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在EHA105和AGL-1中質粒出現了明顯的降解。Song等研究發現土豆基因組DNA超過100kb的BIBAC和TAC克隆在農桿菌中不穩定,在同時進行試驗的土豆基因組片段中,45kb的片段不會出現丟失的現象,遺傳穩定。Shi等檢測了玉米中40~160kb的BIBAC克隆,無論在大腸桿菌中還是農桿菌中都穩定的遺傳。3.3受體材料的選擇處于不同發育狀態的受體材料對農桿菌侵染的敏感程度是不同的,但處于細胞分裂s期(DNA合成期)的核基因組DNA正在復制,這對于外源基因的整合十分有利,選擇此時期的細胞才具有整合外源基因的能力。細胞具有分裂能力是轉化的基本條件,創造出傷口的幼年組織細胞分裂快,處于轉化的敏感期,因此農桿菌轉化和再生的良好外植體來源是幼胚或經成熟胚誘導產生的胚性愈傷組織,一般幼胚的轉化率略高于成熟胚。懸浮細胞系雖能活躍增殖,但其體細胞變異頻率大、轉化效率低,因而不適用于轉化。DNA與基因組的整合DNA作為外來者被整合到受體植物基因組中,出現轉基因表達有所下降或者不表達等復雜現象。根據報道,外源基因被整合到受體植物基因組后,將產生以下幾種形式,一是外源基因插入到基因組的沉默區域內,導致基因組內沉默不表達的基因被激活而高效表達;二是外源基因隨機插入到基因組的閱讀框內,使基因組正常核酸序列被破壞不能有效表達;三是外源基因插入到基因組的功能區內,使其起調控的基因不能正常表達。等認為帶有的BIBAC克隆能否在轉基因植物中整合特別是在遠緣物種間的整合還需要深入研究。提高基因表達的策略根據基因表達的機理,可以通過創建高效表達的轉化載體來提高基因表達。一是構建理想的人工啟動子:構建理想的人工啟動子對的轉化十分必要,設計了一種簡單快捷篩選強啟動子的方法,可以快速篩選出恰當長度的啟動子,為構建理想的人工啟動子提供了保障。二是對具有表達作用的內含子序列進行改造并插入。近年來的研究發現內含子與基因表達有關,將單子葉植物基因的內含子插入啟動子和報告基因之間,可顯著提高基因在單子葉植物中的表達效率。為了能夠提高轉基因表達的組織特異性,將擬南芥中H3組蛋白內含子進行改造,進而達到了預期效果。三是根據受體材料的基因組情況對目的基因進行改造。最典型的例子就是對基因的轉化,通過將其密碼子的第3個堿基進行改造后,使其在植物中的毒蛋白表達量提高0.2%~0.3%。篩選標記基因目前,大多數的篩選標記基因是抗生素和除草劑抗性基因,快速并高效的篩選標記基因是轉化的關鍵。He等通過BIBAC2載體攜帶2個穩定的植物標記基因潮霉素和新霉素成功轉化了水稻。此外,通過報告基因來篩選也比較快捷,但存在的問題是報告基因瞬時表達轉入的外源基因,有時并非發生在可再生細胞中,這樣則無法建立轉化體系。以上幾個為主要影響因素,此外還有一些因素也對DNA遺傳轉化有影響,如農桿菌的生理活性、侵染時的菌液濃度、侵染后的培養時間、溫度、pH值等以及表面活性劑的使用情況等。
2結論與探討
可以將大基因組物種DNA有序的保存起來,通過將單個克隆保存在384板中,不僅減少后續研究中對DNA需求反復提取的繁瑣,也使后續試驗操作變得簡單快捷;對基因組而言,有序文庫比無序的片段要方便的多。其次,為基因組功能的研究、基因組測序及單個基因的克隆鑒定提供非常必要的操作平臺。DNA遺傳轉化技術在基因簇轉移、多基因、代謝工程、基因圖位克隆、數量性狀座位等方面有重要意義,是植物遺傳轉化的發展趨勢,也是植物轉化的現實要求。但是目前國內的DNA研究起步較晚成果較少,仍存在很多挑戰,如許多重要的經濟作物、稀有物種對農桿菌介導的遺傳轉化高度不親和性;轉化后外源基因在植株中能否穩定的表達;如何提高轉化效率等,這些都是未來需要探討和深入研究的問題。相信隨著分子生物學的發展,轉基因技術日趨成熟,所面臨的問題會迎刃而解,DAN的未來會更光明。
作者:楊俊單位:東南職業技術學院