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1材料與方法

毒桿菌分離菌株FZ2007－1和FZ2007－2、DH5α均為福建省農科院畜牧獸醫研究所分離鑒定并保存。工具酶與主要試劑聚合酶、膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；細菌DNA提取試劑盒、普通肉湯培養基和普通肉湯瓊脂培養基均從BDDifco公司購買；脫纖綿羊血購自鄭州益康生物工程有限公司。豬丹毒桿菌保護性抗原SpaA基因PCR引物合成參考副豬丹毒桿菌C43065株的SpaA基因序列設計了1對可以擴增SpaA全長基因的特異性引物，上游引物，下游引物S，預期擴增片段為1881bp，引物由TaKaRa公司合成。豬丹毒桿菌DNA的提取復蘇甘油凍存的細菌，即用接種針蘸取凍存的細菌，劃線接種于含5％脫纖綿羊血的普通肉湯瓊脂平板中，37℃倒置培養過夜；挑取單個菌落接種于普通肉湯培養基中，37℃振搖培養過夜；離心沉淀后加入PBS重懸，應用DNA提取試劑盒按照說明書提取細菌DNA，－20℃保存備用。豬丹毒桿菌SpaA基因的PCR擴增、克隆和測序以提取的基因組DNA為模板進行PCR反應。PCR反應條件：95℃預變性5min；94℃變性，72℃延伸1．5min，35個循環；72℃再次延伸10min。電泳后切膠用膠回收試劑盒回收DNA片段并與pMD18－T載體連接，轉化DH5α感受態細菌，涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板上，挑取細菌進行擴大培養，提取質粒，通過PCR鑒定，選取陽性質粒送TaKaRa公司測序。豬丹毒桿菌SpaA基因的同源性比對分析應用DNAman生物軟件，對所測2株豬丹毒桿菌SpaA基因序列與GenBank中登錄的部分豬丹毒桿菌菌株的SpaA基因進行同源性比較，并進行發育進化樹分析。豬丹毒桿菌保護性抗原SpaA的理化性質及功能域分析選取1株豬丹毒桿菌分離株為研究對象，應用ExPASy工具對豬丹毒桿菌保護性抗原SpaA的性質進行分析；應用ProtParam分析酶的氨基酸序列組成、相對分子質量、等電點等理化性質；分析酶的功能域進行蛋白信號肽預測。豬丹毒桿菌SpaA基因二級結構預測應用EXPASY服務器上的SOPMA方案分析預測豬丹毒桿菌SpaA蛋白的二級結構。豬丹毒桿菌保護性抗原SpaA蛋白的B細胞表位預測采用Hopp－Woods親水性參數、Zim－merman極性參數、柔韌性參數、抗原性參數和Emini表面可及性參數分別進行單參數預測。對各個參數的預測結果進行比較，最后進行綜合分析以確定豬丹毒桿菌SpaA蛋白的B細胞表位。

2結果

電泳條帶經回收、克隆，以克隆后提取的質粒為模板進行PCR陽性鑒定正確。豬丹毒桿菌SpaA基因的發育進化樹分析應用DNAman軟件對目的條帶的測序結果和Gen－Bank中部分豬丹毒桿菌菌株的SpaA基因進行發育進化樹分析，結果發現本試驗分離的2株豬丹毒桿菌菌株與GenBank中其他菌株在進化樹中分布較遠，自成一個分支。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的理化性質分析選擇豬丹毒桿菌FZ2007－1分離株作為代表性毒株進行分析。用E分析豬丹毒桿菌的理化性質，結果顯示，該酶有626個氨基酸，其相對分子質量為72190．3，理論等電點（PI）為9．04，為偏堿性蛋白質。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的信號肽預測用分析SpaA蛋白的氨基酸序列信號肽的存在位置及序列，結果顯示，該酶氨基酸序列上信號肽的剪切位點位于第29～30個氨基酸。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的功能域分析將豬丹毒桿菌SpaA蛋白的氨基酸序列提交到ScanPro－site服務器，對SpaA蛋白進行翻譯后修飾位點結構分析。結果表明，該蛋白有1個組蛋白賴氨酸N－甲基轉移酶家族元件，1個細胞壁結合重復元件，8個肉豆蔻酰化位點豬丹毒桿菌SpaA蛋白的二級結構通過NPS＠服務器上的SOPMA方案預測SpaA蛋白的二級結構成分，結果表明，該蛋白主要由α螺旋和無規則卷曲組成，其中，α螺旋有335個、占53．51％，延伸鏈有78個、占12．46％，β轉角有66個、占10．54％，無規則卷曲有147個、占23．48％。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的B細胞表位預測分別對SpaA蛋白的極性、親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性參數進行預測，B細胞抗原表位的數目及抗原表位可能出現的肽段有所不同，但均顯示，各種方案所預測的參數值均高于其他區段。因此，以上多個區段形成B細胞表位的可能性最大。

3討論

結果表明該片段能夠防止桿菌對豬的感染。Shimoj等也通過表桿菌SpaA蛋白N端2／3區域，免疫小鼠后，小鼠可產生較強的免疫保護力。對于蛋白的B細胞表位預測，已有多種單參數預測模型和相應的分析軟件，但為了克服單參數預測模型的局限性，提高預測的準確性，一般對多種參數的預測結果進行綜合考慮，其中比較重要的參數為親水性參數、極性參數和柔韌性參數。通常蛋白質的二級結構與蛋白質的B細胞表位有較大的關系。豬丹毒是由豬丹毒桿菌引起的一種急性、熱性人畜共患傳染病，其主要特征表現為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性疣狀心內膜炎及多發性非化膿性關節炎。該病分布廣泛、世界各地均有發生，給世界養豬業造成了巨大的經濟損失。特別是在最近2年，由于“高熱病”的暴發，導致豬群免疫力下降，豬丹毒在全國各地均有零星發生的報道，并有小范圍流行的可能性［19－20］。近幾年來，對豬丹毒桿菌的分子生物學和免疫學進行了一些研究，吾魯木汗·那孜爾別克等對豬丹毒桿菌SpaA基因的原核表達和重組疫苗的研究結果表明，SpaA蛋白具有良好的免疫保護作用。晏鵬飛等通過研究表明豬丹毒桿菌表面保護性蛋白A起主要保護功能的核心區段為氨基端，且是由抗體介導的免疫保護。Aimad等克隆和表達了編碼SpaA蛋白N端的基因片段，通過West－ernblot檢測其免疫功能，本試驗運用SOPMA方案預測蛋白質的二級結構，結合親水性方案、極性方案、柔韌性方案、Emini表面可及性方案和Jameson－Wolf抗原性指數方案多種方法綜合分析，發現該酶以α螺旋（占53．51％）、無規則卷曲（占23．48％）、延伸鏈（占12．46％）為主，而β轉角只占10．54％；并應用不同的方案預測了B細胞表位的優勢區。本研究基于豬丹毒桿菌SpaA蛋白的氨基酸序列，通過對其二級結構、跨膜區、親水性、表面可及性與抗原性等多種參數進行綜合分析，預測了SpaA蛋白可能的B細胞優勢表位，為尋找特異性相關表位用于疫苗的設計、診斷試劑研發、免疫機理的探討等提供了理論依據，同時也為豬丹毒桿菌SpaA蛋白功能研究提供了線索。

作者：林琳江斌吳勝會張世忠單位：福建省農業科學院