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本文作者：向妮1,2段燦星1肖炎農2王曉鳴1朱振東1作者單位：1.中國農業科學院作物科學研究所/國家農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程2.華中農業大學植物科技學院

0引言

【研究意義】豌豆是僅次于普通菜豆的第二大食用豆類作物，作為糧食、蔬菜或飼料來源廣泛種植于世界各地[1-2]。在豌豆生產中病蟲害的發生是影響豌豆產量和品質的主要因素。目前已報道有數十種病原菌可以侵染豌豆，其中由茄鐮孢豌豆專化型引起的鐮孢根腐病是最重要的病害之一[3]。茄鐮孢豌豆專化型是一種頑固性的土傳病原菌，豌豆種子萌發后就開始侵染子葉附著區、上胚軸、下胚軸和較上部位的主根。隨后，侵染向上擴展到地面，向下擴展到根系，產生紅褐色到黑色條紋病斑，隨著時間的推移病斑合并，根部維管束變紅褐色，導致植株矮化、發黃和基部葉片壞死[3]。鐮孢菌根腐病一般導致30%—57%的豌豆產量損失，嚴重發生的地塊減產可達60%以上[4-6]。豌豆在中國有2000多年的種植歷史，全國范圍均有種植，其中西北和西南地區是干籽粒豌豆主要產區，豌豆是這些地區的主要栽培作物之一[7-8]。

在中國，由鐮孢菌引起的豌豆根腐病最早記載于20世紀50年代[9]，目前該病已在全國范圍內普遍發生，特別是在甘肅、寧夏豌豆主產區危害嚴重，導致豌豆栽培面積大幅度減少[10-14]。

【前人研究進展】防治豌豆根腐病的有效途徑是利用抗病或耐病品種[10,15-17]。抗病或耐病品種的成功選育有賴于對病原菌群體結構的了解。國外的大量研究表明，在農田系統中豌豆鐮孢根腐病菌茄鐮孢豌豆專化型存在極大的自然變異，并形成了復雜的致病基因型[18]。茄鐮孢豌豆專化型對豌豆的專化致病性由豌豆致病基因（PEP）所控制。在茄鐮孢豌豆專化型的一個超數染色體上存在一個豌豆致病基因簇，迄今在這個基因簇上鑒定了6個豌豆致病基因（PDA、PEP1、PEP2、PEP3、PEP4和PEP5）[19-21]。在這6個豌豆致病基因中，PDA基因家族編碼細胞色素P-450單加氧酶[19]，該酶能夠降解豌豆產生的植物保衛素豌豆素（pisatin），降低其活性，因此又稱作豌豆素去甲基化酶（PDA）[22-26]。所有自然發生的不含PDA的NectriahaematococcaVI（F.solani）分離物一般對豌豆都不具有致病性。因此，PDA是茄鐮孢豌豆專化型對豌豆致病性的決定基因[22,27]。幾個PEP的功能目前還不清楚，但是它們在基因簇上的存在可以提高病原菌分離物對豌豆的毒力水平[21,28]。最近，Etebu等[18]基于PEP基因簇基因的序列建立了檢測PDA、PEP1、PEP3和PEP5的特異性PCR標記，用于快速檢測土壤中茄鐮孢豌豆專化型及其致病基因的多樣性水平，并建立了土壤中茄鐮孢豌豆專化型分子定量檢測和病害流行預測的方法[4,29]。【本研究切入點】迄今，中國對豌豆根腐病研究很少，主要局限在病害的描述和病原菌分離鑒定，雖然在抗病品種的選育上取得一定進展，但是抗病育種工作完全是在自然發病的壓力下進行抗性選擇[10]。為了有效地開展抗病品種的選育，有必要對中國不同地區茄鐮孢豌豆專化型種群進行深入了解。【擬解決的關鍵問題】本研究對中國10多個省（市）豌豆鐮孢根腐病菌進行分離鑒定、致病力測定和致病基因檢測，以便了解病原菌毒力及致病基因的多樣性水平，為有效開展豌豆抗病育種提供理論支持。

1材料與方法

試驗于2009年6月至2011年4月在中國農業科學院作物科學研究所完成。

1.1試驗材料

豌豆鐮孢根腐病植株及土壤樣品為2009—2010年分別從甘肅、河北、寧夏、云省、福建、內蒙古、吉林、四川、安徽、青海和北京11個省（市、自治區）豌豆生產田采集。豌豆品種“草原27”由青海大學提供。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌分離

植株病樣用常規組織分離法分離病原菌。取約5mm2的病組織，用2%的NaClO表面消毒2min，無菌水漂洗3次后，轉入酸化的PDA培養基上，25℃培養，待菌落長出后，挑取菌落前緣菌絲至PDA培養基上，25℃培養。根據菌落特征和分生孢子的形態，參考Nelson等[30]方法初步進行鐮孢菌分離物的鑒定。對疑似鐮孢菌分離物進行單孢分離，獲得單孢分離物。

土壤樣品過篩后，取適量裝入直徑為10cm的塑料缽中，播種豌豆品種“草原27”，每缽5粒，蓋上適量土樣后，置于溫室培養，必要時輔以光照和澆水。植株發病后，采用上述組織分離方法分離病原菌，對疑似鐮孢菌分離物進行單孢分離。

1.2.2豌豆鐮孢根腐病菌分子及形態學鑒定

將疑似鐮孢菌分離物在鋪有滅菌玻璃紙的PDA培養基平板上25℃培養5—7d，收集菌絲后用CTAB法提取基因組DNA[31]。用茄鐮孢種特異性引物（ITS1-F(F)/AFP346(R)：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′/5′-GGTATGTTCACAGGGTTGATG-3′）對分離物基因組DNA進行PCR擴增[32]。反應體系為20μL，包括2μL10×PCRbuffer（200mmol•L-1Tris-HCl，200mmol•L-1KCl，15mmol•L-1MgCl2），1μL10mmol•L-1dNTP，上、下游引物（2μmol•L-1）各2μL，Taq酶1.25U，模板DNA20ng，水補足20μL。PCR反應擴增程序：94℃預變性5min，94℃變性1min，引物60℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環，最后72℃延伸10min。PCR擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，Gelred染色后成像系統下觀察擴增結果。將分子鑒定為茄鐮孢的分離物分別接種到PDA和CLA培養基上[33]，在25℃培養3—7d后觀察其小型分生孢子、大型分生孢子以及分生孢子梗的形態[34-36]。

1.2.3豌豆鐮孢根腐病菌致病力測定致病力測定

參照Temporini等[21]的方法進行，并略作修改。將豌豆品種“草原27”播種于裝有適量滅菌砂的直徑為10cm塑料缽中，每缽5粒種子，溫度控制在25℃左右，必要時輔以光照和澆水。播種后12d幼苗用于接種。將鑒定為茄鐮孢豌豆專化型的分離物接種在PDA培養基上，25℃培養7d后，用直徑為5mm的打孔器從菌落邊緣打取菌絲塊；用無菌注射器針頭在植株幼苗莖基部扎一傷口，將菌絲塊菌面朝下貼在傷口上。每個分離物接種5個植株，以接種PDA培養基的植株作為對照。接種后植株在25℃下保濕48h，然后轉入溫室培養，接種6d后調查結果并記載病斑長度。致病力評價采用Temporini等[21]的標準，病斑長度＜6cm為弱致病力，6cm≤病斑長度≤8cm為中等致病力，病斑長度＞8cm為強致病力。

1.2.4豌豆鐮孢根腐病菌致病基因檢測

茄鐮孢豌豆專化型的分離物基因組DNA提取方法同上。利用PDA、PEP1、PEP3、PEP5等4個致病基因特異性檢測引物對分離物基因組DNA進行PCR擴增，引物信息詳見表1[18]。PCR反應體系為20μL，包括2μL10×PCRbuffer（200mmol•L-1Tris-HCl，200mmol•L-1KCl，15mmol•L-1MgCl2），1μL10mmol•L-1dNTP，上、下游引物（2μmol•L-1）各2μL，Taq酶1.25U（TianGen－12.5U•μL-1），模板DNA20ng，水補足20μL。PCR反應擴增程序如下：PDA和PEP3為95℃預變性5min，94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，最后72℃延伸10min。PEP1和PEP5為95℃預變性5min，94℃變性45s，55℃1min，72℃30s，5個循環之后，94℃變性30s，55℃退火45s，72℃30s，30個循環后72℃延伸10min。PCR擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，Gelred染色后成像系統下觀察擴增結果。

2結果

2.1病原菌分離和鑒定

共分離得到203個疑似鐮孢菌分離物。根據大型分生孢子及菌落特征初步確定150個分離物疑似茄鐮孢。利用茄鐮孢特異性引物對這150個分離物進行PCR鑒定，有120個分離物擴增出約100bp的茄鐮孢特異性單一條帶，確定這些分離物為茄鐮孢。對120個茄鐮孢分離物進一步進行形態學鑒定。結果表明，有96個分離物與Jung等[36]描述的茄鐮孢豌豆專化型分離物的基本形態一致。在PDA培養基上這些分離物產生藍綠色到淺黃色分生孢子座；小型分生孢子稀少，單胞，卵圓形或橢圓形。在CLA培養基上會形成多分枝的分生孢子梗，大型分生孢子成簇聚集，大型分生孢子腳細胞圓鈍而厚，多為3個隔，寬度小于5μm，屬于B型[34]。在PDA培養基上有厚垣孢子產生，產生于菌絲的末端或側枝。

2.2致病力測定

96個茄鐮孢分離物接種豌豆幼苗莖稈進行致病性測定。所有分離物對豌豆品種“草原27”都致病，在接種部位產生褐色病斑，并不同程度的向莖稈上下擴增。結合形態學、分子特征及致病性的結果，96個茄鐮孢分離物被鑒定為茄鐮孢豌豆專化型。根據病斑大小將96個分離物分為強、中等和弱致病力3種類型[21]。結果表明，有78個分離物為強致病力類型，占分離物總數的81.3%，10個分離物致病力中等，占10.4%，僅有8個分離物具弱致病力，占8.3%（表2）。河北、寧夏、甘肅、云南、四川、安徽、北京和內蒙古等地分離物的主要為強致病力類型（50%—100%），福建和青海分離物以中等致病力和弱致病力為主（表3）。

2.3致病基因PCR檢測

用PDA、PEP1、PEP3和PEP5等4個致病基因的特異性引物分別對96個茄鐮孢豌豆專化型分離物基因組DNA進行擴增（表2，圖）。在96個分離物中，含PDA有89個，占分離物總數的92.7%，有92個分離物含有PEP1，占95.8%，含PEP3分離物有91個，占94.8%，只有44個分離物含有PEP5，占45.8%。96個分離物共產生10個基因型，分別為PDA+PEP1+PEP3+PEP5（A型）、PDA+PEP1+PEP3（B型）、PDA+PEP3+PEP5（C型）、PDA+PEP1（D型）、PDA+PEP3（E型）、PEP1+PEP3（F型）、PEP1+PEP5（G型）、PEP1（H型）、PEP3（I型）和PEP5（J型）。基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J所含分離物數分別為41、45、1、1、2、1、1、2、1和1個，各占分離物總數的43.0%、47.0%、1.0%、1.0%、2.0%、1.0%、1.0%、2.0%、1.0%、1.0%；其中含有4個（A型）和3個（B、C型）致病基因的分離物數量約占總數的91%，這些分離物主要來源于安徽、北京、河北、內蒙、寧夏、甘肅、青海、四川等。含不同致病基因的分離物其致病力也不同，含有4個或3個致病基因分離物的致病力普遍強，而含有2個或1個致病基因分離物的致病力普遍較弱。此外，含有PDA的分離物（A、B、C、D和E型等）致病力普遍較強；不含PDA（F、G、H、I和J型）的分離物致病力較弱（表2）。

3討論

豌豆根腐病長期以來一直是阻礙中國豌豆生產的主要因素之一。然而，豌豆在中國是一種小作物，病害問題很少被重視。20世紀80年代末以來，一些研究者對青海、甘肅和福建省等一些地區的豌豆根腐病病原菌進行了鑒定，發現引起豌豆根腐病的病原菌有茄鐮孢、豌豆絲囊霉、鏈孢粘帚霉、尖孢鐮、根串珠霉、立枯絲核菌、終極腐霉和殼二孢菌、絲葚霉等，其中多數報道認為茄鐮孢是引起豌豆根腐病的主要病原菌[6,11-14]。本研究對不同地區來源的豌豆根腐病菌進行了分離鑒定，發現約60%的分離物為茄鐮孢（未發表數據），通過系統地對分離物進行形態學、致病性及分子特征鑒定，首次在國內明確引起豌豆根腐病菌的茄鐮孢為豌豆專化性。通過致病力測定發現，茄鐮孢豌豆專化型分離物間致病力存在差異，但絕大多數分離物為強致病力類型，這些分離物分布在寧夏、甘肅、內蒙古、云南、四川等地，這一結果與這些地區豌豆根腐病嚴重發生相一致。西北及西南地區是中國干籽粒豌豆的主要生產區，但是豌豆主要種植在干旱的坡地，土壤肥力較差，且連年種植，這些條件有利于鐮孢菌根腐病的嚴重發生[3]。

在農田系統中，自然發生的茄鐮孢豌豆專化型存在豐富的毒力變異。茄鐮孢豌豆專化型對豌豆的專化性致病性及致病力水平依賴于致病基因的存在和數量[18,37]。利用Etebu等[18]開發的特異性引物，筆者檢測了中國不同地理來源的96個茄鐮孢豌豆專化型分離物致病基因，發現有92.7%、95.8%、94.8%和45.8%分離物分別含有PDA、PEP1、PEP3和PEP5。根據這4個基因在每一個分離物中的存在與否，96個分離物共產生10個基因組合，即基因型（或單倍型），其中含PDA+PEP1+PEP3+PEP5基因組合（A型）和PDA+PEP1+PEP3基因組合（B型）的分離物分別占總數的43.0%和47.0%，這些分離物分布在安徽、北京、河北、內蒙、寧夏、甘肅、青海、四川，表明中國茄鐮孢豌豆專化型存在致病基因多樣性的同時，致病基因型趨于單一。

在茄鐮孢豌豆專化型中，不同致病基因存在與否和（或）不同致病基因組合決定每一個分離物對豌豆的致病力水平。Etebu等[18]利用開發的特異性PCR引物對15個茄鐮孢豌豆專化型毒力不同的分離物所含PDA、PEP1、PEP3和PEP5致病基因進行檢測，發現缺乏PDA的分離物對豌豆不致病或致病力弱，4個基因組合分離物具有強的致病力，其結果支持PDA是茄鐮孢豌豆專化型對豌豆致病性的關鍵基因，PEP1、PEP3和PEP5能夠加強茄鐮孢豌豆專化型的致病力。

本研究結果與Etebu等[18]的基本一致，但也出現了少數例外，如含有PDA、PEP1和PEP3致病基因組合的BJ-4、NM-7和AH-17為3個致病力最強的分離物，分別含有PDA、PEP1、PEP3和PEP5或PDA、PEP1和PEP3致病基因組合AH-15、DX-1和AH-1為弱致病力分離物。

含有PDA、PEP1和PEP3致病基因組合的分離物具有最強致病力的可能原因是這些分離物可能還含有PEP2和PEP4，或存在其它的致病機制。PEP2與PDA、PEP1、PEP5一樣能夠獨立地使缺乏超數染色體的N.haematococca的非致病菌株產生對豌豆的致病性，是N.haematococca豌豆致病力的決定因子[20,38-39]。Etebu等[37]最新研究表明含有PDA、PEP1和PEP4基因組合的分離物也具有強的致病力。此外，N.haematococcaMPVI還存在一種對豌豆素的忍耐機制，稱作對豌豆素非降解性忍耐，即產生一個專化性ATP結合性組件轉運蛋白NhABC1提高其對豌豆素的忍耐[40]。

含有PDA的茄鐮孢豌豆專化型分離物對豌豆只具有弱或中等致病力已有報道[21]。迄今，通過遺傳研究已經鑒定了9個PDA基因PDA-1、PDA-2、PDA2、PDA3、PDA4、PDA5、PDA6-1、PDA6-2、PDA7，但是只有能夠快速誘導Pda活性的基因PDA-1、PDA-2、PDA4、PDA5與對豌豆的致病力有關[26,41]。因此，根據含有PDA基因PDA-、PDAL和PDAH的不同，可以將茄鐮孢豌豆專化型鑒定為3種表現型，第1類缺乏解毒豌豆素的能力（PDA-），第2類長時間豌豆素誘導后產生低水平的豌豆素脫甲基化酶（PDAL），第3類豌豆素快速誘導中到高水平的脫甲基化酶產生（PDAH）[22,24,42-43]。PDA具有高度的序列同源性[25,44-45]，應用PDA特異性分子標記，可以有效的檢測出PDA的存在，但是不能有效的區分這些基因類型[18]。因此，筆者推測本研究中分別含有PDA、PEP1、PEP3和PEP5或PDA、PEP1和PEP3致病基因組合的弱致病力分離物AH-15、DX-1和AH-1所含有的PDA為PDAL類型，然而，確切結果必須對PCR產物測序和進行同源性比較才能夠獲得。

4結論

通過形態學、致病性和分子特征研究確定引起中國豌豆鐮孢根腐病的病原菌為茄鐮孢豌豆專化型。強致病力分離物為豌豆主要生產區的優勢種群。致病基因檢測發現中國茄鐮孢豌豆專化型分離物存在10種不同致病基因型，其中含有4個基因組合和3個基因組合的分離物約占91%，這些分離物絕大多數具有強致病力（87.4%）或中等致病力（9.2%），不含PDA的分離物基本上都是弱致病力類型，表明致病基因的種類與數量決定茄鐮孢豌豆專化型分離物的致病力水平。