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【關(guān)鍵詞】肝腫瘤;放射療法;抗VEGF單抗;放射增敏

Radiosensibilityofhumanhepatocellularcarcinomaxenograftsenhancedbyantivascularendothelialgrowthfactormonoclonalantibody

【Abstract】AIM:Toinvestigatetheinhibitingeffectsofcombiningantivascularendothelialgrowthfactor(VEGF)monoclonalantibody(mAb)therapywithradiotherapyonthegrowthofhepatocellularcarcinomaxenograftsinvivo.METHODS:Humanhepatocellularcarcinomacellline,SMMC7721,wasimplantedscinmice.Themicewithxenograftsweredividedinto4groups,radiation(RT)20Gygroup,RT20GyplusmAbgroup,RT30GyplusmAbgroupandcontrolgroup.AntiVEGFmAbwasinjectediponalternatedaysforatotalof6injectionsatadosageof50μg/mouse.Singleradiationdosesweregiven24hafterthe4thinjectionofmAb.Tumordiametersweremeasuredandtumorvolumewascalculated.Miceweresacrificed2wkafterthe6thinjectionandtheintratumoralmicrovesseldensitywasdeterminedbycountingthestainedvesselswithimmunohistochemistry.RESULTS:Radiationsignificantlyreducedthegrowthandthemicrovesseldensityoftumors.TheinhibitoryeffectsweremoresignificantwhenradiationwascombinedwithantiVEGFmAb,andRT30GyplusmAbwasmoreeffectivethanRT20GyplusmAb.ForRT20Gygroup,RT20GyplusmAbgroupandRT30GyplusmAbgroup,theinhibitoryratesoftumorweightwere75.3%,83.9%and94.7%,respectively.CONCLUSION:AntiVEGFmAbenhancestheradiosensibilityofhumanhepatocellularcarcinomaxenografts.Thestrategyisoneoftheapproachesforhepatocellularcarcinomatreatment.

【Keywords】hepatocellularcarcinoma;radiotherapy;antiVEGFmAb;radiosensibility

【摘要】目的:觀察抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體(VEGFmAb)與不同劑量放射聯(lián)合對(duì)肝癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用.方法:將SMMC7721肝癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下,成瘤動(dòng)物分為單純放射20Gy組、放射20Gy+抗體組、放射30Gy+抗體組和對(duì)照組,腹腔給予抗VEGFmAb50μg/只，隔日1次,共6次,放射劑量一次性給予.測(cè)量腫瘤直徑并計(jì)算瘤體積,抗體給藥結(jié)束后2wk處死動(dòng)物,免疫組化法測(cè)腫瘤微血管密度(MVD).結(jié)果:放射能抑制腫瘤生長(zhǎng),減少腫瘤MVD,放射與抗體結(jié)合對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更顯著，且放射30Gy+抗體比放射20Gy+抗體效果更好.單純放射20Gy組、放射20Gy+抗體組和放射30Gy+抗體組的瘤質(zhì)量抑制率分別為75.3%,83.9%和94.7%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.結(jié)論:抗VEGFmAb對(duì)放射治療肝癌移植瘤有增敏作用,是肝癌綜合治療的有效途徑之一.

【關(guān)鍵詞】肝腫瘤;放射療法;抗VEGF單抗;放射增敏

0引言

放射治療腫瘤的目的是盡可能提高腫瘤的放射劑量以殺滅瘤細(xì)胞,但同時(shí)正常組織和器官所受輻射量也相應(yīng)提高,增加了放射治療的副反應(yīng),因而限制了通過(guò)提高放射劑量來(lái)控制腫瘤的作用.肝癌是放射欠敏感腫瘤,而正常肝組織對(duì)放射線(xiàn)較敏感.單純放射治療肝癌的療效并不理想［1］.有報(bào)道［2］抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)抗體可以抑制肝癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng),我們觀察抗VEGFmAb與不同放射劑量聯(lián)合對(duì)肝癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用,以了解兩者聯(lián)合應(yīng)用的機(jī)制與方法.

1材料和方法

1.1材料Balb/cnu/nu小鼠20只(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),5～6wk齡,雄性,體質(zhì)量19.0～22.0g,SPF層流柜分籠飼養(yǎng);SMMC7721人肝癌細(xì)胞株（武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）;MonoclonalantiVEGFantibody,producedinmouse,clone26503.11（Sigma公司）;培養(yǎng)箱（37℃,50mL/LCO2）,倒置顯微鏡(XDP1,上海光學(xué)儀器廠(chǎng)),Varian23EX醫(yī)用直線(xiàn)加速器（美國(guó)）,RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液（含100mL/L胎牛血清,青霉素1×105U/g,鏈霉素100mg/L）,胰蛋白酶,免疫組化SABC法相關(guān)試劑（武漢博士德公司）.

1.2方法

1.2.1癌細(xì)胞培養(yǎng)SMMC7721人肝癌細(xì)胞株于25mL培養(yǎng)瓶中繁殖傳代,細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)瓶壁后移入250mL培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代繁殖,取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰酶消化,2000r/min離心2min,收集細(xì)胞用生理鹽水懸浮,顯微鏡下以細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞密度,生理鹽水定容細(xì)胞密度為2×1010/L.

1.2.2癌細(xì)胞種植參考文獻(xiàn)［3］方法,裸鼠于飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)1d后種植癌細(xì)胞,取裸鼠右后肢大腿外側(cè)皮下為種植點(diǎn),1mL注射器抽取0.2mL細(xì)胞懸液（含4×106個(gè)細(xì)胞）注入種植點(diǎn)皮下.

1.2.3動(dòng)物分組及腫瘤生長(zhǎng)觀察腫瘤種植后1wk,可觀察到全部動(dòng)物有明顯皮下腫塊形成,第10日腫塊直徑約5mm.將動(dòng)物隨機(jī)分為4組,即單純放射20Gy組、放射20Gy+抗體組、放射30Gy+抗體組和對(duì)照組,每組5只.用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫塊長(zhǎng)徑（a）及橫徑（b）,隔日測(cè)量1次,腫瘤體積(V)=a×b2/2.

1.2.4抗體給予及放射治療以0.2μm針式濾器過(guò)濾除菌的PBS液溶解抗VEGFmAb至100mg/L,于腫瘤種植后10d分組后腹腔注射抗VEGFmAb,50μg/只,隔日1次,共6次.單純放射組及對(duì)照組同樣途徑給予等體積量PBS.第4次給予抗VEGFmAb后的第2日行放射治療,放療機(jī)房紫外線(xiàn)消毒,受照動(dòng)物四肢以細(xì)繩固定在小木板上,照射野大小3cm×3cm,源皮距100cm,6MeV電子線(xiàn),劑量率4Gy/min,單純放射組劑量20Gy,放射+抗體組劑量分別為20Gy和30Gy,全部放射劑量一次性給予.

1.2.5瘤體稱(chēng)質(zhì)量抗體給藥結(jié)束后繼續(xù)觀察腫瘤生長(zhǎng)2wk,于腫瘤種植后34d處死動(dòng)物,仔細(xì)分離腫塊周邊皮膚及非腫瘤組織,瘤體稱(chēng)質(zhì)量,瘤質(zhì)量抑制率(%)=（1－實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）×100.

1.2.6免疫組化微血管密度(MVD)測(cè)定將腫瘤組織切成3mm厚片狀,40g/L甲醛固定24h,脫水石蠟包埋,切片厚5μm.免疫組化SABC法:一抗為多克隆兔抗鼠CD34抗體,工作濃度1∶100稀釋.即用型HighSABC免疫組化試劑盒,具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,DAB染色,蘇木素復(fù)染,樹(shù)膠封片.選血管內(nèi)皮細(xì)胞染色密集區(qū)于高倍鏡(×200)下計(jì)數(shù)染色細(xì)胞,每片計(jì)數(shù)5個(gè)視野取平均值.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,應(yīng)用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析處理腫瘤體積變化數(shù)據(jù),多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)處理瘤質(zhì)量抑制數(shù)據(jù)和MVD數(shù)據(jù),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1放射和抗VEGFmAb對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用SMMC7721人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)增殖及傳代能力強(qiáng),裸鼠皮下種植成瘤率高,20只動(dòng)物全部成瘤.種瘤后10d動(dòng)物分組時(shí)各組腫瘤體積無(wú)顯著性差異,放射治療前給予抗體4次,腫瘤生長(zhǎng)呈現(xiàn)減慢趨勢(shì),但與非抗體組差異不顯著.放射治療后,單純放射組及放射20Gy+抗體組腫瘤仍緩慢生長(zhǎng),但放射30Gy+抗體組腫瘤生長(zhǎng)完全被抑制,腫瘤縮小.種瘤后20d單純放射組、放射20Gy+抗體組和放射30Gy+抗體組腫瘤體積顯著小于對(duì)照組,且放射與抗體聯(lián)合組優(yōu)于單純放射組,此顯著性差異一直持續(xù)至動(dòng)物處死(種瘤后34d),放射30Gy+抗體組腫瘤體積小于放射20Gy+抗體組（表1）.

表1放射和抗VEGFmAb對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用(略)

bP＜0.01vs對(duì)照組;cP＜0.05vs單純放射組;eP＜0.05vs放射20Gy+抗體組.

2.2瘤質(zhì)量抑制率和MVD單純放射組、放射20Gy+抗體組和放射30Gy+抗體組在動(dòng)物處死時(shí)的瘤質(zhì)量抑制率分別為75.3%,83.9%和94.7%,均有明顯抑制腫瘤質(zhì)量增長(zhǎng)作用.放射30Gy+抗體組瘤質(zhì)量明顯低于單純放射組和放射20Gy+抗體組.各處理組MVD低于對(duì)照組,放射與抗體聯(lián)合較單純放射組MVD低,MVD在放射20Gy+抗體組與放射30Gy+抗體組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2).

表2瘤質(zhì)量抑制率與微血管密度(略)

bP＜0.001vs對(duì)照組;cP＜0.05vs單純放射組;eP＜0.05vs放射20Gy+抗體組.

3討論

SMMC7721肝癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與人肝癌細(xì)胞特性類(lèi)似［3］,移植瘤生長(zhǎng)迅速,未經(jīng)治療的腫瘤生長(zhǎng)速度快,單純放射治療能延緩其生長(zhǎng)速度,聯(lián)合抗VEGFmAb后抑制腫瘤生長(zhǎng)效果更明顯,但單純放射或放射20Gy加抗體組腫瘤仍呈逐漸加速的生長(zhǎng)趨勢(shì).雖然放射和抗VEGFmAb均能抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng),但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示放射30Gy加抗體是較好的聯(lián)用方式,瘤體生長(zhǎng)停滯并有縮小,對(duì)瘤質(zhì)量和瘤體積的抑制都優(yōu)于低劑量放射組.

放射是以腫瘤細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療措施,通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺滅來(lái)控制其生長(zhǎng).放射在殺滅瘤細(xì)胞的同時(shí)又誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF升高,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞抗拒放射線(xiàn)攻擊,促進(jìn)腫瘤血管形成［4］;或通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞基質(zhì)分解酶活性,增強(qiáng)瘤細(xì)胞的侵襲力［5］,因而放射誘導(dǎo)了腫瘤的保護(hù)機(jī)制,降低瘤細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)的敏感性.抗VEGFmAb抑制VEGF的表達(dá)和血管形成,使腫瘤賴(lài)以生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的血管形成不足,本身具有抗腫瘤作用;又能通過(guò)降低VEGF表達(dá)使血管內(nèi)皮細(xì)胞失去免受放射線(xiàn)攻擊的保護(hù),增強(qiáng)瘤細(xì)胞的放射敏感性,因而抗VEGFmAb與放射起到了協(xié)同抑瘤作用［6］,此協(xié)同作用并不是各自作用的簡(jiǎn)單合并,而是起到了效應(yīng)的放大.

研究表明［7］,抗VEGFmAb的抑瘤作用是暫時(shí)的,停止抗體后腫瘤又會(huì)恢復(fù)原來(lái)的生長(zhǎng)活性.因而抗VEGFmAb須與具有細(xì)胞毒作用的治療措施聯(lián)合才能起到協(xié)同作用［8］.抗VEGFmAb放射增敏的機(jī)制可能比較復(fù)雜,Winkler等［9］發(fā)現(xiàn),抗VEGFmAb能誘導(dǎo)腫瘤血管出現(xiàn)一個(gè)“血管正常化的窗口期”,在此期間內(nèi),腫瘤血管與正常血管功能相似,腫瘤氧水平高,提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)放射的敏感性,因此在窗口期內(nèi)給予放射才能起到協(xié)同抗腫瘤作用.“血管正常化窗口期”出現(xiàn)在抗體治療的1wk左右,我們也選擇這一時(shí)期給予放射治療,收到了預(yù)期的結(jié)果.

血管形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,有多種生長(zhǎng)因子參與其中;放射治療又涉及時(shí)間劑量分割方式的不同,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果只是其中可行性組合之一.放射與抗VEGFmAb聯(lián)合治療肝癌取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果,是肝癌綜合治療方法的一條新思路.

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