人肝灌注模型處能檢測到轉基因的表達。研究報道可以利用桿狀病毒將基因高效地傳遞到關節軟骨細胞,這個過程需要骨形態發生蛋白-2(Bonemorphogeneticprotein-2,BMP-2)的表達和旋轉生物反應器培養基,證明桿狀病毒可以在軟骨和骨組織加工方面作為潛在的載體。將這種方式的軟骨細胞加工應用到兔體時,可以在膝蓋骨的凹槽處修復軟骨缺陷[24]。Hu等首次證明了桿狀病毒可以有效地轉導人的間充質干細胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)以及起源于MSCs的脂肪形成細胞的前體、軟骨形成細胞的前體和成骨細胞的前體[25]。研究人員利用攜帶BMP-2的桿狀病毒轉導MSCs引起成骨細胞的分化,移植到裸鼠背部的皮下組織可導致異位骨的形成[26];而且在免疫兔體中利用表達BMP-2和VEGF的桿狀病毒轉導同種異系的MSCs時,可以增加股骨的部分骨缺陷的愈合[27]。已經證明桿狀病毒載體也可以將基因高效地傳遞到人的胚胎干細胞。大量的研究工作證實桿狀病毒的轉導并不影響基因組的穩定性以及胚胎干細胞的多功能性。利用桿狀病毒轉導起源于人的胚胎干細胞的神經細胞有助于神經系統的移植,為治療廣譜的神經疾病提供了可能性[28]。最近,桿狀病毒轉導的MSC細胞被用來將自殺基因——胸苷激酶傳遞到異種移植腫瘤[29]。這些結果表明了利用桿狀病毒作為體外治療載體的巨大潛在可能性。

3補體的藥理抑制劑

利用補體的藥理抑制劑滅活補體,可以避免桿狀病毒的失活。利用補體C3蛋白抑制劑——眼鏡蛇毒因子處理血清后,再進行基因轉導能夠抑制補體對桿狀病毒的滅活作用。進一步研究證明,利用能結合C3b和C4b的可溶性補體抑制劑sCR1處理人血清時,桿狀病毒的存活率呈現劑量依賴性[2]。Tani等利用補體B和C1蛋白的抑制劑FUT-175,也能恢復桿狀病毒的體內基因轉導活性[19]。到目前為止,利用補體的藥理抑制劑進行體內研究的報道僅有兩例。Sarkis等通過紋狀體注射桿狀病毒后,再用眼鏡蛇毒因子預處理,結果發現預處理的小鼠和對照組之間無明顯差異,揭示了腦的免疫赦免足以保護載體免受失活[16]。2005年,研究人員對小鼠的門靜脈注射高滴度的桿狀病毒,通過服用sCR1的處理組和對照組來證明體內補體激活的重要意義[7]。結果發現對照組的小鼠全部死亡,而處理組小鼠的2/3存活且存在較低水平的轉基因表達,進一步實驗證明降低病毒的劑量可以降低免疫反應的激活。而且兩組小鼠的肝組織學揭示了肝壞死和出血區域可能與補體系統的激活有關。當對小鼠注射高滴度的桿狀病毒時,其肝出血和死亡是否是由于血液凝固引起的有待進一步研究論證。這些研究結果說明進一步尋找合適的補體抑制劑對于降低免疫反應具有重要意義,也突出了未來臨床治療上劑量選擇的重要性。Georgopoulos等在人的體外血液循環系統中評估了兩種補體抑制劑的效果:C3裂解的抑制劑和C5a受體拮抗物(C5areceptorantagonist,C5aRA)[8]。兩種抑制劑均能引起細胞炎癥因子釋放的減少,與C3裂解的抑制劑相反,C5aRA卻不能拯救桿狀病毒的失活,表明在MAC的形成過程中C5b較C5a起了更重要的作用。此外,在體外血液循環系統中注射病毒和C3裂解的抑制劑后,發現血液細胞中的補體激活級聯反應明顯降低。注射桿狀病毒可引起肉眼可見的血塊凝固,加入抑制劑后可完全抑制血塊的形成。由此可見,C3裂解的抑制劑可以有效地抑制補體激活、炎癥因子的釋放和血塊的凝固,這些特性使其有望成為臨床應用桿狀病毒的有效抑制劑。

4桿狀病毒的表面加工

通過遺傳和化學方式加工桿狀病毒也可以在基因傳遞的過程中避免補體的攻擊[3031]。可以對桿狀病毒粒子表面進行加工,例如當病毒粒子從昆蟲細胞膜出芽時,可以將過表達的跨膜蛋白組合到病毒粒子的表面。同樣的,可以將感興趣的多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示于病毒粒子的囊膜上。通常將這種技術稱作桿狀病毒展示技術,這個真核展示平臺在藥物開發、疫苗和基因傳遞方面具有廣泛的應用[32]。將桿狀病毒的囊膜糖蛋白GP64作為融合伴侶是目前應用最為廣泛的表面加工技術[33]。GP64是病毒結合和進入細胞必不可少的蛋白,也是依賴低pH從核內體中脫去核衣殼,以及隨后從昆蟲細胞中出芽不可或缺的蛋白。為了避免由于GP64的修飾而可能導致病毒感染力下降問題的出現,研究人員也在探尋其他的表面展示技術,VSV-G即是其中一種[30]。已有研究證明,對病毒粒子進行化學修飾也是一種有效的表面加工技術[34]。

4.1聚合物包被聚合物能保護載體免受血液補體的識別,這種方法也被應用到桿狀病毒上。桿狀病毒表面帶有負電荷,因此可以用帶正電荷的聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)包被病毒粒子,這種包被依賴于病毒粒子和聚合物之間的靜電相互作用[31]。在50%的人血清中PEI可以使10%的載體免受補體的破壞,而在小鼠血清中可以達到100%。在感染復數為100,不超過0.2nmolPEI/106病毒粒子的比率時,轉導桿狀病毒不會引起細胞毒素的副作用。研究報道,PEI包被的桿狀病毒在肝和脾臟的轉導效率明顯高于未包被的病毒,而且在裸鼠模型中,包被的桿狀病毒能高效地抑制人異種移植腫瘤的生長。半乳糖化的PEI1800與PEI效果一致,卻提高了桿狀病毒在10%血清中的穩定性[35]。已有研究發現,利用另一種聚合物——聚乙烯乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)修飾桿狀病毒能提高基因在體外、鼠腦和肺中的轉導效率,而且聚乙二醇化的程度低于36.5%時對病毒的感染性影響最小[36]。此外,葉酸-PEG修飾桿狀病毒后在體外表現出受體特異性的基因轉移,而且能抑制人表皮癌異種移植模型中腫瘤的生長[34]。盡管未對聚乙二醇化桿狀病毒的血清穩定性進行研究,但是上述結果足以證明聚乙二醇化可以逃避免疫系統,并延長生物分子的循環時間[37]。然而,在利用PEI和PEG聚合物時,為保證病毒的感染性和較低的細胞毒性,需要對聚合物的尺寸以及聚合物與病毒粒子的比率進行最優化處理。

4.2假型化批次之間的差異以及保證病毒的感染性需要大量優化工作,這兩方面限制了化學修飾的應用。從遺傳學角度對載體進行加工,避免補體的攻擊是一個理想選擇。假型化是利用其他病毒表面蛋白替換病毒自身囊膜蛋白的過程,目前已被證明可以緩和補體攻擊的問題。VSV-G假型化的桿狀病毒應用最為廣泛,研究表明無論在體內還是體外,VSV-G都提高了桿狀病毒的轉導效率[19]。與未修飾的的桿狀病毒相比,VSV-G假型化的桿狀病毒對人、兔、豬、大鼠、倉鼠和小鼠的血清補體都顯示出較強的抵抗力。這些結果與VSV-G假型化的逆轉錄病毒和慢病毒的研究結果一致[3839]。研究證明在gp64-敲除型的桿狀病毒中,VSV-G和麻疹病毒受體CD46可以在一定程度上代替GP64的功能,使得桿狀病毒能夠在昆蟲細胞中復制和傳播[4041]。Barsoum等首先假定VSV-G假型化的桿狀病毒可以抵抗補體的攻擊,通過尾靜脈注射VSV-G假型化的桿狀病毒后,發現在小鼠肝細胞中有轉基因的表達[42]。研究人員進一步實驗證明,直接肌肉注射VSV-G修飾的桿狀病毒有一部分不被補體系統中和,提高了基因傳遞到小鼠四頭肌的效率[43]。Kaikkonen等表明共展示VSV-G蛋白的一個短的跨膜片段與完整的VSV-G一樣可以保護桿狀病毒免受補體的攻擊[30]。上述結果表明,對桿狀病毒的囊膜進行修飾,可以改變其免疫特性,而共展示異種囊膜蛋白提供補體保護的機理有待進一步研究。

4.3表面展示補體抑制劑通過遺傳方式在病毒粒子表面展示補體調節蛋白,這樣可以增加桿狀病毒載體在血清中的穩定性,第一個被展示的補體調節蛋白是DAF[44]。展示DAF-GP64融合蛋白的桿狀病毒可以高效轉導補體充足新生鼠的肝軟細胞組織,而對成鼠直接肝內注射后,發現轉導效果一般。研究人員證明了展示DAF的保護特性,并且評估了其他補體調節蛋白以及不同組合間逃避補體攻擊的效率,例如FHL-1、C4BP和MCP[30]。桿狀病毒在血清中的穩定性依賴于展示的補體調節蛋白和血清的來源,研究證明70%的小鼠血清以及13%的大鼠血清具有最佳的防護效果,將病毒粒子與50%的人血清孵育1h后,大約30%的病毒粒子仍能夠轉導HepG2細胞。通常細胞表面結合的DAF和MCP能較好地阻止補體激活,而同時共展示幾種補體調節蛋白達不到更好的效果。先前研究表明門靜脈注射高劑量未經修飾的桿狀病毒對小鼠是致死的,而門靜脈注射抑制補體攻擊的桿狀病毒能安全將基因傳遞到靶器官,與補體的藥理抑制劑相似,展示DAF提高了小鼠的存活率[7,30]。越來越多的證據表明補體系統和Toll-樣受體(Toll-likereceptors,TLR)之間存在大量的串擾現象,例如,在缺失DAF的小鼠中檢測到白介素1-b(Interleukin-1b,IL-1b)和白介素-6(Inter-leukin-6,IL-6)在TLR的刺激下顯著增加,表明了TLR引起的細胞因子反應對補體系統具有調節作用[45]。有趣的是,攜帶DAF的桿狀病毒與巨噬細胞孵育后,與對照相比,發現誘導產生的炎癥性細胞因子明顯減少。已經證明,補體的激活可以引起血液凝固,當高劑量的桿狀病毒接觸到血液也會引起這種現象。研究報道,展示DAF-VSV-GED能降低補體的激活和炎癥反應,也有可能降低血栓形成的風險。對表面展示補體抑制劑的不斷研究勢必會促進桿狀病毒作為基因傳遞載體的廣泛應用。

5結論與展望

桿狀病毒在哺乳動物細胞中不能復制,以及對哺乳動物細胞較高的轉導效率使它成為基因治療中越來越有吸引力的載體[46]。然而,桿狀病毒對人體血清中的補體系統高度敏感,要使桿狀病毒載體在基因治療中得到廣泛應用,必須克服補體系統的攻擊。避免補體系統攻擊的被動措施包括：將免疫赦免組織作為基因傳遞的靶標和體外轉導,這些措施被證明有潛在的應用價值,但是在臨床上不能廣泛使用。在未來的發展中,補體的藥理抑制劑有望以混合物的方式獲得廣泛應用,例如C3裂解的抑制劑,然而在基因治療中抑制補體的潛在副作用有待進一步評估[47]。因此,最理想的選擇是對載體自身進行加工,使其避免補體的攻擊,研究證實PEI包被和展示DAF的桿狀病毒具有巨大的應用潛力。桿狀病毒載體引起補體激活的分子機制仍不明確。C3b與蛋白抑制劑或者細胞表面的唾液酸結合就能失活,而桿狀病毒粒子缺少這些抑制蛋白,由于昆蟲宿主細胞檢測不到唾液酸轉移酶的活性,因此桿狀病毒也不攜帶唾液酸,所以不能失活C3b,也就容易被補體系統失活[3]。在能夠表達唾液酸的昆蟲細胞中生產展示DAF的桿狀病毒可能會更好地逃避補體的攻擊。明確桿狀病毒激活補體的詳細機理,對將來設計更高效的桿狀病毒載體以及基因治療的臨床應用具有重要意義。