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一、資料

純化產物的鑒定純化產物經Westernblot分析，無雜帶（圖略）。純化的重組MSP1α和MSP1β蛋白純度分別可達93%和91%。重組表達質粒的鑒定以重組質粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β為模板進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見774和2300bp的目的基因條帶，大小與預期相符；重組質粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β的雙酶切產物可見774和2300bp的目的基因片段，大小與預期相符。MSP1α與MSP1β基因測序結果與GenBank上登錄的基因序列核苷酸同源性均達95.5%，氨基酸同源性分別達89.5%和90.0%。表達產物的鑒定重組菌的最佳誘導時間均是4h，表達產物經12%SDS-PAGE分析，可見相對分子質量約58000的MSP1α蛋白條帶及107000的MSP1β蛋白條帶，大小與預期相符。表達的目的蛋白主要以包涵體形式存在，MSP1α和MSP1β表達量分別占菌體總蛋白的31%和14%。

二、重組蛋白免疫原性的鑒定

在相對分子質量約58000和107000處可見特異性反應條帶，而陰性對照（MSP1α蛋白加入兔抗MSP1β血清或MSP1β蛋白加入免抗MSP1α血清）無此條帶重組蛋白在大腸埃希菌外膜的表達IFA法檢測結果顯示，免疫前的IgY抗體不能與表達MSP1α和MSP1β蛋白的重組菌發生反應，而1∶800稀釋度以上的抗MSP1α和MSP1βIgY抗體均可與表達MSP1α和MSP1β蛋白的重組菌發生反應。。重組蛋白對牛紅細胞的黏附作用HA檢測結果顯示，重組MSP1α和MSP1β蛋白可黏附至牛紅細胞上，表達MSP1α蛋白的重組菌對紅細胞的吸附率為56.4%，表達MSP1β蛋白的重組菌對紅細胞的吸附率為52.7%，空菌體對紅細胞的吸附率僅為9.6%，見圖7。HI檢測結果顯示，經抗MSP1α和MSP1β的IgY抗體處理后的MSP1α和MSP1β蛋白對紅細胞的吸附率分別為6.8%和9.4%，經PBS處理后的MSP1α和MSP1β蛋白對紅細胞吸附率分別為53.2%和49.3%3討論Viseshakul等于2000年從佛羅里達分離株中分離的A.marginale對MSP1β基因的測序明確了兩個編碼MSP1β1和MSP1β2全長基因。Camacho-Nuez等也于2000年從佛羅里達分離株中發現另外3條MSP1β全長基因。MSP1α細胞外氨基末端區域包含串聯重復序列，這些序列與A.marginale對牛紅細胞和蜱細胞的黏附密切相關。MSP1α與A.marginale通過蜱的感染及傳播有關。本實驗中表達的重組MSP1α和MSP1β蛋白可誘導兔和雞產生特異性的抗體，該抗體可與重組MSP1α和MSP1β蛋白發生特異性反應；MSP1α和MSP1β蛋白可在大腸埃希菌細胞外膜上表達，無表達時采用IFA檢測，熒光強度減弱，表明MSP1α和MSP1β蛋白可能是A.marginale對蜱和牛紅細胞黏附力的基礎。重組MSP1α和MSP1β蛋白在大腸埃希菌表面可凝集牛紅細胞，而抗MSP1α和MSP1βIgY抗體均可抑制該凝集，提示MSP1α和MSP1β蛋白對紅細胞有黏附功能。HA試驗結果顯示，重組MSP1α蛋白對紅細胞的吸附率為56.4%，而重組MSP1β蛋白對紅細胞的吸附率為52.7%。經抗MSP1α和MSP1βIgY抗體處理后的MSP1α和MSP1β蛋白，對紅細胞的吸附率分別僅有6.8%和9.4%，與Tamekuni等的研究結果相似，Tamekuni等認為A.mar-ginale能識別牛紅細胞的表面受體，并可相互作用，表明MSP1α和MSP1β蛋白對紅細胞有黏附功能。

三、總結

綜上所述，本實驗闡明了A.marginale中MSP1α和MSP1β重組蛋白菌外膜上獲得有效表達，并確認了MSP1α和MSP1β蛋白在侵入紅血球過程中起到黏附素的作用，表明這2種蛋白在控制牛A.marginale感染方面具有重要作用。以其為研究對象進行A.marginale亞單位疫苗的研制也取得了相應的成果。隨著對牛邊緣無漿體病認識的不斷深入，與其相關的基礎研究和應用研究必將得到進一步開展，尤其在該病的防控、致病機理及新型疫苗研制等方面將取得突破性的進展。

作者：胡林森單位：新疆國防大學