西瓜炭疽病菌特征與藥劑毒性測(cè)定
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本文作者：周文靜1,2范鴻雁2,3何凡2,3王運(yùn)勤2,3作者單位：1.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶果樹(shù)研究所
實(shí)驗(yàn)方法
1菌餅的制備。病原菌于PDA平板活化，28℃恒溫培養(yǎng)3d后用直徑5mm的打孔器沿菌落邊緣打取菌餅。
2孢子懸浮液的制備。用5ml滅菌水洗脫培養(yǎng)6d的病菌平板，制成濃度為10×40倍鏡視野下20～30個(gè)孢子的懸浮液。
（1）不同培養(yǎng)基對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。參試培養(yǎng)基包括PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、PDA+1‰酵母培養(yǎng)基、PSA+1‰酵母培養(yǎng)基、西瓜肉榨汁培養(yǎng)基、西瓜皮榨汁培養(yǎng)基、西瓜葉煎汁培養(yǎng)基、V8培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基。將菌餅移入不同培養(yǎng)基平板中央，每處理3次重復(fù)，置于28℃恒溫培養(yǎng)6d。分別于培養(yǎng)3、6d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。
（2）溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響。將接好菌餅的PDA平板分別置于5、10、15、20、25、28、30、35、40℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)和測(cè)量方法參照“1．2．3．1”。用移液槍吸取孢子懸浮液滴于凹玻片上，并置于上述9個(gè)溫度處理保濕培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)6、12h后用1%棉藍(lán)乳酚油固定后鏡檢孢子萌發(fā)率(分生孢子的萌發(fā)以芽管的長(zhǎng)度超過(guò)分生孢子直徑長(zhǎng)度的50%為標(biāo)準(zhǔn))，每次檢查孢子300個(gè)，每處理3次重復(fù)。
（3）pH對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響。用1mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共10個(gè)處理，接菌餅于不同pH的PDA平板中央，培養(yǎng)和測(cè)量方法參照“1．2．3．1”。將孢子懸浮液調(diào)節(jié)成上述10個(gè)pH處理，培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法參照“1．2．3．2”。
（4）光照對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。將接好菌餅的PDA平板置于連續(xù)光照、光/暗交替和連續(xù)黑暗3種光照條件下，培養(yǎng)和測(cè)量方法參照“1．2．3．1”。
（5）孢子致死溫度的測(cè)定。用移液槍吸取1ml孢子懸浮液于無(wú)菌試管內(nèi)，分別置于40、45、50、55℃恒溫水浴鍋中，每處理分別保持5、10min后取出迅速冰浴，將各處理的孢子懸浮液滴加于凹玻片上，培養(yǎng)和計(jì)數(shù)方法參照“1．2．3．2”。
（6）碳源和氮源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Czapek培養(yǎng)基)［3］，分別用木糖、果糖、麥芽糖、阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、淀粉8種碳源等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖;分別用硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、尿素6種氮源等量替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉。將菌餅接種于不同碳源、氮源培養(yǎng)基平板中央，以滅菌水為對(duì)照。培養(yǎng)和測(cè)量方法參照“1．2．3．1”。
4殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定。每種藥劑各選取5個(gè)濃度梯度。無(wú)菌條件下用滅菌水配制所需濃度梯度藥液的50倍，PDA培養(yǎng)基溫度降至50℃左右，用移液槍吸取不同濃度梯度的藥液1ml加入到49ml的培養(yǎng)基中，充分混合均勻后倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，制成不同濃度梯度的含藥PDA平板，待凝固后接菌餅于平板中央，置于28℃恒溫培養(yǎng)，每處理3個(gè)平板，以不含藥的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。培養(yǎng)6d后用十字交叉法測(cè)量各處理菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑菌率。
5數(shù)據(jù)處理。采用DPSv7．55軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。
結(jié)果與分析
1西瓜炭疽病菌的生物學(xué)特性
（1）不同培養(yǎng)基對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。參試的11種培養(yǎng)基中，病菌菌絲在西瓜葉煎汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，培養(yǎng)3和6d后菌落平均直徑分別為4．08和6．58cm;菌絲在西瓜肉榨汁和V8培養(yǎng)基中生長(zhǎng)也較好，培養(yǎng)6d的菌落平均直徑分別為6．33和6．30cm;其次為PDA培養(yǎng)基、西瓜皮榨汁培養(yǎng)基、PDA+1‰酵母培養(yǎng)基、PSA+1‰酵母和PSA培養(yǎng)基;菌絲在玉米、胡蘿卜培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較差，培養(yǎng)6d的菌落平均直徑分別為5．40和5．36cm;菌絲在燕麥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，培養(yǎng)3和6d的菌落平均直徑分別僅為3．38和5．31cm(圖1)。
（2）溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響。在PDA平板上，病菌菌絲在10～35℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，但在不同溫度條件下菌絲生長(zhǎng)差異變化很大。隨著溫度升高，菌絲生長(zhǎng)速度加快，以28℃最利于菌絲生長(zhǎng)，其病菌培養(yǎng)3、6d后菌落平均直徑分別為4．15和6．31cm，極顯著優(yōu)于其他處理溫度;當(dāng)溫度低于15℃或高于30℃時(shí)則不利于病菌菌絲生長(zhǎng);當(dāng)溫度低于5℃或高于40℃時(shí)病菌菌絲停止生長(zhǎng)(圖2)。病菌孢子在10～40℃條件下均可萌發(fā)，其中當(dāng)溫度低于5℃時(shí)分生孢子不能萌發(fā)，隨著溫度升高，孢子萌發(fā)率也隨之升高，以28和30℃為孢子適宜萌發(fā)溫度，培養(yǎng)12h后其萌發(fā)率分別為89%和92%，而當(dāng)溫度高于30℃時(shí)孢子萌發(fā)率明顯降低(圖3)。
（3）pH對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響。病菌菌絲在pH為3～12時(shí)均能生長(zhǎng)，當(dāng)pH小于4時(shí)菌絲生長(zhǎng)明顯受到抑制，pH在7～9時(shí)最適宜病菌菌絲生長(zhǎng)，但pH為5～12時(shí)菌絲生長(zhǎng)差別不明顯(圖4)。病原分生孢子在pH為3～12時(shí)均能萌發(fā)，分生孢子最適萌發(fā)pH為6～8，其分生孢子培養(yǎng)12h后的萌發(fā)率分別為91%、92%和91%，pH較高或較低均不利于孢子萌發(fā)(圖5)。
（4）光照條件對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。在不同光照條件下病菌均能生長(zhǎng)，其中連續(xù)黑暗條件最利于菌絲生長(zhǎng)，培養(yǎng)3、6d后菌落平均直徑分別為4．06和7．10cm;其次為光暗交替條件，培養(yǎng)3、6d后菌落平均直徑分別為3．45和6．38cm;連續(xù)光照條件下菌落生長(zhǎng)最慢，培養(yǎng)3、6d后菌落平均直徑分別為3．03和6．08cm。
（5）病原孢子的致死溫度。分生孢子經(jīng)55℃水浴處理5min后，再經(jīng)凹玻片保濕培養(yǎng)48h仍不能萌發(fā)，孢子喪失活力。因此，確定病原孢子致死溫度為55℃水浴處理5min。
（6）碳源和氮源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。在參試碳源中，麥芽糖、阿拉伯糖和葡萄糖作為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基較適合病菌菌絲生長(zhǎng)，而在以木糖、乳糖和可溶性淀粉為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較差(表1)。在參試氮源中，病菌菌絲在含酵母浸粉、牛肉浸膏和蛋白胨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，而以硫酸銨、硝酸銨和尿素為氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基則不利于菌絲生長(zhǎng)(表2)。
2不同殺菌劑對(duì)西瓜炭疽病菌的室內(nèi)毒力
各供試藥劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與生長(zhǎng)抑制幾率值之間均表現(xiàn)為直線相關(guān)，回歸達(dá)到顯著水平(P＜0．05)。12種供試藥劑對(duì)西瓜炭疽病菌均有抑制作用，不同藥劑的抑菌效果存在差異。32．5%苯甲嘧菌酯SC、50%咪鮮胺錳鹽WP和10%苯醚甲環(huán)唑WG對(duì)西瓜炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)均有很好的抑制效果，其EC50分別為0．0180、0．0602、0．4715μg/ml;其次為25%溴菌腈WP、25%吡唑嘧菌酯EC、40%福•福鋅WP和75%百菌清WP，其EC50在15．4681～83．5292μg/ml;20%腈菌唑ME、50%醚菌酯WG、80%代森錳鋅效果較差，其EC50在127．5780～213．2863μg/ml;而50%多菌靈WP和70%甲基硫菌靈WP的抑菌效果明顯低于其他10種藥劑，其EC50分別高達(dá)3495．3852和8286．8753μg/ml(表3)。
結(jié)論與討論
(1)對(duì)西瓜炭疽病菌的生物學(xué)特性研究表明，西瓜炭疽病菌菌絲在西瓜葉煎汁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，在西瓜肉榨汁及V8培養(yǎng)基上生長(zhǎng)也較好。菌絲在10～35℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，以28℃最適合菌絲生長(zhǎng)，孢子萌發(fā)的最適溫度為30℃，這與王漢榮等［6］對(duì)浙江省長(zhǎng)瓜炭疽病病菌生物學(xué)特性研究所得結(jié)論“菌絲最適生長(zhǎng)溫度為25℃，孢子萌發(fā)最適溫度為25℃”有差異。菌絲在pH為3～12時(shí)均能生長(zhǎng)，以pH為7～9最適合菌絲生長(zhǎng)，孢子萌發(fā)的最適pH為6～8。病菌菌絲在連續(xù)黑暗條件下菌落生長(zhǎng)最快。病菌分生孢子致死溫度為55℃處理5min。在供試碳源中，病菌菌絲在含有麥芽糖、阿拉伯糖和葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好;在供試氮源中，病菌菌絲含酵母浸粉、牛肉浸膏和蛋白胨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好。筆者認(rèn)為溫度過(guò)高或過(guò)低、酸性環(huán)境都會(huì)影響菌絲生長(zhǎng)和分生孢子的萌發(fā)，且不同的碳源、氮源亦會(huì)影響病菌菌絲的生長(zhǎng)。了解西瓜炭疽病菌的生物學(xué)特性，對(duì)預(yù)防該病的發(fā)生具有指導(dǎo)作用。
(2)筆者不僅選用西瓜生產(chǎn)上常規(guī)藥劑，還選用一些新型殺菌劑，進(jìn)行了西瓜炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定。結(jié)果表明，在參試藥劑中32．5%苯甲嘧菌酯SC、50%咪鮮胺錳鹽WP、10%苯醚甲環(huán)唑WG均表現(xiàn)出很好的抑菌效果，為進(jìn)一步田間防治西瓜炭疽病提供了參考;但50%多菌靈WP、70%甲基硫菌靈WP的EC50分別高達(dá)3495．3852、8286．8753μg/ml，這與胡育海等［7］的研究結(jié)論“50%多菌靈WP和70%甲基硫菌靈WP對(duì)西瓜炭疽病菌的室內(nèi)EC50分別為1．7510和62．3213μg/ml”有較大差異。試驗(yàn)中，多菌靈等苯并咪唑類(lèi)藥劑多次室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果皆不理想，分析可能原因有:①多菌靈、甲基硫菌靈等苯并咪唑類(lèi)藥劑作為常規(guī)殺菌劑，長(zhǎng)期大量使用，易產(chǎn)生交互抗性［8］;②海南地區(qū)由于病害種類(lèi)多且高溫高濕環(huán)境利于病害的高頻率發(fā)生，因而較頻繁地施用廣譜、效果較好、價(jià)格低廉的該類(lèi)藥劑，如海南省分離得到的芒果炭疽病菌中已出現(xiàn)對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑有較高抗性的菌株［9－10］。
(3)由于得天獨(dú)厚的地理及氣候優(yōu)勢(shì)，海南省已成為我國(guó)新興的商品西瓜產(chǎn)區(qū)之一及反季節(jié)西瓜生產(chǎn)基地，具有十分顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。然而，西瓜炭疽病的流行趨勢(shì)日益嚴(yán)重，在生產(chǎn)和運(yùn)輸上造成的危害和損失不容忽視。該研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展的西瓜炭疽病田間藥效試驗(yàn)提供了理論依據(jù)。
