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本文作者：朱珊珊、喻曉蔚、徐巖單位：江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室

作為真核表達系統,巴斯德畢赤酵母表達系統正以其獨特的優勢和潛力得到廣泛使用[1]。本實驗室在前期研究中,從一株釀造濃香型大曲酒酒曲中篩選獲得的華根霉中克隆得到其脂肪酶基因proRCL(GenBank登錄號No.EF405962),并在畢赤酵母中實現了克隆與高效表達[2]。研究所用的表達載體pPIC9K含有一個來自于乙醇氧化酶Ⅰ(AOX1)基因的嚴格甲醇誘導型的強啟動子pAOX1,但甲醇易燃,在工業放大過程中存在安全隱患。pGAP是一種糖酵解中的關鍵酶——三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAP)的啟動子,在葡萄糖、甘油等基本碳源的存在條件下,能高效地組成型表達外源基因,在培養過程中不需更換碳源,簡化了操作步驟,也更適合工業上的應用,因此我們考慮利用GAP啟動子來構建組成型表達proRCL的載體。外源基因整合入畢赤酵母,根據線性化位點位置的不同,將會導致兩種整合入基因組事件——單插入與雙交換的發生,產生兩種不同的表型,即Mut+和MutS。單插入事件通常會導致插入不同拷貝數的基因組,而雙交換一般是將單拷貝外源基因整合入基因組。多拷貝外源基因的整合可以提高外源蛋白的表達量,但是利用畢赤酵母表達系統進行定向進化的過程中,多拷貝的發生會干擾重組子的篩選,例如篩選酶活提高突變株時,拷貝數的增加也會導致酶活增高,從而干擾了酶活提高突變酶的篩選。而利用商業化的pGAPZαA表達質粒無法產生雙交換事件,為了同時利用啟動子pGAP進行組成型表達篩選,以及將外源基因雙交換整合入基因組產生單拷貝重組子,本文在保留了誘導型表達載體pPIC9K上的5′AOX1的基礎上,將PCR得到的pGAP基因片段插入到5′AOX1序列之后,華根霉脂肪酶基因proRCL之前,通過載體與基因組之間的5′AOX1及3′AOX1區發生的雙交換事件,將構建的組成型表達載體整合到酵母基因組中,產生MutS表型的菌株。雙交換的發生導致基因組中AOX1編碼區完全被取代,5′AOX1不能發揮啟動子的作用,只作為雙交換整合的必需元件。從而導致緊隨其后的GAP啟動子能夠順利的發揮組成型表達華根霉脂肪酶的作用。該表達體系顯著減少畢赤酵母基因多拷貝的產生概率,并能夠組成型表達外源基因。以華根霉脂肪酶為研究載體,利用該表達體系組成型表達華根霉脂肪酶,結合橄欖油-羅丹明B平板顯色法,建立了定向進化突變文庫的高通量篩選方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1工具酶和試劑:限制性內切酶、CIAP堿性磷酸酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、PCR試劑、pMD19-Tsimple載體,TaKaRa寶生物公司;引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成;DL2000DNALadderMarker、DL5000DNALadderMarker、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒、PlasmidMiniKitI,OMEGABIO-TEK;其余試劑均為國產或進口分析純。1.1.2菌株和質粒:E.coliDH5α由本實驗室保存。重組質粒pPIC9K-proRCL和重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-proRCLMutS由本實驗室構建,巴斯德畢赤酵母P.pastorisGS115、載體pPIC9K、pGAPZαA購自Invitrogen公司。

1.1.3培養基:大腸桿菌培養基LB及LLB,酵母培養基YPD、MD、MM和YPD-G418按“Invitrogen公司操作手冊”方法配制。橄欖油-羅丹明B培養基按照1.34%YNB、4×105%生物素、1%橄欖油、2%瓊脂的比例配置后,1×105Pa滅菌30min,滅菌后冷卻至60°C,加入1×103%過濾滅菌的羅丹明B,制成平板[3]。

1.2方法

1.2.1GAP啟動子的克隆:根據pGAPZαA上的pGAP的序列,設計一對專一性引物:BF:5′-CGGATCCGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCC-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點);ER:5′-GAATTCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAGAGATACC-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點)。以pGAPZαA載體為模板,PCR擴增GAP啟動子序列。PCR擴增條件:94°C3min;94°C30s,62°C30s,72°C50s,共30個循環;72°C10min。PCR產物純化后與pMD19-Tsimple載體連接,轉化至E.coliDH5α感受態細胞,轉化子提質粒,經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切,膠回收后得到pGAP片段。

1.2.2pGAPK-proRCL載體的構建:將重組質粒pPIC9K-proRCL(本實驗室構建)經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切,將無用的載體小片段替換成pGAP片段。利用T4DNA連接酶連接過夜。但是由于proRCL中也含有EcoRⅠ酶切位點,酶切后得到3個片段,根據3個片段的大小情況具體分析,去除284bp的無用片段,將剩余片段膠回收后按順序與pGAP片段進行連接。將連接產物轉化到DH5α感受態細胞,提質粒,獲得組成型表達載體pGAPK-proRCL。同時,將pGAP片段與酶切后的原始載體pPIC9K連接構成pGAPK,作為平板篩選法的對照。上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.3酵母的電轉化:將構建的組成型質粒pGAPK-proRCL經限制性內切酶BglⅡ酶切后,膠回收得到大片段線性化質粒,電轉化畢赤酵母GS115感受態細胞;取8μL濃度為1g/L的線性化質粒與80μL感受態細胞混合均勻,轉至0.2cm冰預冷的電激杯中。冰上放置5min,電壓1500V,電容25μF,電阻200,進行電擊。立刻加入1mL1mol/L山梨醇復蘇,30°C培養1h。將轉化液涂布于MD平板上,30°C培養2d[4]。pGAPK的電轉化方法同上。為了比較單插入與雙交換整合事件對重組子陽性率和拷貝數等因素的影響,我們按上述方法將原始載體pPIC9K-proRCL經SalI線性化后在HIS4位點單插入到酵母基因組中。

1.2.4重組子的篩選:從MD平板上挑選HIS+轉化子接種于YPD試管,培養16h,提取酵母基因組,利用pPIC9K序列引物5′AOX1、3′AOX1進行PCR,鑒定陽性轉化子。5′AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′;3′AOX1:5′-GGCAAATGGCATTCTGACAT-3′。PCR擴增條件:94°C4min;94°C1min,56°C1.5min,72°C2min,共30個循環;72°C10min。

1.2.5脂肪酶酶活的測定:將組成型表達菌GS115/pGAPK-proRCLMutS和誘導型表達菌GSll5/pPIC9K-proRCLMutS均按照invitrogen公司的pGAPZαA操作手冊的要求,在100mLYPD培養基中,30°C振蕩培養,每隔24h取樣測酶活。脂肪酶水解活力的測定方法參見文獻[5],酶活的定義為:一定反應條件下每分鐘產生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個脂肪酶水解酶活國際單位。

1.2.6產脂肪酶菌株高通量篩選方法的建立:將對照菌GS115/pGAPKMutS與構建的組成型表達菌株GS115/pGAPK-proRCLMutS點種于橄欖油-羅丹明B平板上,30°C培養3d,在紫外光下觀察單菌落變色圈情況。

1.2.7單插入和雙交換篩選庫的構建:利用定向進化技術建立的基因突變文庫的質量將對后續的實驗結果有重大影響。為考察單插入與雙交換這兩種不同的整合方式對整個建庫的影響,將經SalⅠ酶切的線性化對照質粒pPIC9K-proRCL和經BglⅡ酶切的線性化重組質粒pGAPK-proRCL分別通過單插入和雙交換方式整合進畢赤酵母基因組中,同時保證這兩種線性化質粒的量基本相同,進行電轉化。將獲得的誘導型Mut+轉化子涂布MD平板,將MD平板上的單菌落用滅菌牙簽挑至MM板上,誘導5d后,Fast-blueRR頂層瓊脂法染色,2min內能夠顯出明顯棕黑色的菌株為陽性重組菌(脂肪酶可以水解萘酯,水解產物與染料結合顯色)[6]。陽性重組率=所有MM板上誘導表達產脂肪酶的單菌落數/MD板上的單菌落數。將獲得的組成型MutS轉化子涂布橄欖油羅丹明B平板,對平板上的轉化子進行計數,根據平板上具有熒光變色圈的單菌落數與所有轉化子的數量比得到陽性重組率。陽性重組率=橄欖油羅丹明B平板上具有熒光變色圈的單菌落數/橄欖油羅丹明B平板所有的單菌落數。

1.2.8重組子拷貝數的定量:每個文庫隨機挑選10株陽性轉化子,提取基因組,利用熒光定量PCR技術進行基因拷貝數的定量[7]。

2結果與分析

2.1表達載體pGAPK-proRCL的構建以pGAPZαA質粒為模板,利用BF和ER引物PCR獲得GAP啟動子,同時在pGAP中引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。PCR產物條帶約750bp(圖1)。連接pMD19-Tsimple載體,測序,確認pGAP被完整的克隆,再經雙酶切獲得pGAP片段。由于pPIC9K載體和proRCL基因中同時都含有EcoRⅠ酶切位點,因此在雙酶切質粒pPIC9K-proRCL時,大部分的proRCL基因也被切除,因此需要將3個片段連接起來。如圖2A所示,雙酶切質粒pPIC9K-proRCL后將長片段與pGAP連接,構建pGAPK質粒。再用EcoRⅠ酶切線性化pGAPK質粒,將proRCL片段補回表達質粒中。由于線性化的pGAPK質粒過長,酶切位點容易自連,需要先進行去磷酸化處理,再連接proRCL基因,最終得到含pGAP的組成型表達載體pGAPK-proRCL。

2.2組成型表達畢赤酵母的獲得和鑒定本實驗選擇pGAPK-proRCL載體中BglⅡ酶切位點進行線性化,雙交換整合到畢赤酵母基因組中。雙交換會造成AOX1編碼區被取代,形成MutS表型的突變株,見圖2B。提取重組酵母基因組,利用pPIC9K序列引物5′AOX1、3′AOX1鑒定陽性轉化子[8]。陰性對照GSll5/pPIC9K-proRCLMutS的基因組PCR結果如圖3所示,產物條帶大小為1580bp。而插入了GAP啟動子的酵母重組子GSll5/pGAPK-proRCLMutS的基因組在此基礎上將載體上一段284bp的無用序列替換成750bp的pGAP序列,PCR擴增結果為2046bp,圖4的PCR驗證結果與預想的一致,證明組成型表達畢赤酵母GSll5/pGAPK-proRCLMutS構建成功,pGAP和proRCL基因已整合到基因組中。

2.3組成型表達華根霉脂肪酶的分泌表達圖5是組成型表達畢赤酵母的生長曲線,GSll5/pGAPK-proRCLMutS在100mLYPD搖瓶中培養144h后達到最大酶活,為130U/mL。而出發菌株GSll5/pPIC9K-proRCLMutS在相同條件下培養了8d,由于缺乏甲醇的誘導,幾乎沒有表達脂肪酶。結果證明GAP啟動子在畢赤酵母中發揮了組成型表達脂肪酶的作用。組成型表達畢赤酵母GSll5/pGAPK-proRCLMutS在012h處于遲滯期,細胞生長緩慢;1248h進入對數生長期,細胞成指數生長;48120h處于穩定期,細胞濃度基本不變;120h以后細胞處于衰亡期,菌體逐步自溶,釋放胞內蛋白酶使外源蛋白降解,酶活迅速降低。

2.4組成型表達脂肪酶的畢赤酵母高通量篩選方法橄欖油-羅丹明B平板變色圈法指利用橄欖油作為底物,用RhodamineB作為指示劑,通過脂肪酸與RhodamineB結合在紫外光下進行觀察,平板上產生熒光變色圈來判斷脂肪酶活力。如圖6所示,GS115/pGAPKMutS菌株未插入脂肪酶基因而生長緩慢,不產生熒光變色圈,只有GS115/pGAPK-proRCLMutS菌株才能在平板上正常生長,它能直接以橄欖油作為碳源表達脂肪酶,因此菌落較大且紫外條件下熒光變色圈大而明顯。該結果為進一步利用該篩選系統進行定向進化奠定了基礎。

2.5單插入和雙交換對轉化效率、拷貝數和篩選時間的影響對比單插入和雙交換這兩種不同方法,分別構建得到GS115/pPIC9K-proRCLMut+和GS115/pGAPK-proRCLMutS菌株。如表1所示,雙交換產生的MutS表型菌株和單插入產生的Mut+表型菌株的轉化效率均處于105數量級,因此MutS表型菌株的轉化效率較Mut+表型菌株的略低并不影響高通量的篩選。兩者的陽性重組率相差不大,均達到90%以上,雖然雙交換產生的陽性重組率較單插入略有降低,但鑒于它的高轉化效率,雙交換對建庫效率的影響是極其微弱的。MutS表型能夠保證全部菌株的單拷貝概率,而Mut+表型菌株卻只有51%的單拷貝菌株的概率。由此得出,雙交換整合得到的MutS表型菌株轉化效率和陽性重組率滿足了后續建庫的容量需求,并且能穩定的保證轉化子的單拷貝狀態,大大削減了多拷貝基因重組子的數量,更有利于我們利用該篩選方法進行單基因突變菌株的篩選。同時組成型表達脂肪酶的畢赤酵母通過利用橄欖油羅丹明B平板進行陽性重組子的篩選,省略了轉接培養基、富集培養、誘導和染色的步驟,將原始的培養誘導周期從12d縮短為3d,篩選時間縮短為原來的25%,操作簡單快捷,滿足了高通量篩選的要求。

3討論

本實驗通過在pPIC9K-proRCL載體的5′AOX1啟動子與proRCL目的基因之間插入GAP啟動子,雙交換整合到畢赤酵母基因組中,使基因組中AOX1編碼區完全被取代,阻礙5′AOX1誘導啟動子使用,發揮了GAP啟動子組成型表達的功能。組成型表達華根霉脂肪酶的畢赤酵母可以不經過甲醇誘導就在橄欖油羅丹明B平板上正常生長,操作簡便,排除了甲醇作為碳源時對橄欖油的利用率的干擾。載體雙交換整合基因組的方式不僅有利于插入的啟動子GAP成功的發揮組成型表達的作用,而且保證了所有重組子均為單拷貝菌株,排除了多拷貝突變基因的干擾,有利于后續的酶活提高菌株的氨基酸結構與功能的分析。橄欖油羅丹明B平板變色圈法利用脂肪酶水解底物橄欖油,產生的自由脂肪酸與羅丹明B結合,紫外線照射下,根據菌落周圍產生的橙色熒光圈的大小來判斷酶活的高低[910]。早在1986年,GiselaKouker等就利用該平板檢測細菌產脂肪酶的活力高低[9]。如今它不僅被普遍用于篩選自然界中產脂肪酶的菌株[11],牛衛寧等還將誘導型表達少根根霉脂肪酶基因的畢赤酵母點種于橄欖油羅丹明B平板,進行誘導篩選[12]。誘導型表達畢赤酵母的平板篩選需要首先涂布含葡萄糖的MD平板進行陽性克隆的篩選和富集,再轉移到含有甲醇的MM平板進行誘導培養和篩選。而組成型表達畢赤酵母可直接涂布橄欖油羅丹明B平板,利用只含有YNB的橄欖油羅丹明B平板就能得到陽性克隆,再根據脂肪酸與羅丹明B結合在紫外光下產生的熒光變色圈大小即能篩選到高產脂肪酶的突變株,篩選時間縮短為原來的25%。該篩選方法作為定向進化平板初篩脂肪酶的方法,具有操作簡便、直觀準確、縮短轉化子培養時間等的優點。本研究表明,將雙交換構建組成型表達載體和利用橄欖油羅丹明B平板變色圈法相結合的方法,成功實現了在3d時間內高通量的篩選組成型表達脂肪酶的畢赤酵母單拷貝重組子的目的,為后續的定向進化提供了簡便高效的篩選方法。