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本文作者：潘超強、高強、鄭春陽、孟慶艷、段強、馮少龍單位：天津科技大學生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室工業酶國家工程實驗室、天津強微特生物科技有限公司

由于公眾對全球變暖以及世界范圍內能源安全的擔憂,使得由可再生資源生產生物質燃料越來越受到重視[13]。盡管微生物發酵產乙醇已經有很長的歷史,而且在生物質燃料中扮演重要角色,但是由于它有低能量密度、高蒸汽壓、高吸濕性這些缺點而不能作為汽油的理想替代品[4]。相比較而言,長鏈醇擁有高能量密度、低腐蝕性、低吸濕性、更易與汽油和柴油混合以及與現今的設備更好的相容性等特點,使其成為潛在的新型可再生能源替代品和燃料添加劑[5]。用丙酮丁醇梭菌發酵生產正丁醇已經擁有近百年的歷史,最近也正受到極大的關注[6]。近年來,通過大腸桿菌代謝生產正丁醇,以及正丙醇、異丁醇、2-甲基正丁醇、3-甲基正丁醇等長鏈醇都被證明是可行的[5,711]。最近研究人員又成功地在細長聚球藍細菌內通過光合CO2循環生產異丁醛和異丁醇[12]。2010年3月17日,異丁醇被美國LeMansSeries(ALMS)學會宣布其為第五能源。然而現今世界范圍內異丁醇的生產仍然主要依靠石油為原料進行化學合成,但是隨著石油價格的持續上漲,以及石油化工引起的環境污染問題等制約了其進一步發展,從而使由可再生資源生產異丁醇展示了良好的發展前景。過去的研究表明,自然界中尚未發現能夠由葡萄糖合成異丁醇的原核生物。目前研究人員通過特定的基因工程技術對一些宿主菌進行改造獲得合成異丁醇的能力。2007年美國UCLA的研究小組首次向大腸桿菌內導入酮酸脫羧酶和醇脫氫酶基因以改造其纈氨酸合成途徑從而成功合成異丁醇[5],此后分別于2010年和2011年在谷氨酸棒桿菌和解纖維梭菌內利用此套系統實現了異丁醇的生物合成[4,13]。國內林麗華等[14]也利用相似的系統進行了異丁醇生物合成,產量達到3g/L。異丁醇的生物合成途徑是將纈氨酸前體2-酮異戊酸通過2-酮異戊酸脫羧酶(KivD)代謝成異丁醛,然后由醇脫氫酶(AdhA)還原成異丁醇(圖1)。大腸桿菌自身沒有2-酮異戊酸脫羧酶和以輔酶Ⅰ為輔酶的醇脫氫酶,因此需要外源引進這兩個基因并使其表達。本研究將乳酸乳球菌1.2829的kivD和adhA基因單獨或串聯克隆到大腸桿菌DH5α宿主中進行表達,從而合成異丁醇,并研究了KivD和AdhA酶活的最適溫度和pH。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種和質粒:乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)1.2829購自中國科學院微生物研究所普通微生物菌種保藏管理中心,大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α為本實驗室保藏。質粒pZY507由德國斯圖加特大學GeorgA.Sprenger教授贈送,質粒載體pMD19-TSimpleVector購自寶生物(大連)公司。

1.1.2主要試劑:限制性內切酶SacⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、T4DNA連接酶購自Fermentas公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒與細菌質粒小提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自RenogenBiolab科技有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、2-酮異戊酸、異丁醛、異丁醇與輔酶Ⅰ(NADH)購自美國Sigma公司;其它試劑為國產分析純。

1.1.3培養基和培養條件:大腸桿菌培養和轉化子篩選采用LB培養基,發酵培養基為添加終濃度0.2mol/L葡萄糖的LB培養基。轉化子篩選培養基添加抗生素為氨芐青霉素(終濃度為100mg/L)和鹽酸四環素(終濃度為50mg/L)。培養條件為37°C或30°C、200r/min。1.1.4引物:根據GenBank中乳酸乳球菌基因組序列設計PCR反應引物(表1,下劃線部分為酶切位點),并委托北京華大基因技術有限公司合成。引物1-s、1-as用于擴增2-酮異戊酸脫羧酶基因kivD。引物2-s、2-as用于擴增醇脫氫酶基因adhA。

1.2方法

1.2.1表達載體pZY507-kivD、pZY507-adhA、pZY507-kivD-adhA的構建:這3種表達質粒的構建如圖2所示。乳酸乳球菌基因組DNA的提取參照文獻[15]進行。使用引物1、2分別進行目的基因kivD和adhA的PCR擴增,反應條件:95°C5min;92°C45s,63°C45s,72°C90s,共32個循環;72°C10min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。質粒提取、DN段與載體的酶切和連接分別參照相應的產品說明書進行,大腸桿菌轉化參照文獻[15]進行。

1.2.2KivD和AdhA酶的表達:將經過基因改造后篩選得到的大腸桿菌E.coli-K、E.coli-A、E.coli-X(分別含有質粒pZY507-kivD、pZY507-adhA、pZY507-kivD-adhA)過夜活化后按1:100接入發酵培養基,37°C、200r/min培養,當OD600達到0.4時添加IPTG至終濃度1mmol/L,30°C、200r/min培養8h以誘導工程菌中KivD和AdhA酶的表達。

1.2.3KivD和AdhA酶的粗提:將方法

1.2.2得到的菌體離心(7000r/min,4°C,10min),再用預冷的0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(pH6.5)洗滌3遍,最后重懸于磷酸鈉緩沖液中。用超聲波破碎儀破碎菌體重懸液(功率400W,工作2s/間隔4s,共20min),離心(12000r/min,4°C,10min),取上清液即為粗酶液。

1.2.4異丁醇發酵:將基因工程菌E.coli-K、E.coli-A、E.coli-X活化后按1:100接入于LB種子培養基,37°C、200r/min培養過夜后再以1:100接種于發酵培養基,當OD600達到0.4時添加IPTG至終濃度1mmol/L,30°C、200r/min發酵24h。

1.2.5異丁醛、異丁醇和殘糖測定:發酵液中異丁醛與異丁醇產量采用Agilent7890氣相色譜儀結合G1888頂空進樣器測定。色譜條件:Poly-ethyleneGlycolHP-INNOWax色譜柱,FID(250°C)檢測器;進樣口壓力4.7543psi;初始柱溫40°C保持2min,再以15°C/min的速率升到110°C保持4.5min;氫氣流量30mL/min,空氣流量400mL/min,氮氣流量30mL/min;頂空條件:爐溫50°C,環溫60°C,傳輸管溫100°C,平衡時間5min,加壓0.4min,注射1min,重復測定3次取均值。發酵液殘糖使用SBA-40C型生物傳感分析儀測定,重復測定3次取均值。

1.2.6KivD和AdhA酶活測定與蛋白電泳檢測:KivD和AdhA酶活測定分別參照文獻[16]和[17]進行,在4mL反應體系中,KivD和AdhA粗酶液的加入量分別為500L與15L,重復測定2次取均值。粗酶液中蛋白含量使用BCA蛋白定量試劑盒測定,重復測定3次取均值。粗酶液的蛋白電泳檢測參照文獻[15]進行。

2結果與分析

2.1表達質粒的構建與鑒定以乳酸乳球菌(L.lactis)1.2829的總DNA為模板,按照方法1.2.1用引物1、2分別進行PCR擴增。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測發現,在1.4kb和1.1kb附近分別有特異的單一DNA條帶(圖3),與目的基因片段大小一致。將PCR產物與pMD19-TSimpleVector連接后委托北京華大基因技術有限公司進行測序,經過比對,PCR產物與目的基因序列kivD和adhA基本一致。按圖2所示,將質粒載體pZY507與相應的DN段進行酶切、連接并轉化入大腸桿菌DH5α宿主,然后在選擇培養基上挑取單菌落、提取質粒進行酶切驗證和PCR驗證,最后經過DNA測序驗證,逐步構建得到改造菌株E.coli-K(含有表達質粒pZY507-kivD)、圖3L.lactis1.2829目的基因PCR產物Fig.3PCRproductsofthetargetgenesofL.lactis1.2829注:1:1kbDNA分子量標準;2:引物1-s與1-as的PCR產物;3:引物2-s與2-as的PCR產物.Note:1:1kbDNAladder;2:PCRproductbyprimers1-sand1-as;3:PCRproductbyprimers2-sand2-as.E.coli-A(含有表達質粒pZY507-adhA)和E.coli-X(含有表達質粒pZY507-kivD-adhA),其中表達質粒pZY507-kivD、pZY507-adhA為tac啟動子下的單順反子系統,pZY507-kivD-adhA為tac啟動子下的雙順反子系統,且導入的2個外源基因均攜帶自身的核糖體結合位點。

2.2溫度和pH對KivD與AdhA酶活的影響按照方法1.2.3分別制備E.coli-K、E.coli-A、E.coli-X的KivD或/與AdhA粗酶液。按照方法1.2.6進行KivD和AdhA的酶活性質研究,溫度和pH對KivD和AdhA酶活的影響結果見圖411。

2.2.1溫度對KivD酶活的影響:溫度對酶活的影響分為兩部分:隨著溫度的升高,(1)瞬時酶反應速率提高,對酶活為正影響;(2)酶失活速率升高,對酶活為負影響。因此,溫度對酶活的影響取決于二者的強弱。由圖4和圖5發現,隨著溫度的上升,瞬時反應速率的提高對酶活的正影響逐漸被高溫引起酶失活的負影響所掩蓋,而且隨著體系溫度升高,酶反應完成程度也逐漸下降,因此較低的溫度有利于酶較長時間的反應。由圖可知,25°C、30°C、35°C的反應體系最終酶反應完成程度相差不大,但是鑒于25°C反應體系中初始酶活較低以及當環境溫度太高時(≥35°C)細胞老化較快,不利于長時間發酵,因此之后的酶反應實驗以及發酵實驗均采用30°C。

2.2.2pH對KivD酶活的影響:根據圖6和圖7,pH變化對KivD酶活有較大影響,pH6.5為KivD酶的最適pH,而且酸性pH對KivD酶活的影響比堿性pH更為顯著。

2.2.3溫度對AdhA酶活的影響:圖8和圖9結果顯示,隨著溫度的上升,瞬時反應速率的提高對酶活的正影響逐漸被高溫引起酶失活的負影響所掩蓋,而且隨著體系溫度升高,酶反應完成程度也逐漸下降,因此較低的溫度有利于酶較長時間的反應。由于25°C和30°C的酶反應速率差不大以及體系反應程度的微小差異,考慮到較高的溫度有利于菌體的生長代謝,因此之后實驗的酶反應溫度以及發酵實驗均采用30°C。

2.2.4pH對AdhA酶活的影響:圖10和圖11結果表明,pH對AdhA酶活有較大影響,pH6.5為AdhA酶的最適pH,而且堿性pH對AdhA酶活的影響比酸性pH更為顯著。

2.3粗酶液中蛋白含量測定與蛋白電泳結果按照方法1.2.6測定了粗酶液中蛋白含量,結果見表2,粗酶液蛋白電泳結果見圖12。由圖12發現KivD在E.coli-K中成功表達,AdhA在E.coli-A中成功表達,KivD和AdhA在E.coli-X中成功表達,但是由酶蛋白條帶的亮度可以看出KivD的表達量明顯低于AdhA。

2.4發酵產物及殘糖測定結果按方法1.2.5測定發酵液中異丁醛與異丁醇的產量和殘糖量,結果見表3。由表3發現只有串聯克隆表達kivD和adhA基因的菌株E.coli-X才能夠合成異丁醇。菌株E.coli-K由于缺少將異丁醛還原成異丁醇的醇脫氫酶,其發酵液中只有痕量的異丁醛但沒有異丁醇。異丁醛產量低有可能是因為由于異丁醛的積累對KivD乃至宿主自身造成了抑制,使得異丁醛不再繼續積累。

3討論

雖然目前尚未發現能夠天然發酵產異丁醇的微生物,但通過合成生物學手段改造的代謝工程菌株已經可以在實驗室規模初步實現這一目的。如UCLA的研究小組在大腸桿菌中過量表達了纈氨酸合成路線上游的3個基因(alsS、ilvC、ilvD),并敲除了相關代謝旁路的關鍵基因(adhE、ldhA、frdAB、fnr和pta)后,通過112h的長時間補料發酵,異丁醇最終產量可達到22g/L[5],證明了利用基因工程菌發酵生產異丁醇具有潛在的工業化前景。本研究構建的基因工程菌株E.coli-K(含有表達質粒pZY507-kivD)、E.coli-A(含有表達質粒pZY507-adhA)和E.coli-X(含有表達質粒pZY507-kivD-adhA)分別表達了KivD、AdhA和KivD與AdhA酶活力,表明質粒pZY507中tac啟動子下的單、雙順反子系統可單獨或共同表達kivD與adhA基因。與表達的酶活相對應,E.coli-K只產微量的中間體異丁醛,E.coli-A不產異丁醛與異丁醇,只有E.coli-X發酵24h異丁醇產量為0.12g/L。雖然E.coli-X的異丁醇產量與國內外的研究結果有較大差距,但本實驗進一步證明了這條合成路線具有可實行性,并為下一階段的研究奠定了基礎。酶活測定中粗酶液添加量的不同和SDS-PAGE結果證實,異丁醇產量不高的原因是KivD的酶量表達遠低于AdhA,此現象是否由基因串聯表達所引起有待于進一步研究,但該實驗結果揭示了KivD的表達量成為合成異丁醇的瓶頸。今后如能采用源自高酶活菌株的kivD基因重新構建表達質粒,或大幅度提高現有kivD基因的表達,并結合性能優良的大腸桿菌宿主與優化培養條件等措施,則異丁醇產量應有較大提高。