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【摘要】目的設(shè)計(jì)和制備地塞米松磷酸鈉（dexamethasonesodiumphosphate,DSP）溫度敏感原位凝膠，為其局部應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法優(yōu)選處方，考察各種附加劑對(duì)膠凝溫度的影響，調(diào)節(jié)基質(zhì)濃度以得到適宜的膠凝溫度。采用差示掃描量熱法（DSC）考察膠凝過程的熱效應(yīng)。結(jié)果確定以泊洛沙姆407為基質(zhì)制備DSP溫敏凝膠，得到優(yōu)化處方：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為14.1%的泊洛沙姆407，0.2%的透明質(zhì)酸，10%的甘油，15%的丙二醇和2%的DSP。DSC測(cè)得其膠凝溫度為26℃，而且膠凝過程熱效應(yīng)極低，焓變值為0.032J·g-1·K-1。結(jié)論制備的DSP溫敏凝膠在室溫下為流體，在體溫條件下可發(fā)生相變成為凝膠，值得進(jìn)一步開發(fā)研究。

【關(guān)鍵詞】溫度敏感原位凝膠；地塞米松磷酸鈉；泊洛沙姆407

Abstract:ObjectiveTodesignandpreparedexamethasonesodiumphosphate(DSP)loadedthermosensitiveinsitugel,andprovidescientificinformationforclinicalapplication.MethodsSelectionofdifferentmaterialsandtheirinfluenceongelationtemperature(GT),wereevaluated.DifferentGTcouldbeobtainedbyadjustingtheconcentrationofpoloxamer407.Heatingcurveofgelationprocesswasinvestigatedbyemployingdifferentialscanningcalorimetery(DSC).ResultsPoloxamer407wasadoptedasgelbasetoprepareDSPgel.Theoptimizedformulationwascomposedof14.1%poloxamer407,0.2%hyaluronicacid,10%glycerin,15%propyleneglycoland2%DSP.GToftheformulationwas26℃byDSC.AndtheDSCresultdisplayedthatdeltaCp*was0.032J·g-1·K-1,whichindicatedpackingofmicellesandmicelleentanglementsmaybepossiblemechanismsofpoloxamersolutiongelationwithincreasedtemperature.ConclusionTheoptimizedformulationisfreeflowingliquidbelowroomtemperatureandconvertedtoagelunderthephysiologicalcondition,whichhaspotentialbenefitsoftherapy.

Keywords:thermosensitiveinsitugel;dexamethasonesodiumphosphate;poloxamer407

原位系統(tǒng)是指可注射的液體以對(duì)人體極小損傷方式給藥后，可在需要的組織、器官或體腔內(nèi)發(fā)生相變立即固化或膠凝。其中，溫度調(diào)節(jié)機(jī)制的原位凝膠在實(shí)際應(yīng)用中比較有利：利用人體溫度與環(huán)境溫度的差異，既能注射給藥，又可在生理溫度下形成凝膠，并在所需的時(shí)間內(nèi)保持完整，而不需要有機(jī)溶劑、聚合交聯(lián)試劑以及其他外在因素觸發(fā)膠凝［1,2］。因此，已在各種給藥途徑得到廣泛應(yīng)用，如可通過注射植入到皮下，形成埋植型藥物控制釋放系統(tǒng)；也可制成腔道給藥的液體栓劑，使載藥基質(zhì)與多褶皺的粘膜組織緊密結(jié)合，為藥物快速釋放和更好地發(fā)揮療效創(chuàng)造條件。類固醇激素已廣泛用于治療多種疾病，目前應(yīng)用以大劑量全身給藥為主，而且用藥時(shí)間長(zhǎng)，這極大增加了藥物的全身毒性，因而局部應(yīng)用將是更安全有效的方式。本研究選用類固激素地塞米松磷酸鈉（dexamethasonesodiumphosphate,DSP）為模型藥物，制備溫度敏感原位凝膠，為其在臨床上的局部使用奠定實(shí)踐基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1.1儀器

Agilent1100LC（美國(guó)）；NETZSCHDSC204差示掃描量熱儀（德國(guó)）；恒溫磁力攪拌器852型（上海司樂儀器有限公司）；不銹鋼手提式壓力消毒器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2試藥

DSP原料（質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.3％，天津天藥藥業(yè)股份有限公司贈(zèng)送）；DSP對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；泊洛沙姆407（PluronicF127，P407，Sigma公司）；透明質(zhì)酸（MW≥1.20×106，山東福瑞達(dá)生物化工有限公司贈(zèng)送）；注射用甘油（汕頭紫光古漢氨基酸有限公司）；甲醇為色譜純，水為超純水。其他試劑均為分析純。

2方法和結(jié)果

2.1膠凝溫度（gelationtemperature，GT）的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［3］，西林瓶中盛有待測(cè)溶液和磁力攪拌子，插入溫度計(jì)。將西林瓶放入冰水浴中，開啟電磁攪拌，使水浴持續(xù)緩慢升溫。磁力攪拌子完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)的溫度即為GT，平行測(cè)定3次，取平均值。

2.2基質(zhì)的篩選

曾以甘油明膠、淀粉甘油、明膠、果膠為基質(zhì)，加熱后雖可成粘度較低的溶液，但需冷卻至體溫以下才能成凝膠。而且，加熱后注射，不僅使用不方便，也會(huì)對(duì)注射部位造成損傷。而P407具有受熱反向膠凝的性質(zhì)，即較低溫度時(shí)為澄清溶液，可自由流動(dòng)，但過了一定溫度后粘度迅速增加，流動(dòng)性迅速降低，很快轉(zhuǎn)變成半固體透明凝膠；并且該凝膠可在固液兩相間互變，當(dāng)溫度降低后又可轉(zhuǎn)變成澄明溶液。因此，確定以泊洛沙姆407為基質(zhì)。

2.3處方設(shè)計(jì)

2.3.1保濕劑和防腐劑

以水分損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，單因素考察各種保濕劑乳酸、山梨醇、甘油、1,2丙二醇、聚乙二醇400和透明質(zhì)酸的保濕效果。分別配制含上述10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以下同）保濕劑的16%P407，稱重記為G1；置于37℃水浴7天，取出稱重記為G2。計(jì)算水分損失率（（G1－G2）×100%/G1），結(jié)果見表1。由表可知，甘油保濕效果最好，因此選擇甘油作為保濕劑。

表1含不同保濕劑P407的水分損失率（略）

Tab.1WaterlossofP407includingdifferentingredients(n=3)

1,2丙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15%以上有抑菌作用，而且還可作為穩(wěn)定劑，抑制DSP的水解［4］。因此，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的1,2丙二醇作為防腐劑和穩(wěn)定劑。

2.3.2粘膜粘附性聚合物透明質(zhì)酸濃度的確定

分別考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.1%，0.2%，0.3%）的透明質(zhì)酸對(duì)P407溶液流動(dòng)性和通針性的影響。結(jié)果表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.3%，溶液黏連。綜合考慮制劑的粘附性和流動(dòng)性，選定透明質(zhì)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%。

2.3.3P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

2.3.3.1P407不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的膠凝溫度分別以水和PBS為介質(zhì)，加入不同量的P407，攪拌使其分散均勻，置于4℃冰箱中保存至完全溶解從而得到不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的P407，測(cè)定其膠凝溫度，結(jié)果見圖1。

圖1分別以水或PBS為介質(zhì)的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)P407膠凝溫度（略）

Fig.1Thegelationtemperatureasafunctionofpoloxamer407concentrationsinpurewaterorPBS

結(jié)果表明，P407的膠凝溫度具有濃度依賴性，可調(diào)節(jié)P407濃度以得到適宜的膠凝溫度。而且，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)P407溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于15％時(shí)，即使不斷加溫也只形成稠厚溶膠而不能完全膠凝。

2.3.3.2處方中各組分對(duì)膠凝溫度的影響單因素考察處方中各組分對(duì)P407膠凝溫度的影響。由于地塞米松人用劑量為每日幾十毫克，因此凝膠中DSP質(zhì)量分?jǐn)?shù)定為2%。以PBS為介質(zhì)，分別加入甘油、丙二醇、HA、DSP，配制含10%甘油、15%丙二醇、0.2%HA、2%DSP的同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)（16%）P407溶液，分別測(cè)定膠凝溫度，結(jié)果見表2。

表2含不同附加劑的P407膠凝溫度（略）

Tab.2Thegelationtemperatureofpoloxamer407solutionincludingdifferentingredient(n=3)

結(jié)果表明，加入甘油、丙二醇、透明質(zhì)酸，可降低溫度敏感凝膠的膠凝溫度；而加入藥物DSP能升高其膠凝溫度。

2.3.3.3P407濃度的確定以PBS為介質(zhì)，加入甘油、丙二醇、透明質(zhì)酸和DSP，分別加入不同量P407，攪拌使其分散均勻，置于4℃冰箱中保存直至完全溶解，從而得到不同濃度的P407，測(cè)定其膠凝溫度，結(jié)果見圖2。

圖2不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)P407的膠凝溫度（略）

Fig.2Thegelationtemperatureasafunctionofpoloxamer407concentrations

結(jié)果表明，P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于14.0%，不能完全膠凝。選擇P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.0%和14.1%的處方在培養(yǎng)箱（37℃）中放置，分別于5d，10d后取出觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14.0%的會(huì)軟化，有些部分液化。因此，P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為14.1%。

2.4DSPHPLC測(cè)定方法的建立

色譜條件：以甲醇-0.02mol/LKH2PO4（磷酸調(diào)pH至4.0）（體積比55∶45）為流動(dòng)相，色譜柱為DikmaDiamonsil－C18（4.6mm×150mm，5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，柱溫30℃，流速1mL·min-1。在該條件下，空白凝膠對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

樣品的處理方法：精密稱取DSP凝膠0.2g，加水稀釋，定容于100mL容量瓶中。精密量取5mL至10mL容量瓶，加甲醇至刻度，定容。微孔濾膜（0.45μm）濾過，取濾液進(jìn)樣測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=1.121X+0.978，r=0.9997(n=5)，進(jìn)樣量在52.0～832.0ng范圍內(nèi)。日內(nèi)與日間精密度分別為0.89%～1.72%和0.88%～1.89%,方法回收率為98.48%～101.82%。

2.5工藝研究

按處方制備3批DSP溫敏凝膠，采用熱壓滅菌（0.1MPa，121℃，20min）。各取滅菌前后凝膠適量，測(cè)定其膠凝溫度；HPLC測(cè)定DSP含量，計(jì)算滅菌前后DSP含量比值，結(jié)果見表3。

表3滅菌對(duì)DSP溫敏凝膠藥物含量和膠凝溫度的影響（略）

Tab.3TheresultsofDSPgelundersterilization

結(jié)果表明，在滅菌條件下制劑穩(wěn)定性較好，DSP含量基本不變；膠凝溫度略有升高（約0.5℃）。

最終確定DSP溫敏凝膠制備工藝：將DSP加入到磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中，攪拌溶解。加入粘附劑、保濕劑和防腐劑，攪拌使其分散溶解。然后加入P407，攪拌使其分散均勻，置4℃冰箱中保存，直至聚合物完全溶解得到澄明溶液。將制得的溶液再經(jīng)121℃熱壓滅菌20min，即得。

2.6膠凝過程熱效應(yīng)的測(cè)定

精密稱取DSP溫敏凝膠樣品（No.1）11.196mg置于密閉的鋁制坩鍋中，以空坩鍋?zhàn)鰠⒈龋瑴y(cè)定DSC圖譜（溫度范圍：10～40℃；升溫速率：10℃/min；氮?dú)獗Ｗo(hù)：50mL·min-1），結(jié)果見圖3。

圖3DSP溫敏凝膠相變過程的DSC圖譜（略）

Fig.3DSCheatingcurveofphasetransition

當(dāng)膠凝由溫度誘發(fā)時(shí)，從差示掃描量熱法得到的加熱過程中的吸熱峰可以確定膠凝溫度和焓變［5］。由圖可見，DSP溫敏凝膠膠凝焓變值為0.032J·g-1·K-1，吸熱峰的溫度即膠凝溫度為26.58℃，與觀察攪拌子轉(zhuǎn)動(dòng)方法測(cè)得結(jié)果一致。

3討論

3.1關(guān)于溫度敏感原位凝膠的設(shè)計(jì)

溫度敏感原位凝膠藥物傳遞系統(tǒng)融合了液體制劑和凝膠制劑的優(yōu)點(diǎn)，溶膠-凝膠的相變特性使該系統(tǒng)適合注射給藥或填充體腔。適宜的膠凝溫度對(duì)于溫敏凝膠的應(yīng)用具有重要意義。調(diào)節(jié)溫度敏感原位凝膠的膠凝溫度需從使用方便和在體膠凝能力綜合考慮。一方面，溫敏凝膠在體外需為具有較好流動(dòng)性的液體，膠凝溫度必須低于體溫。但若膠凝溫度過低，需冷藏后才能使用，而且低溫對(duì)組織也會(huì)產(chǎn)生刺激，由此造成順應(yīng)性不佳；另外從生產(chǎn)工藝角度考慮，過低的膠凝溫度也會(huì)給凝膠的制備帶來(lái)困難。另一方面，還要求溫敏凝膠在體溫作用下能立即膠凝，并在該溫度下保持半固態(tài)。本研究篩選不同基質(zhì)，應(yīng)用各種輔料改善凝膠性質(zhì)，按優(yōu)化處方制得具有適宜膠凝溫度的DSP溫敏凝膠，在低于室溫（26℃）條件下為流體，體溫時(shí)形成凝膠，可滿足局部注射給藥和在體膠凝的要求，值得進(jìn)一步研究。

3.2關(guān)于膠凝溫度的測(cè)定

采用觀察攪拌子轉(zhuǎn)動(dòng)方法測(cè)定膠凝溫度時(shí)，緩慢的升溫速率、均勻的熱傳導(dǎo)和相對(duì)恒定的攪拌條件是保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、精密的重要因素，升溫過快則測(cè)得的膠凝溫度偏高，熱傳導(dǎo)不均勻和攪拌條件的改變會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較差。因此，所有樣品膠凝溫度的測(cè)定需在接近恒定的升溫速率、相同的玻璃器壁厚度和保持?jǐn)嚢枳愚D(zhuǎn)速、形狀及大小一致的條件下進(jìn)行。DSC分析為膠凝溫度的測(cè)定提供了一種更加客觀、精確的方法，結(jié)果表明該方法得到的膠凝溫度與觀察攪拌子轉(zhuǎn)動(dòng)方法測(cè)得結(jié)果一致。因此，在設(shè)計(jì)溫敏凝膠的處方工藝時(shí)，可采用更簡(jiǎn)便的肉眼觀察方法來(lái)判定膠凝溫度。

3.3關(guān)于P407和附加劑的選用

泊洛沙姆具有良好的耐受性，一般認(rèn)為無(wú)毒，能被腎和膽汁排泄。其水溶液具有受熱反向膠凝的性質(zhì)，其中P407的膠凝溫度比泊洛沙姆系列的其他都低，在當(dāng)前上市的藥品中已作為輔料使用，因此選用P407為凝膠基質(zhì)。凝膠進(jìn)入體內(nèi)后，所處環(huán)境溫度在37℃左右，為保持凝膠形態(tài)防止變干，需加入保濕劑，經(jīng)篩選選用甘油。由于制劑處方參照注射劑設(shè)計(jì)，因而限制了防腐劑種類的選擇，而1,2丙二醇不僅有抑菌作用，還能起到穩(wěn)定DSP的作用。溫敏凝膠中常需加入粘膜粘附性聚合物以增強(qiáng)制劑的粘附能力使其在體內(nèi)的滯留時(shí)間延長(zhǎng)，提高藥物的局部生物利用度。本實(shí)驗(yàn)所選用的透明質(zhì)酸具有粘膜粘附性，可增強(qiáng)制劑的粘附能力，而且還具有一定的保濕功能。

3.4關(guān)于膠凝溫度的影響因素

泊洛沙姆膠凝機(jī)理常被認(rèn)為是隨著溫度升高膠束間相互纏結(jié)和堆砌的結(jié)果［1,2,6］。P407的膠凝溫度隨P407濃度增大而降低。這可能是因?yàn)闈舛仍礁撸酆衔锼既芤旱捏w積分?jǐn)?shù)就越大，膠束數(shù)量及相互間接觸和纏結(jié)的幾率均增大，因而膠凝溫度呈現(xiàn)濃度依賴性。

以PBS為介質(zhì)的膠凝溫度隨P407濃度的增大，但較介質(zhì)為水時(shí)約低3.5℃（圖1），說明PBS會(huì)降低P407溶液的膠凝溫度。可能是因?yàn)镻BS所含的多種離子（Na+，Cl-，PO3-4等）的鹽析作用，誘發(fā)PEO嵌段脫水，使膠束堆砌更加緊密，降低了臨界膠束濃度和臨界膠束溫度［7］。

加入甘油、丙二醇、透明質(zhì)酸，可降低溫敏凝膠的膠凝溫度。這可能是因?yàn)榧尤氲母视秃捅紨D占了水的體積，而透明質(zhì)酸用量雖少，但其分子量很大，完全水化膨脹后占據(jù)一定的溶液體積分?jǐn)?shù)，這些都使泊洛沙姆濃度相對(duì)增加，導(dǎo)致其膠凝溫度降低。三者混合后膠凝溫度的降低值并不是各種組分的機(jī)械相加，可能是因?yàn)槿吣軌蚧ハ嗳芙猓糠窒嗣糠N組分對(duì)膠凝溫度的影響。加入藥物能升高膠凝溫度，推測(cè)是DSP與泊洛沙姆的PEOPPOPEO發(fā)生相互作用，阻礙了鏈間的交聯(lián)。以上機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

3.5關(guān)于膠凝過程的熱效應(yīng)

采用DSC分析可以測(cè)定膠凝溫度和焓變［5］。有人認(rèn)為高度規(guī)則結(jié)構(gòu)的形成，例如立方水晶，是泊洛沙姆水溶液形成凝膠的動(dòng)力［5,8］。但在泊洛沙姆溶液膠凝過程中僅能夠觀察到極微弱的熱效應(yīng)。由于生成高度有序的結(jié)構(gòu)常伴隨著明顯的能量變化，因此可逆物理交聯(lián)如膠束的互相包裹和糾纏，可能是溫度升高時(shí)泊洛沙姆膠凝的主要機(jī)制［6］。

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