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本文作者：于華平1程曉建1房經(jīng)貴2宋長年2作者單位：1浙江廣播電視大學(xué)2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

rapd標(biāo)記在果樹種質(zhì)研究中的應(yīng)用

1在種質(zhì)資源起源上的應(yīng)用

我國是果樹的起源中心(多樣化中心或基因中心)之一。許多樹種栽培歷史久遠(yuǎn)，種質(zhì)資源極為豐富，經(jīng)過自然雜交，種質(zhì)相互滲透，種屬間進(jìn)化上具有很大的同源性。利用RAPD標(biāo)記可獲得物種間DNA水平的多態(tài)性資料，了解其主要遺傳物質(zhì)DNA之間的同源程度，從而確定親緣關(guān)系和進(jìn)化地位。Omura等［12］通過RAPD分析發(fā)現(xiàn)溫州蜜柑與日本立花橘間的相似系數(shù)較小，而與我國浙江黃巖本地早的相似系數(shù)較大，從而進(jìn)一步確認(rèn)了溫州蜜柑起源于中國的觀點(diǎn);吉前華等［13］利用RAPD技術(shù)研究了地方優(yōu)良品種貢柑與部分柑橘屬植物之間的親緣關(guān)系，也對貢柑的起源進(jìn)行了初步的探討，支持貢柑是由本地橘和橙的自然雜交而來的觀點(diǎn)，并偏向橘遺傳基礎(chǔ)。親本的確立可以為育種者選配育種親本提供有用的信息。由于許多果樹栽培品種最初從實(shí)生苗而來，父母本不清，RAPD標(biāo)記為親本的確立提供了一種有效手段。Harada等［14］根據(jù)RAPD分析結(jié)果認(rèn)為，喬納金(金冠×紅玉)和陸奧(金冠×印度)2個(gè)三倍體蘋果品種其減數(shù)分裂的2n配子是由金冠提供的，這一結(jié)果與以前的同工酶分析結(jié)果一致。津輕蘋果的父本因當(dāng)時(shí)記載不詳一直不得而知，結(jié)合RFLP和RAPD分析結(jié)果確認(rèn)其父本為紅玉。程中平［15］利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)并結(jié)合前人在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、孢粉學(xué)和酶學(xué)的研究結(jié)果，認(rèn)為桃、李、杏、梅、櫻類植物可劃分為桃屬、李屬、杏屬和櫻屬，其中桃屬是最進(jìn)化的類型，這與俞德浚將大李屬細(xì)劃為4個(gè)小屬的觀點(diǎn)一致［16］。這些研究充分說明了RAPD技術(shù)作為一種分子鑒定的有力工具，已經(jīng)成為了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)，細(xì)胞學(xué)和同功酶分析鑒定物種的有力補(bǔ)充。

2在種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系上的分析

遺傳多樣性是物種適應(yīng)自然和進(jìn)化的基本特征，它源于核酸序列不同和基因突變。天然植物群體的遺傳多樣性程度受遺傳漂變、遷移、突變和選擇等綜合因素的影響，其基因頻率會在一定的水平上波動，反映在核酸水平上就會呈現(xiàn)出特定DN段的多態(tài)性。因此，利用RAPD技術(shù)對遺傳多樣性進(jìn)行快速檢測，可以避免受環(huán)境、組織特異性和發(fā)育階段的影響。冷翔鵬等［17］利用RAPD和SSR2種標(biāo)記分別對系譜關(guān)系明確的22個(gè)巨峰系葡萄品種進(jìn)行聚類分析，以驗(yàn)證2種標(biāo)記方法的正確性與可靠性。結(jié)果顯示，2種分子標(biāo)記聚類結(jié)果基本一致，均適合于巨峰系葡萄的系譜分析和種質(zhì)遺傳多樣性研究;Luro等［18］應(yīng)用RAPD技術(shù)證明了寬皮柑橘品種間高度的遺傳多樣性，說明在寬皮柑橘品種的演化中起主要作用的是有性雜交和性狀重組;在桃的遺傳多樣性研究方面，程中平等［19］用RAPD標(biāo)記技術(shù)對203份桃屬材料進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)砧木類遺傳多樣性指數(shù)最高，紅葉桃、蜜桃、蟠桃和黃肉桃次之，壽星桃、碧桃、垂枝桃、硬肉桃和水蜜桃最低;譚曉風(fēng)等［20］對香榧8個(gè)主要栽培種用RAPD進(jìn)行分析，聚類結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的2大類基本吻合;為了探討梅的2種類型———花梅與果梅的遺傳多樣性，王玉娟等［21］利用改良的RAPD技術(shù)對25個(gè)花梅和21個(gè)果梅品種的基因組總DNA進(jìn)行了分析，并在此基礎(chǔ)上采用UPGMA聚類方法對花梅與果梅品種間的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示:花梅和果梅各品種間具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析結(jié)果顯示花梅和果梅具有相近的親緣關(guān)系，遺傳背景相似。

3種質(zhì)資源的鑒定

1）品種鑒定和指紋圖譜繪制

果樹大多是多年生木本植物，且主要采用無性繁殖。長期以來，不同地域相互引種栽培致使出現(xiàn)了許多同物異名和同名異物現(xiàn)象，品種名和品種分類十分混亂。對現(xiàn)有果樹品種準(zhǔn)確地鑒定和分析，是進(jìn)一步科學(xué)有效地利用果樹資源的基礎(chǔ)。過去進(jìn)行品種分類和鑒定主要采用比較形態(tài)學(xué)并結(jié)合細(xì)胞學(xué)、孢粉學(xué)和酶學(xué)等方法，這些方法對關(guān)系較近的材料不能準(zhǔn)確區(qū)分。近10多年來，發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)為品種鑒定開辟了新的技術(shù)手段。吉前華等［22］利用梯度PCR優(yōu)化了RAPD反應(yīng)條件，建立了RAPD-PCR分析的最佳反應(yīng)體系，顯著提高了柑橘RAPD分析的特異性、效率和穩(wěn)定性。結(jié)果證明，RAPD分析是品種純度鑒定研究的簡單實(shí)用的方法。潘新法等［23］運(yùn)用RAPD分析技術(shù)，對16個(gè)枇杷品種的基因組DNA進(jìn)行RAPD分析，表明不同枇杷品種基因型間存在著極為豐富的遺傳多樣性，擴(kuò)增的DNA指紋圖譜可將16個(gè)品種一一區(qū)分，為枇杷品種鑒定提供新的方法，同時(shí)也為分子標(biāo)記輔助育種提供了依據(jù);喬玉山等［24］以奉化李為試材，對中國李RAPD反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，利用該優(yōu)化反應(yīng)體系，用10個(gè)隨機(jī)引物，構(gòu)建了5個(gè)中國李品種的RAPD指紋圖譜，并以共有譜帶率對這些品種遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析;Harada等［25］用1個(gè)RAPD引物區(qū)分出了38個(gè)蘋果品種。此外，在香蕉、龍眼、梨、柿、等作物上也開展了這方面的研究工作。

2）突變鑒定

果樹在長期的無性繁殖過程中，形成了形形色色的突變類型，通過分子標(biāo)記也可以發(fā)現(xiàn)眾多突變類型，多數(shù)芽變是源于原有品種的微小變化，采用形態(tài)學(xué)、同工酶分析難以鑒定，借助分子標(biāo)記在一定程度上可提高芽變鑒定的成功率。對于不同的果樹芽變類型，RAPD標(biāo)記技術(shù)表現(xiàn)出不同的鑒定可行性。房經(jīng)貴等［26］對RAPD標(biāo)記應(yīng)用于果樹芽變鑒定中的可行性進(jìn)行了探討;金勇豐等［27］用RAPD標(biāo)記分析桃品種布目早生和其早熟芽變大觀1號基因組DNA多態(tài)性，篩選出1個(gè)引物可檢測出兩者間的多態(tài)性;Kaemmer等［28］與Yang等［29］利用RAPD分別成功地鑒別出香蕉和甜櫻桃的芽變系。RAPD標(biāo)記在其他突變體的鑒別上也有應(yīng)用。如張開春［30］曾采用RAPD標(biāo)記將蘋果品種紅星和其短枝型突變體新紅星等區(qū)別開;Sagawara等［31］還鑒定了幾個(gè)柑橘嵌合體;劉成明等［32］對荔枝懷枝和三月紅及其焦核芽變進(jìn)行了RAPD分析，分別獲得了OPL-121645和OPL-127222個(gè)特異性片段，初步認(rèn)為這2個(gè)片段與焦核性狀有關(guān)。

3）體細(xì)胞雜種的鑒定

現(xiàn)代栽培作物的遺傳基礎(chǔ)狹窄是作物改良的一個(gè)主要障礙，通過遠(yuǎn)緣雜交、體細(xì)胞雜交等方法導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)，是擴(kuò)大遺傳多樣性的主要途徑。史永忠等［33］通過優(yōu)化條件，建立起柑橘RAPD分析體系并成功地應(yīng)用于體細(xì)胞雜種的鑒定;肖順元等［34］采用RAPD分析準(zhǔn)確無誤地鑒別了Volbaner檸檬與酸橙的體細(xì)胞雜種;Sawazaki等［35］應(yīng)用RAPD鑒定出了歐洲葡萄與圓葉葡萄雜種。

4）種質(zhì)保存和核心種質(zhì)的建立

RAPD技術(shù)可以為種質(zhì)資源的研究提供幾乎無限的多態(tài)性證據(jù)。通過進(jìn)行資源鑒別，可以避免在資源保存中經(jīng)常發(fā)生的重復(fù)、混淆，為種質(zhì)資源保存提供科學(xué)的依據(jù)。

存在問題及展望

對RAPD的穩(wěn)定性和重復(fù)性差的缺陷，許多研究者通過優(yōu)化反應(yīng)條件，嚴(yán)格控制反應(yīng)程序中各個(gè)環(huán)節(jié)參數(shù)，選用適合品種的引物等多種措施改善和提高。在今后的研究中仍需對RAPD技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使其成為更簡便、準(zhǔn)確、有效、安全、廉價(jià)的檢測手段。盡管RAPD技術(shù)在我國果樹研究中應(yīng)用還較有限，主要用在物種進(jìn)化、品種分類、雜種鑒定等方面，但是已有許多果樹構(gòu)建了分子圖譜與目的基因緊密連鎖的穩(wěn)定的標(biāo)記正在不斷地挖掘，可以預(yù)見隨著分子生物學(xué)的發(fā)展RAPD技術(shù)在不斷完善的同時(shí)，也必將在果樹研究中發(fā)揮越來越大的作用。