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【摘要】目的：觀察新輔助化療對乳腺癌外周血微轉移因子的影響。方法：以48例具備新輔助化療條件的乳腺癌患者為研究對象，采用RTPCR技術，聯合檢測外周血中CK19mRNA、VEGFmRNA和hMAMmRNA的表達，觀察新輔助化療前后血微轉移因子變化。結果：本組乳腺癌微轉移因子陽性率在病理分級中差異無顯著性意義(P>0.05);在分期中，分期越高陽性率越高(P<0.05);化療方案可影響微轉移因子陽性率的變化(P<0.01)。結論：通過檢測乳腺癌患者外周血中微轉移因子，有可能成為判斷乳腺癌預后和指導治療的指標。

【關鍵詞】乳腺癌新輔助化療微轉移因子逆轉錄聚合酶鏈反應

NeoadjuvantChemotherapyforPeripheralBloodMicrometastasisFactorsinPatientsofBreastCancerHEGang,etal.NingboNo.2Hospital,Ningbo(315010),China

AbstractObjective:Toexploretheinfluenceofneoadjuvantchemotherapyonperipheralmicrometastasisfactorsinbreastcancer.Methods:CK19mRNA,VEGFmRNAandhMAMmRNAinperipheralbloodof48breastcancerpatientsweredetectedusingRTPCRbeforeandafterneoadjuvantchemotherapy.Results:Nosignificantdifferenceinthebreastmicrometastasisfactorswasnotedindifferentpathologicalstages(P>0.05);thepositiverateofmicrometastasisfactorswashigherinupperclinicalstages(P<0.05).Chemotherapyhadpositiveeffectonmicrometastasisfactors(P<0.01).Conclusion:Thefactorsofperipheralmicrometastasiscouldbetestedforbreastcancerpatients,guidingprognosisandtreatment.

Keywordsbreastcancerneoadjuvantchemotherapymicrometastasisfactorreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)

腫瘤對化療藥物的敏感性一直是近年研究的熱點。NSABPB18試驗隨訪5年的資料證實[1]，檢測外周血微轉移腫瘤細胞，并選擇有效藥物進行治療，是新輔助化療亟待解決的問題。筆者選擇細胞角蛋白19(CK19)、血管內皮生長因子(VEGF)和人乳腺球蛋白(hMAM)作為乳腺癌外周血微轉移因子進行聯合檢測研究，探討新輔助化療對微小轉移灶檢測的方法和臨床意義。

1臨床資料

選擇2006年4月～2009年3月具備新輔助化療條件的乳腺癌患者48例，年齡35～78歲，平均47.6歲。病理分期：I～II期17例，III期31例;病理分級：浸潤性低分化腺癌27例，浸潤性中、高分化腺癌21例。

2方法

2.1新輔助化療方法48例采用CAF方案行新輔助化療23例，予環磷酰胺600mg,第1天，氟尿嘧啶500mg,第1天，多柔比星60mg,第1天，兩周方案;第1天采用AT方案行新輔助化療25例，予紫杉醇160mg，第1天，表柔比星60mg，第1天，兩周方案。分別于新輔助化療前第1天和化療結束后第7天檢測外周血中相關基因標志物微轉移因子的表達水平。48例患者之前均未行任何治療。

2.2檢測方法化療前和化療后分別取外周靜脈血10ml，棄去采血針抽取的前2ml血，以減少標本被皮膚細胞污染可能，隨后取8ml分別加入四支含EDTA的抗凝管中，充分搖勻，以PBS稀釋后，采用淋巴細胞分離液離心，收集淋巴細胞和單核細胞層，洗滌后移至EP管，70℃凍存備提取RNA用。

2.2.1儀器、試劑與引物PersonalCycler型PCR儀(德國Biometra公司);GelDoc型凝膠成像分析系統(美國Biorad公司);RNA提取試劑盒和RTPCR試劑盒(Takara公司);引物(上海英駿生物技術有限公司)。VEGFC上游引物：5’GCATGAACACCAGCACGAG3’;下游引物：5’ATGAAGGGACACAACGACAC3’，擴增產物為717bp片段。CKl9上游引物：5’GCGACTACAGCCACTACTACAC3’;下游引物：5’GAACCAGGCTTCAGCATCC3’，擴增產物為440bp片段。11MAM上游引物：5’CCGACAGCAGCAGCCTCAC3’;下游引物：5’TCCGTAGTTGGTTTCTCAC3’，擴增產物為338bp片段。內參照βactin上游引物：5’AGAAGGATTCCTATGTGGGCG3’;下游引物：5’AAGCATTTGCGGTGGACG3’，擴增產物為979bp片段。

2.2.2RNA提取及鑒定取出保存的單核細胞標本，按RNA提取試劑盒中的操作說明書提取總RNA，并根據(A260A320)×稀釋倍數×0.04μg/μl值計算RNA的濃度，以A260/A280判定其純度。

2.2.3RTPCR反應按照RTPCR試劑盒操作，βactin分別與VEGF、CK19和hMAM進行同管擴增，PCR產物用1%瓊脂糖電泳后，進行凝膠成像分析，并根據VEGF/βactin、CKl9/βactin和hMAM/βactin分別計算各自的相對表達量。

2.2.4產物鑒定凝膠成像系統觀察，本組VEGF、CK19和hMAM均在內參照擴增產物片段處出現清晰條帶，證實RNA無降解和反應體系適當。各自對應的預期產物片段出現清晰陽性條帶為待測標本陽性，否則為陰性。本組擴增產物在相應擴增產物片段處顯示清晰陽性條帶。

2.3統計學分析應用SPSSl5.0統計軟件，采用χ2檢驗及回歸分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1化療前微轉移因子測定低分化腺癌微轉移因子檢測總陽性率85%(23/27)，其中hMAM陽性率51.8%，與VEGF和CK19陽性率比較差異有顯著性意義(P<0.01);中、高分化腺癌檢測總陽性率76%(16/21)。微轉移因子陽性率在病理分級中差異無顯著性意義(P>0.05)。病理分期Ⅲ期者微轉移因子檢測總陽性率87.1%(27/31)，明顯高于I～II期的52.9%(9/17)，表明微轉移因子與乳腺癌分期有關，即分期越高陽性率越高，兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)，見表1。表1化療前外周血微轉移因子表達檢測結果例

3.2新輔助化療對微轉移因子的影響見表2。表2化療前后外周血微轉移因子變化

4討論

臨床研究證實，乳腺癌是全身性疾病，血行播散是乳腺癌轉移的途徑之一，檢測血循環中微轉移因子并給予有效治療是決定預后的重要因素。RTPCR是一種較為敏感的檢測技術，能快速擴增腫瘤細胞內特異性的mRNA表達，并可在107個單核細胞檢出1個克隆和10個乳腺癌細胞，其靈敏度可達(2～5)×107，并預示腫瘤的微小轉移[2]。抽取外周血比抽取骨髓方便,且易被患者接受。筆者采用RTPCR技術以腫瘤特異性CK19、VEGF和hMAM為靶RNA，檢測乳腺癌患者外周血微轉移因子并結合新輔助化療探討其臨床意義。

用于乳腺癌微轉移指標的RNA主要有組織特異性mRNA，如細胞角蛋白19、血管內皮生長因子(VEGF)、多形上皮黏蛋白的核心蛋白、人乳球蛋白(hMAM)和癌胚抗原等[3]。聯合其中的2～3項進行檢測，可提高檢出率，減少假陰性。因此，篩選乳腺組織特異性標志基因是提高微轉移檢測可靠性的關鍵。

本組結果顯示，48例化療前乳腺癌外周血中CK19、VEGF和hMAM表達總陽性率分別為為39.5%、47.9%和68.7%，其中低分化癌組中的hMAM陽性率為51.8%。文獻報道[4],hMAM表達總陽性率為53.3%，VEGF在III期中的表達為35.5%。本組檢出陽性率低于DeLuca等[5]報道的表皮生長因子受體mRNA在轉移性腫瘤中的檢出率59%。血液中陽性高度提示腫瘤組織中的表達，因此其有可能作為預后評價和輔助治療選擇(尤其針對表皮生長因子受體蛋白的單抗)及治療監測的指標。Stathopoulou等[6]用RTPCR檢測I、II期乳腺癌患者輔助治療前外周血的CK19mRNA陽性率為30%(本組為29.4%)，認為CK19mRNA檢出與無瘤生存率和總生存率相關，是判斷預后的獨立指標。張新麗等[7]對血液中檢出微轉移陽性率統計學分析，0～I、II、III期之間有顯著差異(P<0.05)，顯示血液微轉移與腫瘤分期密切相關。本組結果顯示，微轉移因子陽性率在病理分級中無顯著性差異(P>0.05)，而分期越高陽性幾率越大，兩者比較有顯著性意義(P<0.05)。

筆者在對血液微轉移因子檢測的同時，選擇了具有代表性的化療方案和治療周期。1994年美國FDA批準紫杉醇用于治療復發轉移的乳腺癌，2000年批準用于早期乳腺癌術后的輔助治療。研究結果顯示[8]，含紫杉醇組的5年無病生存率(DFS)和總生存率(0S)均有顯著改善，復發風險降低17%(P=0.0023)，死亡風險下降18%(P=0.0064)，從而確定了紫衫醇在早期乳腺癌治療中的地位。筆者選擇經典的CAF和AT方案，實行2周給藥，觀察新輔助化療后血液中微轉移因子的變化。結果顯示，化療前微轉移因子陽性率在化療后均有不同程度降低。

化療前后的分子生物學檢測是反映腫瘤生物學特性的指標，化療后這些指標可能發生變化。若在治療前能獲得這些生物學信息，對判定預后和擬訂治療方案至關重要[9]。隨著檢測藥物療效的生物學指標研究的深入，以及不斷探索、開發有效化療方案和藥物，合理應用新輔助化療這一手段，可為患者選擇高效的個體化治療方案提供可靠依據。

【參考文獻】

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3韓正祥，張敬川.hMAMmRNA和CEAmRNARTPCR檢測乳腺癌外周血微轉移.腫瘤，2004，24(3)：273275

4AnnaF，JadwigaK，PaulinaK，etal.Detectionofcirculatingbreastcancercellsinperipheralbloodbyatwo2markerreversetranscriptasepolymerasechainreactionassay.ActaBiochimicaPolonica，2004，51(3)：747749

5DeLucaA，PignataS，CasamassimiA，etal.DetectionofcirculatingtumorcellsincarcinomapatientsbyanovelepidermalgrowthfactorreceptorreversetranscriptionPCRassay.ClinCancerRes，2000，6(4)：14391444

6StathopoulouA，VlachonikolisI，MavroudisD，etal.Moleculardetectionofcytokeratin19positivecellsintheperipheralbloodpfpatientswithoperablebreastcancer：evaluationoftheirPrognosticsignificance.JClinOncol，2002,20(16)：34043412

7張新麗，劉希光，張明賓,等.乳腺癌患者外周血CK19mRNA檢測對輔助化療有效性監測的臨床研究.泰山醫學院學報，2008，(29)2：104106

8MamounasEP,BryantJ，LemberskyB，etal.PaclitaxelafterdoxorubicinPluscyclophosphamideasadjuvantchemotherapyfornodepositivebreastcancer：resultsfromNSABPB28.JClinOncol，2005，23(16)：36863696.

9和鋼，張樂鳴.乳腺癌新輔助化療及微轉移檢測.國際腫瘤學雜志,2006,(33)10：769771