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本文作者：程襯襯淮穩霞姚艷霞趙文霞作者單位：中國林科院森林生態環境與保護研究所

櫟樹猝死病菌Phytophthoraramorum是一種危害性極大的病原菌，隸屬于藻界Chromista，卵菌門Oomycota，卵菌綱Oomycetes，霜霉目Peronospora-les，霜霉科Peronosporaceae，疫霉屬Phytophthora。其寄主范圍十分廣泛，危害多種林木和花卉，造成櫟樹和石櫟等樹木死亡以及杜鵑、莢蒾等花卉枝葉枯萎。病菌最早于1993年在德國和荷蘭有枯萎癥狀的杜鵑花和莢蒾分離得到。1995年美國加利福尼亞州櫟樹大面積死亡，分離到的病原菌，經生物學和核酸分析研究證明，這2種菌為同一種疫霉。由于疫霉多分離于土壤和水流中，很少在木本植物枝干上分離得到，2001年由歐洲學者將其定名為P．ramorumsp．nov．［1］，即“枝干上的疫霉”。該病菌因在美國引起櫟樹等樹木突然死亡(SuddenOakDeath，簡稱SOD)而聞名，故常常稱為櫟樹猝死病菌。病害在美國櫟樹和石櫟樹上的暴發，致使加州中部沿海的幾個城市和郊區森林公園中的成千上萬株樹木短時間內迅速枯死，引起了世界各國廣泛的關注和警惕［2］。

1病原菌生物學性狀

1．1病原菌交配型

Phytophthoraramorum為異宗配合型真菌，具有兩種交配型Al和A2，只有當Al和A2交配型共同培養才能完成有性生殖［1，3］。以往交配型的測定是通過交配型已知的菌株與待測菌株雜交以觀察其性器官的形成。這種方法比較耗費時間而且不是非常可靠，一方面有些菌株并不在培養基里交配，另一方面，只有少數菌株測定了交配型。基于P．ramorum交配型基因的分子診斷測定方法還沒有取得進展，因為這些疫霉屬的基因很少被了解，并沒有被克隆或者測序［4］。但是，北美洲以及歐洲種群的線粒體基因型看起來能充分區分兩種交配型，因為所有的EU1世系都是A1交配型(少部分例外)，而NA1和NA2世系均為A2交配型。BoutetXetal．通過致病性分析表明，EU1×EU1交配產生的單卵孢株之間具有較大的變異性，超過50%的后代對杜鵑花葉片的侵染能力要小于親本，然而EU1×NA1交配后代和它們的親本之間卻沒有明顯的差異［5］。Brasieretal．研究表明，兩種交配型具有相同的寄主范圍，同一種菌株對不同寄主的致病力似乎是相同的［6］。

1．2病原菌無性系

無性系是指單一基因型的所有無性繁殖個體［7］，無性系對于P．ramorum種群生物學十分重要。無性系描述需要進行大量的基因標記，主要包括交配型(A1或A2)標記、同功酶基因型標記和DNA指紋標記。P．ramorum變異性較大，嚴重限制了種群基因型研究。利用交配型標記、無性基因標記和生物化學標記為P．ramorum種群研究提供可靠且持續的依據。Elliotetal．利用PCR-RFLP標記技術研究確定了P．ramorum種群由3種無性系組成:一種源自歐洲(EU1)，另外兩種源自美國(分別為NA1和NA2)［8］。最初的交配研究表明，所有的EU1世系都是A1交配型，而NA1和NA2世系均為A2交配型［1，9］。但自2003年以來，歐洲發現了A2型菌株［10］，美國也發現了A1型菌株［11－12］，這表明了不同交配型之間雜交的潛力。無性系之間的區別不僅表現在交配型上，在形態學［13］、侵染力［9］、保守基因的核苷酸序列［14］以及遺傳多樣性［15－16］方面都存在差異。但是這些世系是古已有之還是近代人為原因造成的并不清楚。為了解這3種世系的進化歷史以及它們之間的關系，Gossetal．分析了一段具有5個細胞核突變位點的DNA序列，發現同一世系內的菌株之間并沒有區別［17］。聯合多種研究方法分析表明，3種世系大約已經進化了有16.5萬～50萬年的歷史。基因中包含了3種世系歷史性重組的鮮明特征，表明P．ramorum的祖先是通過有性生殖完成繁衍的。3種世系的基因差異很大，表明它們并不是通過單一的雜交繁殖種群產生的。相反，3種世系更可能來自3種不同的地理位置，它們在進入北美洲和歐洲之前各自獨立進化。

1．3病原菌培養

陰冷潮濕的環境對病原菌的生長有利，特別是當葉片及樹皮表面出現水膜時更有利于菌絲的生長［18］。病原菌生長的最適溫度為20℃，在15～25℃的條件下均能正常生長;－1℃時病菌生長緩慢，－9℃時仍可存活;當外界溫度超過30℃時，菌絲即停止生長:但是如果病原菌在陰冷的雨季侵入寄主，30℃的非持續氣溫下病害仍然發生［1，10，19］。

2傳播方式

P．ramorum可以產生厚垣孢子和游動孢子。游動孢子具鞭毛，可以自由游動。孢子可借助風力在空氣中近距離傳播，亦可借助雨水噴濺到易感植物上面，或者通過河流傳播到較遠的地方;遠距離傳播則主要是借助人類活動和寄主植物調運以及進出口貿易［20］。

3分子生物學和免疫學技術在P．ramorum研究中的應用

作為形態學鑒定的輔助，分子生物學和免疫學方法檢測P．ramorum的技術亦層出不窮，主要包括基于核糖體ITS片段和線粒體基因片段的傳統PCR方法，PCR-SSCP技術，PCR-RFLP標記技術，ELISA法，巢氏PCR法，以及微衛星分子標記技術等等。

多數研究表明，以美國農業部動植物檢疫局推薦的巢式PCR技術和歐洲及地中海植物保護組織(EP-PO)推薦的熒光PCR技術最為成熟可靠。一般來說，ELISA法具有相對較高的通量，可以減少樣品的使用量。ELISA法可以用來篩選所有的疫霉屬，但僅僅能鑒定到屬，而不能達到鑒定到種的水平［21］，可以作為檢測的第一階段，以便PCR技術的進一步施行。

Hayden等運用SYBRGreenI核酸染料，以ITS片段為基礎，利用實時熒光PCR技術檢測出了P．ramorum［22］。Hughes等對這一方法改進，發明了一種特殊的儀器(SmartCycler)，可以在野外使用［23］。

Bilodeau等以ITS、β微管蛋白和隱地蛋白等片段為基礎，利用TaqMan探針和SYBRGreenI核酸染料檢測出了P．ramorum［24］。但是較多研究表明，利用核糖體的ITS區域不能準確區分P．ramorum與其相近的疫霉屬以及P．ramorum的3種世系［22，25－26］。由于線粒體基因Cox1在基因組里顯示出高拷貝數，與單拷貝基因相比，它提供了一個較大的目標集中區，而且它在P．ramorum的3種世系間的片段是不同的［14－15，27］，所以被較多的運用到分子生物學的研究中。ElliottM等利用基于Cox1基因的PCR-RFLP分子標記技術確立北美和歐洲P．ramorum種群的3種世系，他們首先利用ApoI把P．ramorum從其他種群里分離出來，把EU1世系從北美洲種群里分離出來，然后利用AvaI區分NA1和NA2的基因型［8］。

伴隨著線粒體DNA序列的測序成功，利用實時熒光PCR技術來檢測P．ramorum的技術發展越來越快。與傳統的PCR方法相比，實時熒光PCR技術具有更高的敏感性和更強的特異性。TooleyPW等利用線粒體基因片段結合此技術鑒別了P．ramorum和P．pseudosyringae(一種在意大利發現的新種)［18］。實時熒光PCR技術可以非常迅速地檢測來自野外的少量樣品，通過序列來區分菌株，因為同樣大小的樣品雖然在序列上有輕微的差異，但它們的解鏈溫度并不一致［28－29］。更簡單的方法例如PCR-RFLP技術和巢氏PCR技術可以在大多數實驗室進行并且不需要很專業的設備。IvorsKL等利用RFLP技術表明在北美洲種群里，一個單一的無性系占據主導地位，而歐洲的種群則是由一列獨特而緊密聯系的RFLP類型組成的。同時，他們還分析了3條基因片段(ITS，coxII，nad5)的序列，結果表明所有的P．ramorum菌株的這3段序列都是相同的，系統發育分析表明P．ramorum與P．lateralis及P．hibernalis親緣關系最近［16］。IvorsKL等通過研究發現在加利福尼亞州苗圃里的病原菌基因多樣性比森林里的高一些［15－16］。

在P．ramorum世系中，高變量微衛星標記技術已經被證明可以調查其種群結構。微衛星作為共顯性標記最突出的特點是可以呈現出較高的變異性，從而被頻繁地應用于種群基因結構的研究中。但是對于無性繁殖的生物體來說，多變微衛星位點的識別仍然鮮有研究。

IvorsK等［16］和ProsperoS等［30］分別設計了12對和10對微衛星標記，但只有少數在NA1世系中展現出極強的變異性。IvorsK等在美國森林的種群里沒有發現變異，而ProsperoS等于2001至2004年間分別在俄勒岡州的一片獨立森林的固定樣點以及俄勒岡州的苗圃里采集分析了292個病原菌種群的基因結構，結果表明，在俄勒岡州的森林和苗圃之間缺乏基因交流，而且森林里的基因多樣性較低，在這4a里，森林里的多基因座基因型是非常普遍的，每年也會出現低層次的基因型。

BoutetX等利用微衛星分析發現交配后代呈現出基因重新排列的現象，這種現象要么是兩種親本(EU1×NA1)的等位基因重組，要么是在由雜合性向純合性轉移的過程中導致某一親本的等位基因的缺失(EU1×EU1)［5］。

MascherettiS等利用minimum-spanningnet-work方法分析了這些多基因座遺傳型(MGs)，發現一般的較常見的基因型分布在中間，而特殊的個體分散在各個枝端，這些特征與隨著本地進化而進化的少數普通基因型的集群現象相符合。他們還利用分子變異分析和空間自相關分析研究了病原菌的起源和現今的基因結構，并利用一段非常小的樣本量分析了病原菌潛在的傳播方式［31］。

近年來，科學家們利用基于微衛星標記技術的分子分析方法證實，分布在北美洲和歐洲的3種世系(EU1、NA1、NA2)分別簇集在3支獨立的進化枝上［15，27，32］。第1支(EU1世系)包括歐洲分布的唯一無性系以及偶爾發現于北美洲苗圃，第2支(NA1世系)主要是分布在北美洲森林和苗圃的世系，第3支(NA2世系)僅存在于加利福尼亞州以及華盛頓州的少數苗圃里。

4P．ramorum對生態環境的影響

P．ramorum對生態環境的影響不僅體現在直接致死樹木上，還有許多間接影響。RizzoD等指出，許多很嚴重的影響并不會在短期內體現出來，而是一個長期的過程［33］。一些研究案例已經體現出短期的間接影響。WaringK等研究發現，密花石櫟的致病死亡可以間接導致周圍紅杉林的生長速率增加［34］。也有很多研究根據現今的觀測數據和重建技術證明了短期影響并推測出了未來狀況，例如，RamageB等利用此方法調查了P．ramorum對紅杉林特有構型的影響［35］。P．ramorum對生態環境的長遠影響也可以從經歷過林木死亡慘重地區的再生模式推測出來。現今的再生模式需要考慮哪些樹種可以取病地區的密花石櫟，過渡期對發病的森林來說很重要，尤其是那些樹種多樣性很低的森林類型(比如紅杉林)。RamageB等綜合調查了受P．ramorum影響的森林再生過程，發現在密花石櫟死亡的地區，并沒有其它闊葉樹種可以替代密花石櫟。另外，某些受害嚴重的地塊缺乏足夠的樹種占據可利用的生長空間。他們在調查中發現了不適當的再生模式，最適當的再生模式并沒有顯現［36］。需要注意的是，此研究僅設了一個研究區域(加拿大的馬林郡)，仍需后續研究的補充才能在更寬泛的尺度上得以論證。

5野外和苗圃防治

目前，雖然有各種方法可以降低P．ramorum的影響，但并沒有一項可以確保消除此病原菌，甚至難以確保1株樹免受其害。由于林分類型不一，同一種方法不可能適用于所有的森林類型，民眾接受程度以及財政負擔程度也是一些舉措能否成功應用的決定性因素。但是，如果認真、徹底地采取某些措施，是可以減緩病原菌的傳播速度，降低病原菌對樹木危害的。

5．1野外防治

在美國的俄勒岡州，人們基于景觀和地區水平開展對P．ramorum的防治管理工作，以徹底根除所在林地發現的病原菌。措施包括:飛機偵測和水道監控等一系列的前期檢測;由美國農業部動植物衛生檢疫局和俄勒岡州農業部共同領導檢疫，以阻止本地區的染病寄主材料移出;一旦發現有樹木感染，不管有沒有產生癥狀，立即移除，并在每一個受侵染的樹木周圍設立91.44m的緩沖區。

5．1．1栽培技術

SwieckiT等做了一項研究，如果在一棵禾葉櫟周圍5m范圍內栽種月桂樹，即可有效預測疾病風險，降低橡樹受侵害的可能。這為采用改變栽培技術的方法幫助林木抵抗P．ramorum提供了強有力證據［37］。

5．1．2化學防治

GarbelottoM等對健康的櫟樹和密花石櫟使用亞磷酸鹽殺真菌劑處理，效果良好［38］。亞磷酸鹽并非直接作用于疫霉屬病原菌，而是通過注射至樹干或直接噴灑在樹干表面促使樹木產生各種各樣的免疫反應，對生態環境無任何污染。

5．1．3造林方式

ValachovicY等在美國加州西北海岸的洪堡郡做了一個試驗，通過改變造林方式來防治P．ramorum［39］。在受侵染的林分設置許多重復試驗，通過鋸割并轉移密花石櫟和月桂樹來降低潛在的菌株密度。這是美國加州第一次基于林分水平的大規模造林試驗的嘗試。

5．2苗圃防治

5．2．1化學防治

針對重要的觀賞植物和圣誕樹進行了多種化學藥劑防治試驗—P．ramorum的主要4屬寄主植物，即杜鵑屬、山茶屬、莢蒾屬和馬醉木屬。精甲霜靈、甲霜靈、烯酰嗎啉、咪唑菌酮4種最有效。多種研究表明:化學藥劑一般只能起到預防作用，并不能根除病原菌，需要重復間隔使用，而且掩飾病害癥狀、影響檢疫，長期使用病原菌會產生抵抗力［40］。

5．2．2灌溉用水

如果灌溉用水的源頭是溪流，則有可能被森林里的病原菌侵染，很多研究的焦點集中在根除灌溉用水中含有的P．ramorum菌株。WerresS等設立了一個水再循環模擬系統，用2a的時間研究P．ramorum在不同季節水中的存活率與感染率［41］。容器育苗的苗圃把容器里的再循環水作為灌溉用水，研究病原菌在水中的傳染病學是非常重要的，這項研究可以了解P．ramorum在水中可能的傳播方式。UferT等在德國做了3種類型的過濾實驗:慢砂濾池法、熔巖過濾法、人工濕地法，結果表明，前兩種方法可以完全濾除P．ramorum菌株，人工濕地法仍有37%的水樣含有病原菌［42］。

5．2．3土壤滅菌

盡管P．ramorum在土壤中的存活時間還沒有確定，但是掌握病原菌在苗圃土壤里的分布并對侵染區隔離治理卻十分必要。大量的化學藥劑(三氯硝基甲烷、甲胺磷、碘甲烷和棉隆)篩選試驗表明，當受侵染的土壤放入玻璃容器時，所有藥品都是有效的。棉隆煙熏法14d可以根除自然環境下苗圃土壤剖面的病原菌［43］。蒸汽消毒和日曬等其它的土壤滅菌法也在研究中。對苗圃內防治P．ramorum的研究已經從個體植株擴展到苗圃環境、病原菌隨植株跨州乃至跨國傳播等領域。鑒于該病菌的危害和傳播途徑，對于地區與國家之間的觀賞植物貿易往來，一定要建立一個穩定健全的檢驗檢疫機制。

6問題與討論

直到現在，對P．ramorum起源的地理中心仍然不清楚。有學者認為起源于美國本土［44－45］，但更多的學者傾向于源自中國云南、喜馬拉雅山脈的東部或者臺灣［46］。另外，因為每個國家或地區的自然條件不同，各國尚未建立一套對P．ramorum成熟、穩定的檢測方法。美國和歐盟已經制定出P．ramorum的檢疫標準，但隨著對病原菌研究的深入，這些標準一直在調整之中，而且在許多方面有差異。

P．ramorum的寄主十分廣泛，對針、闊葉樹，喬、灌木，成熟林或苗木，都可侵染危害。迄今為止，在自然界被P．ramorum侵染并通過柯赫氏法則(Koch’sPostulates)證明的寄主植物有45種，有82種相關寄主植物是在自然界發病、經分離培養或PCR分子技術檢測到P．ramorum，但未通過柯赫氏法則證明，還有許多植物已通過人工接種試驗發病［47］。中國幅員遼闊，樹種繁多，多數寄主植物都有分布。鑒于P．ramorum傳入、定殖以及擴散的風險性相當大，每個國家和地區都要做好相應的檢疫及防范措施，加大科研投入，以有效控制該病原菌對全世界造成的危害。