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本文作者：苑園園、劉清明、廖富蘋、林健榮單位：華南農業大學動物科學學院

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是水產養殖重要的條件致病菌,能夠引起多種水產動物敗血癥,危害極大。目前由該菌感染引起的疾病絕大多數依賴抗生素藥物治療,對水環境、水產品質量和人類健康等的安全造成重要影響[1]。因而,采用生物防治技術或利用生物產物進行水產養殖動物嗜水氣單孢菌感染癥的預防和治療有重要意義。近年來,我國在嗜水氣單胞菌的生物防治領域已取得一些進展,單曉楓等[2]研究了糞腸球菌MLS-7對嗜水氣單胞菌有較強的抑菌作用,宋鐵英等[3]從土壤和植物中分離純化出拮抗菌LB3、K1、K29、E43,對防治鱉的嗜水氣單胞菌感染癥有效,秦生巨等[4]發現8株蛙弧菌對河蚌嗜水氣單胞菌具有裂解效果。周飛等[5]發現金銀花對嗜水氣單胞菌有較強的抑菌作用,彭金菊等[6]在32味中藥中篩選出五倍子、梔子、訶子、五味子、烏梅、黃芩、川黃連、石榴皮等8味藥物對嗜水氣單胞菌具有較強的抑菌活性,張梁[7]的研究表明大蒜素對引起草魚腸炎的豚鼠氣單胞菌具有顯著的體外抑菌及防治效果。芽孢桿菌是一類重要的具有生防潛力的細菌,這類菌株能產生多種抗菌物質[8],多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspo-lymyxa)CP7菌株是本課題組分離獲得的一株具有廣譜抗病原菌活性的拮抗性細菌,能夠分泌多種抗菌活性物質[9],在其發酵培養的上清液中,已知有3種抗菌物質存在:第1種是由23個氨基酸組成的具有抗革蘭氏陽性菌的Cpacin抗菌肽(廖富蘋等,發明專利號:200710118975)[10];第2種是抗革蘭氏陰性菌的多粘菌素類物質[11];第3種是抗真菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶[12]。本文研究了CP7菌株的抗菌蛋白(CP7ACP)對嗜水氣單胞菌S12菌株的抑殺作用機理,為CP7ACP在水產致病菌嗜水氣單胞菌的生物防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1菌株多粘類芽孢桿菌CP7菌株為本實驗室保存,嗜水氣單胞菌S12菌株來自中國水產科學研究院珠江水產研究所。

1.2CP7ACP的制備挑取平板培養的CP7菌株單菌落接種于5mLYEPD液體培養基中,于30°C、180r/min恒溫搖床中培養24h作為種子菌液,按1％接種量(體積比)轉接到發酵培養基中,于30°C、180r/min恒溫搖床中培養48h。將培養液置于沸水浴中處理20min后,迅速取出冰浴冷卻,于4°C、10000r/min離心20min,收集的上清液經0.22μm濾膜過濾后用33%硫酸銨飽和度沉淀其蛋白,經透析,即為菌株抗菌蛋白提取液,于20°C冰箱保存備用。可溶性蛋白的含量測定采用考馬斯亮藍顯色法測定抑菌蛋白的濃度。

1.3抑菌試驗和殺菌試驗S12菌液濃度經血球計數板計數為105106CFU/mL。用CP7ACP原液(濃度為27.84g/L)對S12的抗菌活性參照瓊脂板孔穴擴散法[13],孔穴直徑2.7mm,每孔穴加粗提液5μL,以消毒營養肉湯培養基為對照,30°C倒置培養過夜,測量CP7ACP對S12抑菌圈的直徑。采用二倍稀釋法測定CP7ACP對S12的最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)[14]。

1.4S12磷泄漏的檢測參照Newton等[15]的方法并做改進,將處于對數生長期的S12菌液于4500r/min離心10min,收集菌體。用pH7.0、5mmol/L的HEPES-Na緩沖液(含1%NaCl)重新懸浮洗滌除去雜質,重復23次,調節濃度約1.0×108CFU/mL;然后依次向10mL離心管中加入HEPES-Na緩沖液、S12菌液和CP7ACP的2、4倍稀釋液。使菌液最終濃度為2.0×107CFU/mL。以滅菌水處理作為對照組,30°C分別孵育0、10、20、30、60、90、120、150、180min后,迅即放置在冰浴上,4°C、4500r/min離心5min,收集上清,用紫外分光光度計在OD700測定上清液中磷的吸光度,通過標準曲線的回歸方程計算出含量,從而測算CP7ACP作用菌體后引起菌體磷泄漏的變化情況。處理樣品中磷含量的測定采用鉬銻抗(即鉬酸銨-酒石酸銻鉀-抗壞血酸)比色法[16]。

1.5CP7ACP對S12胞內的生物大分子物質影響的檢測生物體內的紫外吸收物質主要有蛋白質、DNA和RNA等,可通過檢測紫外吸收量來衡量分析,參照鄒文政等的方法[17]。取對數生長期的S12,用0.1mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋為1×106CFU/mL。CP7ACP的2倍、4倍稀釋液的分別與稀釋菌液于30°C共同孵育10、20、30、60、90、120、150、180min,以未加CP7ACP的稀釋菌液為對照;用0.22μm濾膜過濾檢測液,濾液于紫外分光光度計260nm波長測定其吸光值,以其衡量CP7ACP引起S12內泄出生物大分子物質的效應。

1.6紫外光譜法分析S12基因組DNA增色效應利用TIANampBacteriaDNAKit細菌基因組DNA提取試劑盒,提取S12基因組DNA,在0.01mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.2)介質中,S12基因組DNA與CP7ACP2倍稀釋液混合于30°C避光孵育,孵育時間經過3、6、12、18h后;以水調零做基線,置于紫外-可見分光光度計中進行掃描,分別測其波長在220300nm范圍內的紫外吸光光譜[18]。在整個操作過程中,樣品實行避光保存。

1.7CP7ACP對S12作用的電鏡觀察CP7ACP對S12菌體作用處理過程是:S12在營養肉湯培養基30°C條件下搖床培養12h,在對數生長期取菌液經5000r/min離心10min,棄上清收集沉淀,用10mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)調節菌的濃度為1×108CFU/mL,吸取制備好的S12菌液2mL至離心管中,然后加入CP7ACP至終濃度為2倍稀釋液,混勻,于30°C保溫0.5、1、3h后,5000r/min離心5min,收集菌體。加入適量的PBS緩沖液洗滌菌體3次,收集菌體。以滅菌水處理的菌液為對照。分別取上述經處理的樣品,加入1mL4%戊二醛固定液,混勻菌體,于4°C固定過夜。然后按常規方法處理樣品后,掃描電鏡觀察記錄、拍照。分別是取上述經處理的樣品,加入適量的PBS緩沖液洗滌菌體3次,棄緩沖液(不打散細胞),加入2.5%戊二醛固定液10min,然后5000r/min離心10min,于4°C冰箱中固定過夜。然后按常規方法處理樣品,透射電鏡觀察記錄、拍照。

2結果與分析

2.1CP7ACP對S12的抑殺作用CP7ACP對S12進行抑菌試驗,結果見圖1,經檢測抑菌圈直徑約8.1mm。經測定,CP7ACP對S12的最小抑制濃度(MIC)為3.48g/L,即只需CP7ACP原液濃度的1/8便可完全抑制S12菌體的生長,最小殺菌濃度(MBC)為6.96g/L,即只需CP7ACP原液濃度的1/4便可全部殺死菌體。結果表明CP7ACP對S12有明顯的抑殺作用。

2.2CP7ACP對S12磷泄漏的影響CP7ACP對S12作用后,菌體內磷的泄漏情況如圖2所示。從圖2中看出CP7ACP的2、4倍稀釋液處理30min,S12胞外的磷就分別達到110.9和89.7μmol/L,60min后磷濃度達到最高值,分別是117.5和94.3μmol/L,經方差分析顯示,P>0.05,即2、4倍稀釋液分別處理30、60min時磷泄漏沒有顯著性差異,而與對照組相比差異顯著(P<0.05)。結果表明CP7ACP能使S12胞內在短時內發生明顯的泄露,并且CP7ACP濃度越高泄漏量越多。

2.3CP7ACP對S12胞內的生物大分子物質影響生物體內的紫外吸收物質主要有蛋白質、DNA和RNA等大分子物質,以CP7ACP的2、4倍稀釋液處理S12,在260nm處檢測培養液吸光值,分析CP7ACP影響菌體大分子物質泄漏情況,結果見圖3。可見紫外吸收物質發生明顯的變化,在處理030min時,紫外吸收物質量急劇上升,3060min時達到峰值,此后處于平緩的狀態。對照區幾乎檢測不出紫外吸收物質的量值。經方差分析顯示,CP7ACP的2、4倍稀釋液作用后的吸光值差異顯著(P＜0.05),2、4倍稀釋液作用后的吸光值與對照相比差異極顯著(P＜0.01)。由此推測,CP7ACP會引起S12胞內紫外吸收物質即生物大分子的外泄。

2.4CP7ACP對S12基因組DNA的作用增色效應通常是由于DNA變性引起的光吸收增加,可作為衡量DNA變性的依據。CP7ACP處理S12基因組DNA后的增色效應檢測情況如圖4所示。從圖4中可以看出,CP7ACP處理S12基因組DNA后,在紫外光波長為260nm處發生了增色效應,處理時間越長增色效益越明顯,即18h＞12h＞6h＞3h,細菌基因組DNA的紫外吸光值隨作用時間的延長而上升。增色效應的發生,可能是CP7ACP與DNA表面的磷酸基團作用;或者部分結構嵌入到DNA分子溝槽中,使DNA原本收縮的構象趨于松散變性。

2.5CP7ACP對S12抑殺作用的電鏡觀察

2.5.1CP7ACP對S12作用的掃描電鏡觀察:S1被CP7ACP的2倍稀釋液處理0.5、1、3h。在掃描電鏡下觀察其菌體的變化,如圖5所示。正常S12的形態特征(圖5A),菌體呈桿狀,兩端鈍圓,結構完整,外觀飽滿,表面光滑、圓潤無孔洞。CP7ACP處理S12,0.5h后細胞表面變得粗糙,有孔洞出現,并且有些細胞間出現粘連(如圖5B箭頭所示);1h后有些菌體表面有明顯孔洞出現,表面凸凹不平,細胞與細胞之間的界限略變模糊,細胞形態趨向變形,邊緣模糊部分粘連在一起(如圖5C箭頭所示);3h后菌體細胞壁呈溶解狀,細胞變形破裂嚴重,內容物泄漏而使菌體細胞干癟、皺縮,表面粗糙程度加重(如圖5D箭頭所示),另胞外可看到許多大而明顯的附著在菌體上的白色分泌物,推測是正在外泄的細胞內容物(如圖5E箭頭所示)。

2.5.2CP7ACP對S12作用的透射電鏡觀察:S12被CP7ACP的2倍稀釋液處理0.5、1、3h后,用透射電鏡觀察其細胞的超微結構變化,見圖6。對照組菌體細胞的內膜和外膜結構完整,輪廓層次清晰、致密,胞內內容物充實且分布均勻,細胞邊緣光滑,圓潤(如圖6A所示)。CP7ACP處理S12,30min后細胞內容物出現溶解,質壁分離,細胞膜開始有破損,細胞邊緣及結構層次性模糊,細胞變成不規則多邊形,細胞外圍可見許多短線狀的絮狀物(如圖6B箭頭所示);1h后細胞壁破壞嚴重,出現許多缺損,細胞內結構模糊不清,原有的微細結構紊亂甚至消失,胞內內容物大量溢出,形成大片空白區(圖6C箭頭所示);3h后細胞壁、細胞膜破損更嚴重,細胞變形,出現很多缺口,胞內內容物大量流失,胞內空虛,整個細胞處于崩潰狀態(圖6D箭頭所示)。

3討論

目前認為抗菌肽殺菌的作用機制主要是其作用于病原菌的細胞壁、細胞膜,進而形成有規則結構的離子通道,胞漿完整性遭到破壞,細胞內外離子不平衡,使得離子或胞內內容物外泄,最終引起細菌死亡[1921]。Harder等[22]認為人抗菌肽β-defensin3能夠使細胞壁形成孔洞,導致細菌死亡。徐進署等[23]證明細胞膜結構是家蠶抗菌肽CM4攻擊的首要靶點。而Melittin和Pandinin是通過-螺旋的疏水中心垂直插入到細胞膜內,破壞細胞膜的正常結構[2425]。本研究通過掃描電鏡觀察發現,受處理的菌體細胞表面變得粗糙,細胞間出現粘連,隨著作用時間的延長,細胞形態變形,細胞表面出現明顯缺損,內容物外泄而塌陷,菌體破裂,菌體干癟,皺縮而壞死。透射電鏡觀察細胞結構也明顯看到,S12的細胞壁受損,出現孔洞;細胞膜甚至溶解,細胞器被破壞。Robert等[26]和Reddy等[27]認為抗菌物質作用于菌體后引起細胞內無機磷、DNA和蛋白質等生物大分子泄漏的原因是抗菌物質破壞了細胞壁,繼而破壞細胞膜,細胞內大分子結構受到破壞,生化級聯反應被阻斷,從而導致胞內離子的外泄,DNA和RNA等核酸物質的泄漏,以及胞內ATP水解等,使得受處理菌菌液中的磷、DNA和核酸類物質含量增多。本研究也發現受CP7ACP處理的S12菌體內無機磷和胞內生物大分子物質大量外泄,且是在短時間內發生、呈現急劇性的。此外,Boman等[28]和Chatterji等[29]認為抗菌肽通過與細菌DNA結合進而阻斷DNA的合成也是抗菌肽殺菌的原因之一。本研究發現CP7ACP使S12基因組DNA產生增色效應。這可能是CP7ACP與DNA表面的磷酸基團作用,或者CP7ACP部分結構嵌入到DNA分子溝槽中,使DNA構象趨于松散變性。綜上所述,CP7ACP的殺菌機制可能破壞S12的細胞壁和細胞膜,使S12胞內無機磷和DNA等生物大分子外泄或者是抗菌物質進入胞內與基因組DNA發生結合,引起細胞結構功能的破壞而導致細菌死亡的。嗜水氣單胞菌是在水體等環境中廣泛分布的有害性細菌,能夠引起淡水魚類敗血癥,對水產養殖危害極大。目前對該病的防治,主要使用化學藥物。然而,因長期、大量使用抗生素等化學藥品,現已引起了許多病原菌產生了耐藥性,并產生殘留,影響了水產品的質量與食用安全。為此,采用生物防治技術或利用生物產物進行水產養殖動物嗜水氣單孢菌感染癥的預防和治療受到越來越多的重視。CP7菌株的發酵上清液有Cpacin抗菌肽、多粘菌素類物質和β-1,3-1,4-葡聚糖酶等3種成分分別抵抗革蘭氏陽性、陰性菌和真菌,本研究中的CP7ACP實際上包括以上3種物質在內的蛋白質混合物。本研究利用CP7ACP體外作用嗜水氣單胞菌,研究表明CP7ACP能夠抑制魚嗜水氣單胞菌在瓊脂平板上生長,掃描電鏡和透射電鏡可明顯觀察到CP7ACP能夠抑殺魚嗜水氣單胞菌。嗜水氣單胞菌是革蘭氏陰性菌,CP7ACP中抑制革蘭氏陰性菌的成分是多粘菌素類物質。因此認為CP7菌株是嗜水氣單胞菌的拮抗菌,其分泌的活性成分多粘菌素類物質能夠強烈抑殺嗜水氣單胞菌的生長,可以考慮通過進一步的研究開發應用于防治魚嗜水氣單胞菌引起的病害。