前言：本站為你精心整理了體外循環影響中性粒細胞膜結合彈性蛋白酶范文，希望能為你的創作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

【關鍵詞】體外循環

【摘要】目的探索體外循環前后膜結合彈性蛋白酶（MBE）動力學變化，及MBE與術后炎性反應及組織功能之間可能存在的聯系。方法連續收集10例體外循環下冠狀動脈搭橋手術病人的資料，血樣采集時間為開胸前、主動脈開放后、體外循環結束時、停機后3h和6h、術后第一天。分離血樣中的中性粒細胞，使用底物分析法測定被分離的中性粒細胞的MBE。通過常規實驗方法測定炎性反應和組織功能的生化標記物。結果開放主動脈后，MBE輕度升高，停機時達峰值，在術后第一天恢復到術前水平。與主動脈開放后中性粒細胞在肺內滯留相比，左房與右房血中的MBE沒有差異。MBE或MBE總活性與術后炎性反應標記物如C反應蛋白（CRP）及組織功能標記物如乳酸、肌酸磷酸激酶（CPK）、丙氨酸氨基轉移酶之間均無相關關系。結論體外循環促使中性粒細胞MBE表達，并在停機時達高峰，但與體外循環后炎性反應和組織功能的生化標記物之間沒有特定關聯，提示體外循環中還有其他重要機制參與了術后炎性反應和器官功能障礙的發生。

【關鍵詞】體外循環；中性粒細胞膜結合彈性蛋白酶

EffectofCPBonmembrane-boundelastaseofneutrophils

【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofcardiopulmonarybypass(CPB）onthekineticchangeofmembrane-boundelastase(MBE）anditspossiblelinktothepostoperativeinflammationandorganfunction.MethodsTenconsecutivepatientsundergoneelectivecoronarybypasssurgerywithCPBwererecruitedinthestudy.Bloodsamplesweretakenbeforemediansternotomy,afteraorticdeclmping,attheendofCPB,3hand6hafterCPBandonthefirstpostoperativedayrespectively.MBEwasdeterminedbysubstrateassayfromisolatedneutrophils.Inflammationandorganfunctionmarkersweredeterminedwithroutinelaboratorymethods.ResultsMBEslightlyincreasedafteraorticdeclamping,reachedtoitspeakattheendofCPB,andreturnedtoitspreoperativelevelonthefirstpostoperativeday.Incontrasttolungsequestrationofneutrophilcount,therewerenotranspulmonarygradientofMBEbetweenleftandrightatriumafteraorticdeclamping.NeitherMBEnortotalMBEactivitywaspositivelycorrelatedwiththepostoperativeinflammationmarkerssuchasbloodlactateandC-reactiveproteinandorganfunctionmarkerssuchascreatinephosphokinaseandalanineaminotransferase.ConclusionCPBinducesMBEexpressiononneutrophilswithitspeakattheendofCPB.LackofassociationbetweenneutrophilMBEandclinicalmarkerssuggeststhatmultiplesystemsareinvolvedinthepost-CPBinflammatoryresponseandorgandysfunction.

【Keywords】cardiopulmonarybypass;membrane-boundelastaseofneutrophils

體外循環（CPB）能通過激活循環中細胞與體液成分，引起全身炎性反應綜合征［1，2］。激活的中性粒細胞釋放出的彈性蛋白酶，被認為是能夠降解各種蛋白如彈性蛋白、纖維蛋白、糖蛋白等強有力的蛋白水解酶之一［3］。心內直視手術的病人在轉流中和轉流后，中性粒細胞均能釋放彈性蛋白酶［4～7］，但游離彈性蛋白酶能被體內廣泛存在的蛋白水解酶抑制劑(proteaseinhibitor,PI）迅速結合而失去活性［8］。最近發現，中性粒細胞膜結合彈性蛋白酶(membraneboundelastase,MBE）能抵抗血漿和組織中蛋白水解酶抑制因子的作用［9］，而且結合于中性粒細胞膜上的彈性蛋白酶，在攻擊血管內皮細胞和引起組織損傷方面，較血漿中游離的彈性蛋白酶具有更強的生物活性［10～12］。本研究的目的就是研究心臟手術病人在轉流中和轉流后MBE的動力學變化，并試圖尋找其與術后炎性反應及組織功能變化之間的關系。

1資料與方法

1.1一般資料2004年11月1日～2004年11月30日，連續10例行擇期冠脈搭橋術患者。術前排除標準：（1）存在感染；（2）全血白細胞總數>10000/μl；（3）中性粒細胞計數>7000/μl；（4）紅細胞沉降率>20mm/h；（5）C反應蛋白（CRP）>8mg/L。病人的一般資料見表1。

1.2血樣采集和臨床數據收集于開胸前5min（T0）、體外循環結束時（T3）以及術后第一天8Am（T4）分別抽取橈動脈血15ml,并在主動脈開放后10min從左房（T1）和右房（T2）各抽血15ml。10ml全血用0.2%Na2EDTA溶液0.5ml抗凝后測定MBE，余5ml送檢中性粒細胞計數、血淀粉酶、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、肌酸磷酸激酶（CPK）和CRP。

表1一般資料（略）

臨床血流動力學和呼吸參數分別于術前5min、停機時、停機后3h和6h以及術后第一天8Am收集。血流動力學參數包括心率(HR）、平均動脈血壓(MAP）、左房壓（LAP）和中心靜脈壓（CVP）；呼吸功能參數包括肺順應性（lungcompliance,LC）和彈性氣道阻力(airwayresistance,AR）。

1.3MBE測定

1.3.1中性粒細胞分離10ml全血在4℃下以1500rpm離心10min，收集上層血漿置于-20℃保存。細胞成分用PBS液(phosphatebuffersolution,PBS）按1∶1比例稀釋后待用。將4ml密度為1.1026g/ml的74%Percoll-0.9%NaCl溶液注入一個14ml的聚苯乙烯試管，在其上層小心覆蓋4ml密度為1.0776g/ml的55%Percoll-0.9%NaCl溶液，將4ml稀釋后的血樣覆蓋在最上層。于4℃下以350×g離心20min后，中性粒細胞聚集于兩層不同濃度的Percoll溶液之間。用吸管收集中性粒細胞，加入4℃PBS液洗滌2次，以350×g離心15min后，加入低滲溶液（0.83%NH4Cl，0.0037%Na2EDTA,0.1%KHCO3）,在室溫下孵育5min，溶解殘留的紅細胞。以160×g離心5min，用PBS洗滌后收集中性粒細胞并計數。經Giemsa染色后檢查中性粒細胞的純度，發現純度＞95%，經苔盼藍（0.01%濃度）排除法檢查細胞活力，證明活度＞95%［13］。

1.3.2中性粒細胞膜結合彈性蛋白酶的檢測將分離、收集的中性粒細胞與含有3%（W/V）聚甲醛和1%戊二醛的PBS液在4℃下混合3min，以PBS液洗滌2次，再次計數并用PBS液稀釋至中性粒細胞濃度為2×106/ml，已證明此固定法對MBE的活性沒有影響［9］。MBE活性通過底物分析法測定：取50μl中性粒細胞稀釋液，加入150μl多肽底物溶液［(1mMN-succinyl-(L-alanine）3-p-nitroanilide,200mMTris-HCl,pH=8.0,Sigma,St.Louis,USA）］，37℃下孵育60min后加入5μl冰醋酸結束反應。在405nm下比色，通過不同濃度的標準彈性蛋白酶溶液(Sigma,St.Louis,USA）與底物反應的關系曲線得出MBE活性,此分析法的敏感度可達0.5ng/106中性粒細胞。使用下列公式將測得值轉換成中性粒細胞MBE總活性。

MBE總活性(ng/ml）=MBE（ng/106）×中性粒細胞數量（106/ml）

1.4統計學方法使用成對t檢驗法檢驗各時刻間實驗室和臨床數據有無差異，使用Pearson相關分析檢驗臨床與實驗室指標間關系，數據用平均值加減標準差表示，P<0.05示統計學差異顯著。

2結果

10例患者轉流時間平均(124±35）min,主動脈阻斷時間平均(86±27）min。術后多巴胺最大劑量為(11.8±7.4）μg/kg，腎上腺素最大劑量平均(0.02±0.03）μg/kg，術后第一天8Am前外科引流量平均為(612±300）ml，尿量平均為(116±40）ml/h,病人均康復出院，平均住院(14.3±5.6）天，無明顯的感染、圍手術期心梗或外科出血。

2.1中性粒細胞計數術前中性粒細胞計數為(3720±1039）×106/L，主動脈開放后10min，右房中性粒細胞計數上升至(4950±1964）×106/L（P＜0.05）。右房與左房中性粒細胞計數差異有顯著性，分別為(4950±1964）×106/L及(3600±1761）×106/L（P＜0.05）。體外循環結束以及術后第一天，中性粒細胞計數分別為(9920±4081）×106/L（P＜0.01）及(15340±3139）×106/L（P＜0.01）。

2.2MBE活性和MBE總活性（表2）術前MBE活性為(123.7±62.4）ng/106中性粒細胞。主動脈開放后10min，右房和左房內MBE分別增加至(161±120）ng/106及(160.9±88.7）ng/106，但與術前相比統計學無顯著差異。體外循環結束時，MBE較術前明顯增高，達(205.7±88.0）ng/106（P＜0.01），術后第一天MBE值低于術前水平［（109.6±102.9）ng/106］，但與術前差異無顯著性。MBE總活性受中性粒細胞數量影響較大，主動脈開放后右房與左房內MBE總活性分別為（854±700）ng/ml和（658.3±574.9）ng/ml，與術前相比無明顯差異，心房間差別也不顯著（P=0.318）。體外循環結束時MBE總活性較術前明顯升高，分別為（2129.5±1360.4）ng/ml及（448.0±193.2）ng/ml（P＜0.05）。術后第一天，MBE總活性比術前明顯升高，達（1755.0±1739.0）ng/ml（P＜0.05）。

表2MBE及MBE總活性變化（略）

注：與術前比較采用成對t檢驗*P＜0.05，**P＜0.01

2.3組織功能、生化指標、血流動力學及呼吸動力學變化見表3。術后第一天，CPK、血淀粉酶較術前顯著升高（P＜0.05），術后第一天CRP較術前差異有非常顯著性［（3.25±4.05）mg/L及（77.47±29.83）mg/L］，(P＜0.01）。術后第一天血糖水平較體外循環結束時及術后3h均明顯增加（P＜0.05）。血乳酸水平于體外循環后及術后第一天較術前明顯增加（P＜0.01）。

表3血流動力學、血液生化檢查（略）

注：ND:未檢測；與術前比較采用成對t檢驗*P＜0.05，**P＜0.01

平均動脈壓和左房壓在體外循環前后差異無顯著性。體外循環結束后6h的氣道阻力明顯低于停機后3h。肺順應性在停機后3h和6h沒有明顯差別。使用Pearson相關分析，各時刻MBE總活性和MBE呈正相關(P＜0.05）,未見MBE或MBE總活性與組織功能、生化指標、臨床血流動力學或呼吸功能參數之間有相關關系。

3討論

在體外循環中或結束后所釋放的炎性介質中，被激活的中性粒細胞所釋放的彈性蛋白酶能作用于不同的蛋白底物，它是最強的蛋白水解酶之一。這種酶儲存于中性粒細胞的胞漿顆粒中，體外循環中許多因素諸如肝素抗凝、溫度改變、缺血再灌注等都可以激活中性粒細胞，并促使其釋放彈性蛋白酶和氧自由基等毒性物質對組織造成損傷［14～16］。但體內存在大量血漿型或組織型蛋白水解酶抑制劑(PI），中性粒細胞釋放到血液或組織中游離的彈性蛋白酶與之結合后，其降解蛋白的作用將被抑制。體外循環中血漿彈性蛋白酶與蛋白酶抑制劑復合物在體外循環后數小時內達到高峰，并在術后1周仍保持較高水平［17］。膜結合彈性蛋白酶失去蛋白酶抑制劑結合位點，因此它的活性不受抑制劑的影響，從而能發揮其降解作用［9］。多種細胞因子、內毒素等能誘導中性粒細胞表達膜結合彈性蛋白酶［9～11］。當激活的白細胞與血管內皮細胞黏附時，MBE從中性粒細胞膜上不同部位向中性粒細胞與內皮細胞結合處轉移，繼而水解內皮細胞間的連接蛋白，有助于中性粒細胞完成向血管外的“游走過程”,這一機制已被體外趨化實驗模型所證實［10，12］。因此，MBE在中性粒細胞的出血管過程和組織消化過程中起重要作用，但其在體外循環前后的動力學變化及作用機制仍不為人們所知。

本研究中，我們觀察到從體外循環開始至升主動脈開放前，MBE保持在較低水平，體外循環結束時，MBE快速達到高峰，在術后第一天，又回到術前水平。與血漿中彈性蛋白酶-PI復合物的動力學相比，MBE變化時間短，上升和下降的速率快，這一特點使之能更敏感地反映體外循環對中性粒細胞的影響。體外循環后，大量白細胞從骨髓和邊緣池進入血循環，但MBE在術后第一天即回至術前水平，說明新釋放的白細胞沒有MBE異常表達(圖1，表4）。

圖1體外循環前后體循環中性粒細胞數量和MBE活性的動態變化（略）

T0：手術前；T1：主動脈開放后10min；T2：體外循環結束；T3：手術后第一天。使用配對t檢驗與T0時刻比較*P<0.05，**P<0.01

表4體外循環前后體循環中性粒細胞數量和MBE活性的動態變化（略）

肺對白細胞的扣押是體外循環激活白細胞后的現象［18］。文獻顯示，開放主動脈后，左房內氧自由基濃度較右房高，提示肺血管參與了中性粒細胞的激活［18］。本研究中，我們曾假設左房內MBE活性比右房高，然而，結果顯示在左房和右房內的MBE活性沒有差別，這提示肺在誘導MBE表達方面作用甚微（圖2，表5）。

圖2主動脈鉗開放后10min左房和右房中性粒細胞數量和MBE活性（略）

RA:右房;LA:左房。右房和左房差異使用配對t檢驗，*P<0.05

表5主動脈鉗開放后10mins左房和右房中性粒細胞數量和MBE活性（略）

與MBE相比，MBE總活性真正反映了體內MBE總量。基于上述MBE在中性粒細胞的出血管過程和組織消化過程中所起的重要作用，MBE總活性的改變應與組織損傷生化標記物、器官功能參數變化相一致，MBE總活性減少應伴隨諸如C反應蛋白、肌酸磷酸激酶、血淀粉酶等生化標記物的減少及心、肺功能參數趨向好轉，但在本研究中未發現這種緊密相關關系。這提示在體外循環導致的炎性反應和組織損傷中，除膜彈性蛋白酶外，尚有其他重要機制參與了這一過程。

4結論

體外循環可誘導中性粒細胞膜上的MBE表達增加，MBE變化時間短，上升和下降的速率快，能更敏感反映體外循環對中性粒細胞的影響。經過肺循環的中性粒細胞，其膜上MBE的表達沒有改變，提示肺在誘導MBE表達方面作用甚微。MBE在中性粒細胞的出血管過程和組織消化過程中起著重要作用，但MBE和MBE總活性與CRP等無明顯相關，提示在體外循環導致的炎性反應和組織損傷中，除膜彈性蛋白酶外，尚有其他重要機制參與了這一過程。

【參考文獻】

1KirklinJK,WestabyS,BlackstoneEH,plementandthedamagingeffectsofcardiopulmonarybypass.JThoracCardiovascSurg，1983，86:845-857.

andysfunctionaftercardiopulmonarybypass.Asystemicinflammatoryreactioninitiatedbytheextracorporealcircuit.IntensCareMed，1987，13:89-95.

3WeissmannG,SmolenJE,KorchakHM.Releaseofinflammatorymediatorsfromstimulatedneutrophils.NewEnglJMed，1980，303:27-34.

4HashimotoK,MiyamotoH,SuzukiK,etal.Evidenceoforgandamageaftercardiopulmonarybypass.Theroleofelastaseandvasoactivemediators.JThoracCardiovascSurg，1992，104:666-673.

5ButlerJ,PillaiR,RockerGM,etal.Effectofcardiopulmonarybypassonsystemicreleaseofneutrophilelastaseandtumornecrosisfactor.JThoracCardiovascSurg,1993,105:25-30.

6SchwartzJD,ShamamianP,SchwartzDS,etal.Cardiopulmonarybypassprimespolymorphonuclearleukocytes.JSurgRes,1998,75:177-182.

7FaymonvilleME,PincemailJ,DuchateauJ,etal.Myeloperoxidaseandelastaseasmarkersofleukocyteactivationduringcardiopulmonarybypass.JThoracCardiovascSurg,1991,102:309-317.

8TravisJ.Structure,function,andcontrolofneutrophilproteinase.AmJMed,1998,84:37-42.

9OwenCA,CampbellMA,SannesPL,etal.Cellsurface-boundelastaseandcatepsinGonhumanneutrophils:anovel,non-oxidativemechanismbywhichneutrophilsfocusandpreservecatalyticactivityofserineproteinases.JCellBiology,1995,131:775-789.

10CepinskasG,SandigM,KvietysPR.PAF-inducedelastase-dependentneutrophiltransendothelialmigrationisassociatedwiththemobilizationofelastasetotheneutrophilsurfaceandlocalizationtomigrationfront.JCellSci,1999,112:1937-1945.

11OwenCA,CampbellMA,BoukedesSS,etal.Cytokinesregulatemembrane-boundleukocyteelastaseonneutrophils:anovelmechanismforeffectoractivity.AmJPhysiol,1997,272:385-393.

12HermantB,BibertS,ConcordE,etal.Identificationofproteasesinvolvedintheproteolysisofvascularendotheliumcadherinduringneutrophiltransmigration.JBiolChem,2003,278:14002-14012.

13HjorthR,JonssonAK,VretbladP.ArapidmethodforpurificationofhumangranulocytesusingPercoll.Acomparisonwithdextranesedimentation.JImmunolMethods,1981,43:95-101.

14PiconeAL,LutzCJ,FinchC,etal.Multiplesequentialinsultscausepost-pumpsyndrome.AnnThoracSurg,1999,67:978-985.

15GuYJ,SchoenP,TigchelaarI,etal.Increasedneutrophilprimingandsensitizationbeforecommencingcardiopulmonarybypassincardiacsurgicalpatients.AnnThoracSurg,2002,74:1173-1179.

16YurewiczEC,ZimmermanM.CytechalasinB-dependentreleaseofazurophilgranuleenzymesfromhumanpolymorphonuclearleukocytes.Inflammation,1977,2:259-264.

17RiegelW,SpillnerG,SchlosserV,etal.Plasmalevelsofmaingranulocytecomponentsduringcardiopulmonarybypass.JThoracCardiovascSurg,1998,95:1014-1019.

18RoystonD,FlemingJS,DesaiJB,etal.Increasedproductionofperioxidationproductsassociatedwithcardiacoperations.Evidenceforfreeradicalgeneration.JThoracCardiovascSurg,1986,91:759-76