酒精性肝病和肝細胞凋亡關系
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與TGFβ和抗Fas單克隆抗體對肝細胞的凋亡誘導作用相似［1］,低濃度的乙醇能夠在體外誘導培養的大鼠肝細胞發生凋亡［2］。由于腫瘤細胞的易培養性,往往以肝癌細胞代替肝細胞建立乙醇誘導肝細胞凋亡的實驗模型。乙醇能夠誘導肝癌細胞系HepG2細胞凋亡,并且其誘導凋亡的效果強于絲裂霉素C［3］。用不同濃度的乙醇作用于HepG2細胞和人正常肝細胞系HPH細胞不同時間之后,每例取6×103個細胞進行透射電鏡分析。發現乙醇對肝細胞的凋亡誘導作用強于對肝癌細胞的作用（P<0.05）,而且肝細胞和肝癌細胞凋亡的發生程度與乙醇的濃度和作用時間顯著正相關（P<0.01）［4］。
2酒精性肝病中的肝細胞凋亡
Kawahara等［5］用免疫組化法檢測了凋亡相關抗原Lewis在20例ALD患者（平均每天攝入酒精80g以上）的肝活檢組織的表達情況,發現含Mallory小體的肝細胞呈Lewis抗原陽性表達,提示至少部分含Mallory小體的肝細胞以凋亡的方式被清除。TUNEL法檢測結果表明,ALD組織的凋亡發生率明顯高于正常肝組織,并且在氣球樣變性、膽汁淤積、炎癥區和結節性肝硬化部位更為明顯［6］。Goldin等［7］用連續23天乙醇蒸汽吸入法建立了小鼠ALD模型。在21只正常對照小鼠中,只有36%的肝末端小靜脈可見凋亡小體,并且這些凋亡小體中的88%位于中央靜脈周圍兩排的肝細胞。實驗組41只小鼠中,72%的肝末端小靜脈可見凋亡小體,并且這些凋亡小體大多數不只是位于中央靜脈周圍兩排的肝細胞,肝細胞凋亡程度與肝細胞損傷程度密切相關。在停止吸入酒精蒸氣后,肝細胞凋亡現象逐漸減輕,并且經過一段時間之后肝組織結構可完全恢復正常。說明ALD中凋亡小體產生的數量和位置具有時間依賴性,肝組織損傷具有可復性。Baioni等［8］在用定量分析法證實了大鼠慢性酒精中毒肝細胞凋亡率上升的趨勢之后,用以BrdU檢測分裂期細胞的方法表明,其肝細胞增殖率也明顯上升。在大鼠ALD的逐步發展過程中,不僅凋亡的肝細胞不斷增多,而且肝細胞的增殖細胞核抗原（PCNA）陽性率也不斷增高［9］。在小型豬ALD模型中也可見到不僅肝細胞凋亡小體隨著ALD的發展而明顯增多,肝細胞的PCNA陽性表達率也逐漸增高［10］。提示在ALD中肝細胞凋亡現象及其再生修復同時存在。
3酒精性肝病中肝細胞凋亡的發生機制
關于ALD中肝細胞凋亡的發生機制尚未完全闡明,目前認為其主要與以下幾種因素有關:（1）肝細胞色素p4502E1（CYP2E1）的活化。在正常肝臟中,CYP2E1主要分布在中央靜脈周圍的肝細胞,此處正是ALD病理損傷的好發部位。在ALD組織中,CYP2E1活性普遍較高。CYP2E1具有很強的MADPH氧化酶活性,可使乙醇氧化生成羥乙基根,使肝細胞反應性氧中間產物和脂質過氧化終產物增多,產生對肝細胞的毒性作用,引起肝細胞凋亡。經逆轉錄病毒載體介導把CYP2E1基因轉染到HepG2細胞中,并使其穩定表達。在乙醇誘導下轉染CYP2E1基因的細胞較未轉染的細胞更容易發生凋亡CYP2E1拮抗劑，抗氧化劑都能夠對抗乙醇對肝細胞的凋亡誘導作用［11］。從大豆中提取的一種多聚不飽和卵磷脂能夠降低乙醇特異性CYP2E1的產生和對抗氧化,從而減輕乙醇引起的肝細胞凋亡,說明CYP2E1確實在乙醇誘導肝細胞凋亡中具有重要的作用［12］。（2）肝臟鐵負荷增加。鐵可催化自由基的生成,并增強肝細胞的氧化應激反應。在大鼠飲食中加入碳酸鐵,可加重其ALD所致的肝損傷,使肝細胞凋亡程度增加［13］。（3）腫瘤壞死因子（TNF）和TNF受體的活性增高。用乙醇誘導凋亡的HepG2細胞與凋亡前相比,TNF-α表達水平增高了35倍,IL-1α和IL-6的水平也分別有所增高［14］。乙醇能夠阻止TNF-α激活肝細胞內對氧化還原作用敏感的轉錄因子NFkB,使肝細胞增殖活性下降,肝細胞對BclxL等生存基因的表達減弱,破壞TNF-α和其他與肝細胞生長調節有關的細胞因子對肝臟的營養和保護作用［15］。（4）促氧化物增多和抗氧化物減少造成的氧應激反應。乙醇代謝過程中產生的氧化劑能夠誘導肝細胞發生凋亡,并使DNA產生片段化。谷胱甘肽等細胞內的抗氧化劑能夠對抗乙醇引起的肝細胞凋亡［16］。用共聚焦顯微鏡研究的結果顯示,能夠對抗乙醇引起的氧化壓力的試劑可有效地減輕乙醇引起的肝細胞凋亡或壞死。并且,細胞內抗氧化劑的抑制劑能夠加重乙醇誘導的肝細胞凋亡［17］。（5）肌纖維母細胞和TGF-β的誘導凋亡作用在ALD中,來自肝星狀細胞的肌纖維母細胞不僅能夠合成和分泌一些膠原和非膠原基質蛋白,而且可使成纖維生長因子TGF-β的分泌增加。TGF-β是一種公認的肝細胞凋亡誘導劑。Gressner等［18］分離了大鼠的肌纖維母細胞,并在體外觀察此肌纖維母細胞對肝細胞的凋亡誘導作用。發現當肌纖維母細胞分泌TGF-β時,用DNA熒光染料Hoechst33342染色可見肝細胞出現典型的凋亡形態學變化,TUNEL法檢測顯示有很多明顯的陽性細胞出現,并可用瓊脂糖凝膠電泳觀察到凋亡細胞特有的梯狀DN段化。當肌纖維母細胞不分泌TGF-β時,肝細胞未見明顯的凋亡發生。提示肝臟的肌纖維母細胞可能通過增加TGF-β的分泌來誘導肝細胞凋亡。（6）某些凋亡相關分子的變化。ALD肝組織的CD95受體及其配體表達水平普遍增高,細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）能夠通過CD95受體和配體的相互作用啟動細胞凋亡［13］。Deaciuc等［19］用給大鼠連續7天喂食含乙醇液體飲食的方法建立了ALD模型。分離ALD大鼠的肝細胞、枯否細胞和肝血竇內皮細胞之后分別檢測其Caspase3表達水平,發現均較正常對照組明顯增高。乙醇誘導的HepG2細胞凋亡過程中Caspase1和Caspase3表達水平明顯增高,并可分別被ICE蛋白抑制劑和bcl2基因轉染所抑制［11］。提示上述凋亡相關分子的變化可能在ALD肝細胞凋亡發生過程中具有一定的作用。
4內毒素、炎癥介質和細胞因子
炎癥介質和（或）細胞因子對酒精性肝病的形成具有重要的作用［20］。酒精的攝入可致炎癥細胞對炎癥刺激過度的反應產生大量的炎癥介質和（或）細胞因子,即所謂的激發和致敏。一方面,肝細胞損傷后,可發生肝實質細胞的凋亡和壞死,激活肝內的Kupffer細胞和血循環中的單核細胞。另一方面,酒精性肝病時,因腸細菌過度生長、腸黏膜通透性增加、腸細菌移位以及正常的免疫功能受抑制等,導致腸源性內毒素血癥［21］。內毒素不僅可直接損傷肝細胞,更重要的是內毒素還與Kupffer細胞特異受體CD14及TLR4（Tolllikereceptor4）結合激活該細胞。進而可釋放大量的氧自由基、細胞因子和炎癥介質,如TNF-β、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-β、TGF-β、PDGF等。不僅如此，細胞黏附分子和細胞因子受體表達也增加。多種細胞因子和炎癥介質可引起肝細胞進一步壞死、凋亡、炎癥和肝纖維化形成。尤其是腸源性內毒素血癥在ALD的形成過程中的作用至關重要,內毒素可使Kupffer細胞釋放TNF-β和NO,誘發肝細胞壞死與凋亡,并發現TNF-α與各種細胞膜上的受體結合可增加細胞內活性氧形成,誘導細胞死亡。不僅如此,對酒精性肝病時Kupffer細胞TNF-β表達上調的進一步研究發現,慢性酒精的攝入能增加內毒素刺激的細胞外受體活性激酶1/2（ERK1/2）的活性,促進早期生長反應因子1（Egr1）的表達,并使Egr1與TNF-β啟動子結合力增加。臨床和動物實驗均表明ALD血循環中TNF-α明顯升高,運用TNF-α中和抗體能減輕酒精所致大鼠的肝損傷。通過飲食含乳酸桿菌食物或用多粘菌素B或新霉素等抗生素,改善腸黏膜的屏障功能、抑制腸道細菌過度生長以減少內毒素的生成等措施,均能明顯減輕實驗性酒精性肝病的嚴重程度。應用氯化釓（GdCI3）選擇性破壞枯否細胞,可在很大程度上阻斷酒精性肝病的發生,阻斷內毒素的信號轉導,均能減輕酒精性肝損傷［22,23］。
5總結
綜上所述,乙醇不僅能夠在體外誘導肝細胞或肝癌細胞凋亡,而且動物體內實驗也證實,ALD中肝細胞凋亡率明顯增高,肝細胞凋亡與ALD病變的發生和發展過程密切相關。目前,在乙醇誘導肝細胞凋亡與ALD關系的研究中有待于解決的問題主要是:（1）ALD動物模型的建立。盡管已經用含乙醇液體飼料喂養、酒精灌胃和乙醇蒸氣吸入等方法建立了許多大鼠、小鼠和狒狒等動物的ALD模型,但是其與人類ALD的病理變化仍有一定程度的差異。其中,以用狒狒建立的模型最接近于人類ALD,但是狒狒模型還存在價格昂貴,不易操作和結果不易重復的缺點。目前尚缺乏既能比較完全地模仿人類ALD的病理變化,又簡便易行的動物模型;（2）ALD中肝細胞凋亡的發生機制尚不明確。盡管已經明確了ALD中肝細胞凋亡的發生與CYP2E1的活化,鐵負荷增加,TNF和TNF受體活性增高,促氧化物增多和抗氧化物減少造成的氧應激反應,肌纖維母細胞和TGF-β的誘導凋亡作用以及某些凋亡相關分子的變化密切相關,但是其具體的作用機制和信號傳導通路尚不清楚;（3）ALD中肝細胞凋亡與抗凋亡的平衡機理。在ALD中,肝細胞不僅發生凋亡,其增殖功能也變得異常活躍,PCNA指數和BrdU數值都明顯增高,說明伴隨著乙醇誘導肝細胞凋亡的發生,肝細胞發生了再生。在ALD中,肝細胞凋亡率明顯增高的同時,肝臟膽管上皮細胞和炎癥細胞的bcl2蛋白表達水平也明顯上升［9］。說明ALD中還存在著肝細胞凋亡和肝臟抗凋亡的動態平衡問題。目前對這一問題尚缺乏比較深入的認識。
隨著新的凋亡相關分子的逐漸發現,以及對ALD發病機制的深入研究,乙醇誘導肝細胞凋亡與ALD的關系會得到進一步明確,ALD中肝細胞凋亡的發生機制也必然會得到進一步揭示。
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