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本文作者：劉國琴1，2鄭鵬華1滕元文1作者單位：1浙江大學園藝系2貴州大學農學院

水分代謝相關基因

果樹體內水分的轉運和存在狀態(tài)對果樹芽休眠產生明顯影響，休眠的誘導和解除過程中伴隨著束縛水和自由水之間的相互轉換[41-42]。在梅[17]、桃[37]、歐洲葡萄[43]等植物中均發(fā)現脫水蛋白基因，可能與休眠有關。脫水素是LEA蛋白的一種，在低溫和脫水脅迫時誘導合成，具有較高的親水性，可能起到束縛水的作用[44]。Pacey-Miller等[43]發(fā)現葡萄在萌芽的過程中，脫水素總體呈下降趨勢，但在芽膨大前有2個小高峰。Yamane等[17]研究發(fā)現對不同需冷量梅品種而言，花芽脫水素基因的表達量不同，高需冷量品種‘Nanko’比低需冷量品種‘Ellching’的表達量高。水通道蛋白又名水孔蛋白，是一種位于細胞膜上的蛋白質，在細胞膜上組成“孔道”，可控制水分在細胞的進出，從而對水分的轉運和平衡起重要的調控作用。根據亞細胞定位，高等植物的水通道蛋白主要分為質膜內在蛋白和液泡膜內在蛋白2大類，都屬于內在蛋白家族成員。其中TIP又分為α、β、γ、δ-TIP4大類。Mazzitelli等[16]研究發(fā)現樹莓休眠向生長階段轉變過程中AQP下調表達。Mathiason等[45]報道在滿足葡萄需冷量期間PIP被誘導。Yooyongwech等[46-47]發(fā)現AQP基因與桃的休眠相關，并且PIP和TIP的表達模式和可能的作用不同。2個需冷量不同的品種在內休眠解除時δTIP1和PIP2表達量上調，而γTIP1和PIP1在高需冷量品種‘KansukeHakuto’中的表達量要比低需冷量品種‘Coral’高，Yooyongwech等[47]認為γTIP1和PIP1可能對細胞內和胞間水分的轉運起到重要的調控作用，增加其抗冷性和防止冰晶的形成，而δTIP1和PIP2可能作為內休眠解除的信號。AQP的過量表達能提高歐洲板栗芽的含水量[21]。這些都說明了AQP基因對于果樹在休眠期間細胞內和胞間水分的轉運起到重要的調控作用。

能量與物質代謝相關基因

落葉果樹芽進入休眠后，樹體內只進行基本的生理生化活動，新陳代謝弱，其中呼吸代謝的持續(xù)進行是休眠過程的顯著特點，涉及到不同類型呼吸的代謝途徑、呼吸代謝物質和能量的轉變[2，8，12，48]。腺苷三磷酸水解酶（ATPase）是植物生命活動的“主宰酶”，對植物的許多生命活動起著重要的調控作用，酶活性的改變影響膜系統對物質的運輸能力。現已發(fā)現該酶對休眠起著調控作用[8，12，16，43，49]。桃在休眠開始時，芽中的ATPase活性低于芽下組織（budstands），但隨著休眠的逐步加深，芽中的ATPase活性逐漸增加，并高于芽下組織，萌發(fā)時，芽和芽下組織ATPase活性達到最高峰[49]；核桃芽中的ATPase活性休眠期間沒有萌發(fā)期高[12]。在桃芽休眠階段，已分離了H+-ATPase家族4個基因成員PPA1、PPA2、PPA3和PPA4，并且發(fā)現這4個成員對休眠的調控作用不同，認為該基因的調控可能參與糖類物質的共轉運，PPA1、PPA2、PPA3在休眠解除后的芽中上調表達，可能有利于內休眠的解除，而PPA4則下調表達[49]。Pacey-Miller等[43]報道了葡萄休眠期能量代謝有關的基因所占的比例高達17%。Mazzitelli等[16]認為在休眠解除時，樹莓芽分生組織需要從別的組織獲取大量的糖類物質，來維持芽的生長，而此時H+-ATPase的基因上調表達，NAD-山梨醇脫氫酶基因下調表達。Mathiason等[45]研究發(fā)現在滿足需冷量的河岸葡萄越冬芽中碳水化合物代謝（32.4%）和能量代謝（18.6%）相關的基因所占的比例就高達51%。檸檬酸合成酶、ATP檸檬酸裂解酶、ATP/ADP轉運體、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和核酮糖1，5-二磷酸羧化酶基因等在滿足需冷量的葡萄越冬芽中下調，與碳水化合物代謝相關的編碼蔗糖合成酶、己糖轉運體、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及異構酶等的基因也下調表達。Mathiason等[45]提出在滿足需冷量期間芽的代謝活性和能量需求是較低的。在黑醋栗休眠過程中，發(fā)現乙酰輔酶A羧化酶基因在休眠期表達低，隨著休眠的解除，表達量逐漸升高[20]。

激素代謝相關基因

激素對果樹芽休眠調控有重要作用，不同激素對果樹芽休眠的誘導和解除的作用不同[2]。ABA、GA、IAA、CTK和乙烯受到不同信號（物理信號和化學信號）的調控，從而起到不同的作用，因此相關激素合成基因與信號響應基因互作控制芽的休眠和生長。在草本植物和一些多年生木本植物上已有關于激素代謝相關基因的報道，馬鈴薯休眠芽中分離了生長素響應因子基因ARF6[50]。牡丹上分離了生長素抑制蛋白基因和赤霉素合成酶基因GA20，發(fā)現ARP在牡丹休眠解除前期的表達量高，在休眠解除后表達量降低，之后又上調[51]。楊樹上發(fā)現了3個與ABA信號轉導有關的基因ABI1B、ABI1D和ABI3[31]。王新超[52]對茶樹芽休眠不同階段的生長素相關基因如生長素響應因子類基因、生長素原初反應類基因、生長素抑制蛋白基因、生長素誘導基因、生長素運輸類基因、生長素結合類基因等進行了研究，結果初步說明生長素促進茶樹腋芽的休眠，其中生長素響應因子類基因和生長素原初反應類基因與茶樹芽休眠與解除存在復雜的關系，還有待于進一步的研究證明。Mazzitelli等[16]在樹莓上也發(fā)現與休眠相關的基因，生長素響應蛋白、ABA誘導蛋白和赤霉素調控等基因，ABA誘導蛋白基因在休眠轉換期間下調。Pacey-Miller等[43]報道了歐洲葡萄休眠過程中生長素誘導蛋白基因的表達在芽開始膨大前2周上調，然后表達下降。Mathiason等[45]發(fā)現河岸葡萄越冬芽中ABA相關基因下調，而GA受體下調。

細胞發(fā)育相關基因

芽休眠的解除就是分生組織的重新生長，分生組織逐漸由休眠向細胞增生轉變，受細胞周期調控[10，53]，細胞周期調控主要受細胞周期蛋白（cyclin，CYC）和細胞周期蛋白依賴激酶的調控。這些調控基因包括CYCA、CYCB、CYCD和CDKB等，均已在多種植物上克隆和分離出來，且多呈現出休眠期表達低，休眠解除后表達高的變化趨勢[52，54-56]。Watillon等[57]從蘋果中分離了類KN1基因，分別命名為KNAP1和KNAP2基因。Brunel等[58]研究報道KNAP2基因的表達與蘋果芽的生長潛力負相關，且KNAP2表達與芽所處的位置變化很大，枝條頂部的芽總是比枝條中部和基部的芽的表達低，而枝條中部和基部的芽在生長期間仍保持休眠。Mathiason等[45]研究發(fā)現在滿足需冷量的葡萄越冬芽中與細胞發(fā)育相關的基因所占的比例達1.4%，且涉及細胞信號和細胞生長的基因被激活，與細胞分裂和生長相關的肌動蛋白、細胞壁松弛蛋白、亞精胺合成酶和植物磺肽素基因均上調，通過細胞的分裂、細胞的伸長和細胞的松弛有助于芽生長。

活性氧代謝相關基因

果樹在休眠期間活性氧代謝發(fā)生了變化，休眠期間不同的樹種活性氧種類和抗氧化酶的種類和活性不盡相同[16，43，59-60]。Pacey-Miller等[43]報道了葡萄休眠芽中活性氧代謝相關的基因Cu/Zn超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽硫轉移酶、谷胱甘肽還原酶和過氧化氫酶基因表達高。Mazzitelli等[16]在樹莓上也發(fā)現編碼抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽硫轉移酶和谷胱甘肽還原酶基因在休眠解除時表達上調。Pérez等[61]報道低溫增加葡萄過氧化物酶基因的表達。

DAM基因

MADS-box是在轉錄因子家族中發(fā)現的一種高度保守的基序，MADS-box基因是一類調節(jié)植物生長發(fā)育的重要基因，涉及到植物生長發(fā)育的許多方面，如植物花器官的發(fā)育、物質和能量代謝、信號的傳遞和轉導以及休眠等過程[18，62-65]。MADS-box基因對果樹芽休眠的作用正逐步被揭示，在不同的果樹如桃、梨、梅和獼猴桃上克隆或分離并進行了表達分析和功能鑒定。Bielenberg等[63]分離了與桃休眠相關的6個MADS-box基因，并把與休眠相關的MADS-box基因稱為DAM基因，分別命名為DAM1、DAM2、DAM3、DAM4、DAM5和DAM6。Li等[66]研究了桃的6個DAM基因有不同的季節(jié)和光周期表達模式，DAM3對光周期沒有反應，可能受低溫的調控，DAM1、DAM2和DAM4在時間上與季節(jié)性的伸長停止和芽的形成有關。Jiménez等[67]在研究桃芽休眠過程時發(fā)現DAM3、DAM5和DAM6在冬季低溫條件下表達下調，而且在不同的品種中有相似的變化趨勢。Leida等[19]用SSH方法鑒定了與桃芽休眠解除相關的特異基因，獲得了101個特異表達的基因，其中就有DAM4、DAM5和DAM6，且發(fā)現DAM6在桃的2個品種上表達模式不同，品種‘Zincal5’DAM6開始下調的時間比‘Springlady’大約要提前1個月。Yamane等[68-69]報道了DAM5和DAM6基因與桃的內休眠有關，2個基因的表達有組織特異性，在田間自然條件下，葉片，莖、側葉芽和側花芽在內休眠期間上調表達，內休眠解除后下調，進行延長低溫處理研究發(fā)現，2個基因的表達與芽的萌芽率呈正相關的關系。Leida等[70]對桃休眠過程中DAM6基因的組蛋白修飾和表達進行了分析，染色質的修飾加強了DAM6基因的表觀遺傳調控和芽休眠的解除。Ubi等[18]從日本梨上克隆了2個與休眠相關的MADS-box基因，分別命名為PpMADS13-1和Pp-MADS13-2，并報道了該基因在2個梨品種的表達情況，在高需冷量品種‘Kosui’中2個DAM基因表現為相同的變化趨勢，隨著內休眠的解除，DAM基因逐漸下調，但PpMADS13-2的表達量比Pp-MADS13-1高。而低需冷量品種‘TP-85-119’中表達量很低，幾乎檢測不到。Yamane等[71]用SSH法篩選出與梅休眠相關的MADS-box基因，命名為PmDAM6，并進行了表達分析，發(fā)現PmDAM6在內休眠開始時表達上調，內休眠解除期間表達下調，認為PmDAM6可能與梅側芽內休眠的誘導和解除有關，在沒有外界抑制條件如頂端優(yōu)勢和惡劣的環(huán)境條件下，即適宜芽萌發(fā)的條件下，PmDAM6可能作為內部抑制基因起到延遲和抑制芽生長的作用，把該基因看成為調控梅側芽休眠的候選基因。Sasaki等[65]并對PmDAM6進行了功能鑒定，過量表達PmDAM6，能抑制楊樹生長。根據梅的基因組，鑒定了6個PmDAMs，并對其進行了季節(jié)表達分析和延長低溫處理，結果表明在內休眠解除之前6個PmDAMs的表達量維持在低水平，而且在短期低溫處理下，PmDAM1和PmDAM6在高需冷量品種表達量有所增加，而低需冷量品種表達量降低，此外，PmDAM1和PmDAM6的表達與內休眠的解除呈負相關。Wu等[72]從美味獼猴桃中分離了4個MADS-box基因，發(fā)現在根、莖、葉、花、芽和果實中的表達量不同。在越冬期間芽中的表達量積累，表明對芽的休眠起作用。在花芽分化前表達量下調，可能作為花阻遏物對花的發(fā)育發(fā)生作用。在擬南芥中進行過量表達和蛋白互作研究發(fā)現只有2個基因能夠與突變體互補，表明獼猴桃的這些基因在芽休眠和開花過程中發(fā)揮不同的作用。總之，這些研究結果表明DAM基因對落葉果樹芽休眠起著重要的調控作用，DAM基因可能是芽休眠因素中最有希望的關鍵因子。今后關于證明DAM基因的遺傳、分子和生化方面在環(huán)境適應性方面的研究領域將是研究的熱點。

展望

落葉果樹芽休眠現象受基因調控網絡調控，很難從單個或幾個基因的作用解釋休眠的本質，必須全面系統地研究多基因的協同作用。為此，今后關于落葉果樹芽休眠的基因調控研究可從以下幾方面開展。1）從研究手段來看，除傳統的實驗方法外，可結合現代基因組學、轉錄組學、蛋白質組學以及代謝組學等手段，綜合利用這些組學的手段來研究落葉果樹芽休眠的誘導、維持和解除的過程。2）從研究內容來看，除在休眠解除的調控方面，還應深入開展休眠誘導、維持階段的基因調控研究。3）落葉果樹芽休眠的基因調控研究不能僅局限在單個或幾個基因的表達模式上，采用多種研究手段，建立芽休眠的基因調控網絡，開展基因的分子功能研究，明確休眠相關的調控基因和結構基因。通過這些方面，從而不斷完善和揭示芽休眠相關基因的途徑及在休眠誘導、維持和解除過程中的協同作用，從本質上揭示這一被稱為“生命的隱蔽現象”。