化學發光分析儀生物化學論文
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1實驗部分
（德國伯托公司）；白色96孔板（美國康寧公司）。魯米諾（Sigma-aldrich公司）；8-羥基喹啉（Sig－ma-aldrich公司）；FeCl3（Sigma-aldrich公司）；過氧化氫（30%，Sigma-aldrich公司）；ATP生物發光檢測試劑盒（ENLITEN，美國普洛麥格公司）；實驗用水均為經Milli-Q（Millipore公司）純化的超純去離子水。實驗中所用試劑均為分析純。
1.2實驗方法
1.2.1儲備液的配制
魯米諾儲備溶液：稱取一定量的魯米諾溶于1mol/L的NaOH溶液中，配制成1×10-2mol/L的魯米諾儲備液，儲存在棕色瓶中，避光4℃保存。8-羥基喹啉儲備溶液：稱取一定量的8-羥基喹啉溶于0.1mol/L的HCl溶液中，配制成1×10-2mol/L的8-羥基喹啉儲備液，4℃保存。Fe（III）標準儲備溶液：稱取一定量的烘干恒重的FeCl3溶于pH2.5的HCl溶液中，配制成1×10-3mol/L的Fe（III）標準儲備溶液，其摩爾濃度通過硫代硫酸鈉滴定法準確確定，通過GBW(E)081235硫代硫酸鈉滴定溶液標準物質進行溯源。ATP標準儲備溶液：稱取一定量的ATP標準物質候選物溶于無ATP水（ATP生物發光檢測試劑盒自帶）中，配制成1×10-7mol/L的ATP標準儲備液，-20℃保存。作為實驗室研制的標準物質候選物，需要按照ISO導則35要求，摩爾濃度經過8家單位聯合驗證，并經過一系列均勻性、穩定性的考查。
1.2.2工作溶液的配制
魯米諾工作溶液：用純水將魯米諾儲備液稀釋成1×10-3mol/L的魯米諾工作溶液（其中NaOH的摩爾濃度為0.1mol/L）。8-羥基喹啉工作溶液：用純水將8-羥基喹啉儲備溶液稀釋成1×10-3mol/L的8-羥基喹啉工作液（其中HCl的摩爾濃度為0.01mol/L）。Fe（III）標準工作溶液：用pH2.5的HCl溶液將Fe（III）標準儲備溶液逐級稀釋成Fe（III）標準工作溶液（1×10-4mol/L，3×10-5mol/L，1×10-5mol/L，3×10-6mol/L，1×10-6mol/L）。過氧化氫溶液：取一定量體積分數為30%的過氧化氫，用水稀釋至1%，用時現配。ATP標準工作溶液：用檢測緩沖液（ATP生物發光檢測試劑盒自帶）將ATP標準儲備溶液逐級稀釋成ATP標準工作溶液（1×10-8mol/L，1×10-9mol/L、1×10-10mol/L，1×10-11mol/L），現用現配。
1.2.3實驗方法
1）化學發光標準體系的建立
化學發光反應動力學檢測：在1.5mL離心管中分別依次加入以下溶液，立刻將該離心管放到化學發光分析儀中，進行動力學檢測，每秒取一個點，檢測時間共100s。①10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLpH2.5的HCl溶液（相當于10μLFe（III）標準工作溶液）、85μLpH2.0的HCl溶液（相當于85μL8-羥基喹啉工作溶液）；②10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）、85μLpH2.0的HCl溶液（相當于85μL8-羥基喹啉工作溶液）；③10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLpH2.5的HCl溶液（相當于10μLFe（III）標準工作溶液）、85μL8-羥基喹啉工作溶液；④10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液。8-羥基喹啉的用量對體系發光值穩定性的影響：在10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）中分別加入不同體積的8-羥基喹啉工作溶液，并用pH2.0的HCl溶液將體系補足205μL，立即檢測當前發光值。pH對體系發光值穩定性的影響：在1.5mL離心管中依次加入10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液，利用HCl或NaOH調整體系的pH值，立刻將該離心管放到化學發光分析儀中檢測當前發光值。反應介質對體系發光值穩定性的影響：在1.5mL離心管中分別加入50μL的Tris-HCl、H3BO3-KOH、Na2CO3-NaHCO3和B-R緩沖溶液，然后分別依次加入10μL魯米諾工作溶液、100μL過氧化氫溶液、10μLFe（III）標準工作溶液（3×10-5mol/L）、85μL的8-羥基喹啉工作溶液，立刻將該離心管放到化學發光分析儀中檢測當前發光值。
2）生物發光標準體系的建立
用ATP標準物質代替ATP生物發光檢測試劑盒中的ATP校準溶液，采用試劑盒中的其他溶液建立生物發光標準體系：首先，將10μL檢測緩沖液加入有100μL熒光素/熒光素酶試劑的1.5mL離心管中，立刻將該離心管放到化學發光分析儀中進行檢測，作為背景信號；然后，將10μLATP標準工作溶液加入有100μL熒光素/熒光素酶試劑的1.5mL離心管中，立刻將該離心管放到化學發光分析儀中進行檢測。
2結果與討論
2.1化學發光標準體系的建立
魯米諾（3-氨基鄰苯二甲酰肼）是最常見的化學發光試劑之一，具有發光效率高、結構簡單、容易合成、水溶性好等優點；在堿性條件下，魯米諾被氧化劑（如過氧化氫）氧化后能發出波長425nm的藍光。在不同體系中，魯米諾發光形式不同：金屬離子-過氧化氫-魯米諾體系是閃光型發光；辣根過氧化物酶（HRP）-過氧化氫-魯米諾體系[9-10]是輝光型發光。HRP-魯米諾體系雖是輝光型發光，但生物酶的活性很難控制和復現，不適用于儀器的計量校準。本文將8-羥基喹啉（8-Ox）引入魯米諾-過氧化氫-金屬離子體系中，實現發光方式由閃光型到輝光型的轉變，建立了發光強度穩定的魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學發光標準體系。
2.1.1添加8-羥基喹啉
初步實現穩定輝光型信號魯米諾在堿性溶液中，與OH-反應生成陰離子，該陰離子被某些氧化劑氧化產生氨基鄰苯二甲酸根離子，氧化過程中產生的化學能被氨基鄰苯二甲酸根離子吸收，使其處于激發態，回到基態時發出波長為425nm的光，Fe（III）可以催化該反應過程，增強化學發光信號，而8-羥基喹啉可以與Fe（III）絡合，從而起到穩定劑的作用。不同體系中魯米諾-H2O2的發光情況，其縱坐標為相對發光強度（RLU）。曲線a說明魯米諾與H2O2混合后，被H2O2氧化并發光，剛開始發光值緩慢上升，隨著反應物的消耗，發光值開始緩慢下降，發光形式呈現一個較平緩的閃光；曲線b說明在魯米諾-H2O2體系中加入了Fe（III）之后，加速了魯米諾與H2O2反應，因此一開始體系的發光就達到了最大值，之后隨著反應物的快速消耗，發光值也急速下降；曲線c說明當在這個體系中加入8-羥基喹啉，Fe（III）與其絡合，保證了在堿性條件下Fe（III）的穩定性，使化學發光反應變成非常平穩的輝光型，在100s內發光值的相對標準偏差僅為1.1%。曲線d是沒有Fe（III）的空白對照實驗。
2.1.2優化反應體系的穩定性
為獲得穩定且容易操作的化學發光反應體系，選擇了10μL魯米諾工作溶液（摩爾濃度為1×10-3mol/L）和100μL過氧化氫溶液（體積分數濃度為1%）的基礎上，考察8-羥基喹啉的用量、反應體系最終pH和反應介質3個方面的因素，最終確定了該化學發光體系優化濃度比例。
1）8-羥基喹啉的用量對體系發光值穩定性的影響
隨著向體系中加入8-羥基喹啉工作溶液的增多，體系的發光值持續降低，直到當加入50μL8-羥基喹啉工作溶液，體系的發光值不再隨著8-羥基喹啉加入量的增加而降低。在儀器計量工作中，可以選擇加入50~85μL8-羥基喹啉工作溶液，此時8-羥基喹啉的體積對發光強度的影響最小。在后續實驗中，選擇65μL作為優化的8-羥基喹啉加入量。
2）反應體系最終pH對體系發光值穩定性的影響
魯米諾的化學發光反應需要OH-的參與，因此體系的pH也是影響發光值的重要因素之一。當pH＞10.0，體系的發光值會隨著pH增大而呈指數增加，體系不容易控制；當pH值在8.80~9.60范圍內，體系的發光值增長比較穩定，可以滿足儀器計量檢定中操作方便的需求。
3）緩沖體系對體系發光值穩定性的影響
考察了相同濃度的Tris-HCl、H3BO3-KOH、Na2CO3-NaHCO3和B-R緩沖溶液對魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學發光體系的影響，發現Tris-HCl中化學發光信號最為穩定，故選擇Tris-HCl緩沖溶液；最終體系定為：加入50μL0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液，pH=9.10。通過對8-羥基喹啉的用量、反應體系最終pH和反應介質3個方面的考查，確定了化學發光分析儀計量用魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉體系，其用量分別為：10μL摩爾濃度為1×10-3mol/L魯米諾工作溶液（pH13.0）、100μL體積分數為1%過氧化氫溶液、65μL摩爾濃度為1×10-3mol/L8-羥基喹啉工作溶液（pH2.0）、和50μL0.05mol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH=9.10）。此時化學發光強度與Fe（III）的摩爾濃度具有很好的線性關系。
2.2生物發光標準體系的建立
在眾多生物發光體系中，ATP-熒光素-熒光素酶發光體系應用最為廣泛，ATP檢測也經常被業內用于化學發光分析儀靈敏度的衡量指標。其原理是：熒光素酶在有氧條件下，可以和熒光素結合后催化ATP轉化成AMP（磷酸腺苷），同時釋放出光子（波長562nm），發光效率高，而且發光強度與ATP含量呈很好的線性關系。為了統一儀器靈敏度的評價方法，我們研制了ATP標準物質，并結合商品化ATP檢測試劑盒，建立了一套穩定可靠的ATP生物發光標準體系，用于化學發光分析儀的計量校準。
2.3生物化學發光標準體系
在儀器計量校準中的應用最終將化學發光標準體系和生物發光標準體系聯合，共同對化學發光分析儀進行計量校準研究，對儀器的計量性能進行全面的考察：采用魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學發光標準體系對伯托LB962型化學發光分析儀的測量重復性、交叉污染和線性相關系數的計量特性進行評價；采用ATP生物發光標準體系作為標準光源對伯托LB962型化學發光分析儀的靈敏度的計量特性進行評價。
2.3.1測量重復性
以1×10-5mol/LFe（III）標準工作溶液進行測量，重復測量6次，相對發光強度值分別為302579，298800，321145，299523，338856，356041，計算其相對標準偏差為7.4%，即為儀器的測量重復性。實驗數據說明儀器測量重復性較好；同時也說明建立的化學發光標準反應體系發光值穩定，完全可以用于儀器測量重復性的計量特性的評價。
2.3.2交叉污染測量中心孔
（樣品位置，1×10-5mol/LFe（III）標準工作溶液）發光值I0和周圍孔發光值I0i，如表1所示，周圍孔發光值的平均值與中心孔發光值之比的百分數即為化學發光分析儀的交叉污染。由實驗數據可以看出，中心孔的發光對周圍孔發光影響很小，儀器的交叉污染僅為0.02%，與儀器的出廠指標無明顯差異；同時證明了我們建立的化學發光標準反應體系可以用來評價儀器的交叉污染的計量特性。
2.3.3線性相關系
數采用化學發光標準體系對0，1×10-6，3×10-6，1×10-5，3×10-5，1×10-4mol/LFe（III）標準工作溶液進行測量，考察儀器測量線性相關系數，以檢測發光值信號減去本底信號得到的相對發光值ΔI為縱坐標（本底信號為Fe（III）摩爾濃度為0時的發光值），Fe（III）的摩爾濃度為橫坐標繪制標準曲線，Fe（III）在1×10-6~1×10-4mol/L范圍內呈良好的線性關系：ΔI=2×1010C-22396，線性相關系數r=0.9986。使用ATP生物發光檢測試劑盒對0，1×10-11，1×10-10，1×10-9，1×10-8，1×10-7mol/LATP標準工作溶液進行分析，考察儀器測量線性相關系數，以相對發光值Δ（IΔI為檢測發光值信號減去本底信號，本底信號為ATP濃度為0時的發光值）為縱坐標，ATP的摩爾濃度為橫坐標繪制標準曲線。ATP在1×10-11~1×10-7mol/L范圍內呈良好的線性關系：ΔI=7×1012C+550，線性相關系數r=0.9999。采用化學發光標準反應體系和生物發光標準反應反應體系評價儀器的線性相關系數分別為0.9986和0.9999，說明儀器的線性相關系數的性能指標較好；這兩種反應體系均能評價儀器的線性相關系數的計量特性。
2.3.4靈敏度使用
ATP生物發光檢測試劑盒對空白溶液的本底信號進行測量，平行檢測11次，本底信號相對發光強度分別為29，34，32，34，40，47，37，42，34，39，32，計算檢出限（3×S/N）為2.24×10-16molATP（100μL樣品體積），即為化學發光分析儀的靈敏度，達到儀器的出廠指標，說明ATP生物發光標準反應體系可以用來評價儀器的靈敏度的計量特性，統一了化學發光分析儀靈敏度的表示方法。
3結束語
本文模擬化學發光分析儀的實際工作狀態，建立了可溯源的魯米諾-過氧化氫-鐵（III）-8-羥基喹啉化學發光標準體系和ATP-熒光素-熒光素酶生物發光標準體系，并將這兩種標準體系聯合，應用到化學發光分析儀的計量校準工作中，對儀器測量重復性、交叉污染、線性相關系數和靈敏度計量特性進行實驗研究，實現了對化學發光分析儀計量性能的全面考察，為化學發光分析儀日常的校準工作以及國家計量校準規范的制訂提供了實驗基礎。
作者：李蘭英徐勤許麗聞艷麗武利慶任淑貞劉剛單位：上海市計量測試技術研究院中國計量科學研究院
