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摘要】目的肺炎衣原體抗體(Cpn-PcAb)的制備及。用10μlCpn菌株TW-183(2×108ifu)與300μl福氏完全佐劑混勻后皮下多點注射新西蘭白兔。雙向瓊脂擴散法鑒定血清抗體的效價為1∶64，用硫酸銨鹽析法、DEAE-Sephadex-50層析法純化免疫球蛋白(IgG)，然后用異硫氰酸熒光素(FITG)標記IgG。用Cpn-PcAb與美國進口Cpn-單抗(Cpn-McAb)同時檢測病人外周血標本294例。另外，分別從Cpn-PcAb檢測出Cpn特異性抗原陽性的外周血單核細胞(PBMC)標本(A組)中和對照組(B組)中隨機各挑選20例，用PCR檢測PBMC中的Cpn-DNA。結果Cpn-PcAb檢測的陽性率為45.9%(135/294)，Cpn-McAb檢測的陽性率為43.5%(128/294)，兩種抗體同時陽性的標本有110例，Kappa值是0?7，根據其判斷標準提示兩者有較高的一致性。A、B兩組Cpn-DNA陽性標本分別為17例和3例。結論Cpn抗體幾乎和Cpn單抗一樣有較高的特異性和敏感性，可能可以替代進口單抗用于臨床Cpn感染的檢測，有助于相關疾病的診治。

【關鍵詞】肺炎衣原體多克隆抗體肺炎衣原體單克隆抗體微量免疫熒光外周血單核細胞

Productionandapplicationofpolyclonalantibodytochlamydiapneumoniae

【Abstract】ObjectiveProductionandapplicationofpolyclonalantibodytochlamydiapneumoniae(Cpn).MethodsNewZealandwhiterabbitwassubcutaneouslyinjectedwith10μlCpnstrainTW-183(2×108ifu)and300μlcompleteFreundadjuvant.Theserumantibodytiterof1∶64wasidentifiedbytwodimensionalimmunodiffusiontest.IgGwasextractedfromserumandpurifiedbyammoniumsulphatesaltingoutandDEAE-SephadexA-50chromatography，thenwaslabeledbyfluoresceinisothiacyanate.InordertoevaluteCpn-PcAb，thebloodspecimensof294patientsweredeectedbyCpn-PcAbandCpnmonoclonalantibody(Cpn-PcAb)fromUSAatthesametime.Ontheotherhand，werandomlyselected20peripheralbloodmononuclearcell(PBMC)specimenswithCpnantigenpositive(groupA)and20oneswithCpnantigennegative(groupB)byCpn-PcAbdetection，thendetectedCpn-DNAinPBMCbyPCR.ResultsThepositiveratewas45.9%(135/294)forCpn-PcAband43.5%(128/294)forCpn-McAb，and110caseshavethesamepositiveforthem，showingthehighconcordancebetweenthem(Kappa=0.7).ThespecimensofpositiveCpn-DNAwerein17and3respectivelybetweengroupAandgroupB.ConclusionTheCpn-PcAbhasalmostthesamehighspecificityandsensitivityasCpn-McAb.TheCpn-PcAbmaybereplaceCpn-McAbtodetecttheCpnspecificantigenandbehelpfultodiagnoseandtreattheclinicaldiseasesassociatedwithCpninfection.

【Keywords】polyclonalantibodytochlamydiapneumoniae(Cpn-PcAb)monoclonalantibodytoCpn(Cpn-McAb)micro-immunofluorescenceperipheralbloodmononuclearcell

肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae，Cpn)是嗜衣原體(Chlamydohilapneumoniae)屬下的一個種，是一種常見的呼吸道病原體，帶菌者和隱性感染者非常普遍［1，2］。近年來在多種系統疾病患者血清中檢出的Cpn-抗體均顯著高于相應對照組［3］，如心血管系統、呼吸系統、血液系統疾病等，因此Cpn已成為危害人類健康的一種病原體，尤其是它在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)形成過程中的作用日益受到國內外學者廣泛關注。Cpn感染和AS之間的關系已為血清流行病學、病和分子生物學等實驗技術所證實［4］。筆者亦建立了外周血單個核細胞中Cpn-抗原的檢測方法［5］，并用于臨床檢測，為臨床相關疾病的診治提供可靠依據。但是，檢測Cpn-抗原所用的單抗主要依賴進口，為此筆者嘗試用家兔自制抗Cpn抗體，并已獲得成功，現將結果報道如下。

1材料與方法

1.1兔抗肺炎衣原體抗體的制備用10μlCpn菌株TW-183(2×108ifu)與300μl福氏完全佐劑混勻后皮下多點注射新西蘭白兔(NewZealandwhite，NZW)，在第14、28和42天，用10μlCpn菌株與300μl福氏不完全佐劑混勻后皮下多點注射NZW，用雙向瓊脂擴散法鑒定其抗血清效價＞(1∶64)后，頸動脈插管放血55ml，分離出血清25ml，用硫酸銨鹽析法、DEAE-Sephadex-50層析法逐步純化兔免疫球蛋白(IgG)，用考馬氏亮藍法測其蛋白含量為3.45mg/ml。

1.2肺炎衣原體抗體熒光素結合物的制備將純化的IgG抗體用pH9～9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜，配制異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiacyanate，FITC)二甲亞砜(DMSO)溶液，使終濃度為1mgFITC/1mlDMSO。按50μgFITC/1mgIgG比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中。標記物用pH9～9.5碳酸鹽緩沖液加至2.5ml，再將其裝入透析袋，并放在預冷4℃的碳酸鹽緩沖液中，于4℃暗處磁力攪拌過夜。然后用PBS于4℃暗處透析5次，以除去游離的FITC，直至透析外液與參比溶液PBS在495nm處吸光度一樣。FITC標記物分別在276nm和493nm測定光密度，然后根據圖算出熒光素(F)與蛋白(P)mol比值，合適的F/P比值為2～4。

1.3Cpn-PcAb與Cpn-McAb同時檢測標本復旦大學附屬金山住院患者共294例，其中冠心病、高血壓、心肌梗死、糖尿病等患者109例，肺炎、支氣管炎、哮喘、肺氣腫等患者135例，慢性鼻炎、鼻息肉、鼻竇炎、咽喉炎、扁桃體炎等患者50例。常規無菌采集靜脈血3ml，EDTA抗凝。外周血單核細胞(PBMC)分離參照Moazed等［6］方法略加修改：抗凝血2000rpm離心5min，吸出血漿后的余血用等體積PBS稀釋混勻，再緩慢加到含有3ml淋巴細胞分離液試管中，然后于室溫2200rpm離心30min，吸出含有PBMC的中間云霧狀層，用PBS洗至不含紅細胞后，懸浮于PBS中，使其約含PBMC5×106個。PBMC中Cpn-抗原的檢測參照Timms等［7］方法略加改進：吸取新鮮制備的PBMC懸浮液10μl(約含PBMC6×105個)分別在載玻片上涂出2個直徑4～5mm的圓點，電吹風吹干后丙酮固定3次。其中一個圓點作為空白對照，另一個圓點加上5μlCpn-McAb(FITC-TT-401)稀釋液(工作濃度1∶40，即5μlFITC-TT-401原液+195μl0.01%伊文氏藍PBS)，置濕盒于37℃溫育1h，PBS洗3次，每次3min，再用蒸餾水洗3次，電吹風吹干。同時用自制FITC-Cpn-PcAb進行平行操作。然后將載玻片置熒光顯微鏡下(HB0200汞燈，第一濾片：BG-12，第二濾片：CG-13和WILD8075)由2人觀察并核對大小均勻的特征性蘋果綠亮點。測定圓點內的熒光亮點數減去空白圓點內的熒光亮點數后的差數，作為特異性抗原陽性的依據。陽性對照：Cpn菌株(TW-185)牛奶稀釋液作為抗原，以PBS為陰性對照。抗原陽性判斷標準參照Muhlestain等［8］的標準：強陽性(＞100個亮點/原點)，陽性(10～100個亮點/原點)，陰性(＜10個亮點/原點)。

1.4PCR法檢測外周血單核細胞中Cpn-DNA按筆者已發表的方法進行［9］。1.5%凝膠于5V/cm下電泳1h，在紫外燈下觀察結果，PCR擴增產物為474bp。

1.5統計學處理

1.5.1采用χ2檢測法P＜0.05為差異有顯著性。

1.5.2采用Kappa值判斷兩種方法的一致性強度Kappa值在0.61～0.80，一致性強度屬于高度。

2結果

2.1Cpn抗體效價和交叉反應鑒定應用進口可溶性Cpn-脂多糖(LPS)來鑒定，瓊脂糖雙向免疫擴散結果表明，Cpn抗體效價為1∶64。Cpn抗體與沙眼衣原體-LPS抗原無交叉反應。

2.2Cpn抗體與進口單抗同時檢測PBMC中Cpn-抗原294例PBMC標本中Cpn-McAb檢出Cpn特異性抗原陽性128例，陰性166例；而Cpn-PcAb檢出的陽性標本135例，陰性159例，二者之間差異無顯著性(P＞0.05)，見表1。

表1Cpn抗體與進口單抗檢測PBMC中Cpn-抗原的結果比較(例)

2.3Cpn-PcAb檢測PBMC中Cpn-抗原評估Cpn-PcAb與Cpn-McAb同時檢出PBMC中Cpn-抗原陽性的標本有110例，而PBMC中Cpn-抗原陰性的標本為141例，Kappa值是0.7，根據其判斷標準表明：Cpn-PcAb與Cpn-McAb檢測結果的一致性強度屬于高度，見表2。

表2Cpn抗體檢測PBMC中Cpn-抗原方法評價(例)

2.4PCR法檢測外PBMC中Cpn-DNA結果20例用Cpn-PcAb經直接微量免疫熒光(DI)法檢測出Cpn-抗原陽性的PBMC標本中，用PCR法從17例PBMC中檢測到Cpn-DNA；20例用Cpn-PcAb經DI法檢測Cpn-抗原陰性的PBMC標本中，用PCR法從3例PBMC中檢測到Cpn-DNA。可見自制Cpn-PcAb有較好的敏感性和特異性，見表3。

表3PCR法和DI法檢測PBMC結果比較(例)

3討論

近年來根據流行病調查，發現多種系統疾病都與Cpn感染有關。國外已成功分離出Cpn菌株-183、AR-39、AR-59、AR-458、LR-65等，而且有Cpn活菌和單抗出售，并用阿齊霉素進行較大規模的臨床干預試驗［10］。國內有學者就冠心病患者做了有關Cpn感染的流行病學調查［11］，建立了家兔Cpn感染和動脈粥樣硬化模型［9］。，臨床診斷Cpn感染的依據主要依靠抗體的檢測，但是Cpn抗體的檢出只能說明該個體感染過Cpn，卻不能反映體內是否仍有Cpn活菌存在。而Cpn特異性抗原的檢測能直接反映該個體內有無Cpn活菌的存在［12］，為此筆者已建立了PBMC中Cpn-抗原的檢測方法［5］，并用于臨床檢測，為臨床相關疾病的診治提供可靠依據。但檢測Cpn-抗原所用的Cpn單抗目前尚依賴進口，不僅手續麻煩，且價格昂貴。為此，我們采用Cpn菌株感染新西蘭白兔，成功地獲得純度較高的家兔抗Cpn-抗體。為了測定其特異性和敏感性，我們用進口單抗(FITC-TT-401)與自制的FITC-Cpn)抗體同時檢測294例PBMC中Cpn特異性抗原，陽性標本分別為128例和135例(見表1)，同時都為陽性的有110例，同時都為陰性的有141例，Kappa值為0.7(見表2)，根據Kappa值判斷標準提示自制的Cpn抗體與進口單抗的檢測結果具有較好的一致性。

另外，我們隨機挑選了20例用Cpn抗體經DI法檢測Cpn特異性抗原陽性和20例陰性的PBMC標本，用PCR法檢測Cpn-DNA。結果顯示陽性組有17例，陰性組有3例檢測到Cpn-DNA(見表3)。由此表明，自制的Cpn抗體特異性較好、敏感性較高，可能可以替代進口單抗用于臨床Cpn-抗原的檢測，有助于Cpn感染相關疾病的診治，而且為進一步制備Cpn單克隆抗體提供了經驗。

【】

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3RubegniP，MaranoMR，DeAloeG，etal.Sweet’ssyndromeandChlamydiapneumoniaeinfection.JAmAcadDermatol，2001，44(5)：862-864.

4BahrmandAR，BahadoriM，HossainiA，etal.ChlamydiapneumoniaeDNAismorefrequentinadvancedthaninmildatherosclerosislesions.ScandJInfectDis，2004，36(2)：119-123.

5王衛群，張瑞華，龔輝，等.外周血單核細胞中肺炎衣原體特異性抗原的檢測.臨床醫學，2002，9(3)：243-245.

6MoazedTC，KuoCC，GraystonJT，etal.EvidenceofsystemicdisseminationofChlamydiapneumoniaeviamacrophagesinthemouse.JInfecDis，1998，117：1322-1325.

7TimsP，BodettiT.DetectionofChlamydiapneumoniaeDNAandantigeninthecirculatingmononuclearceelfractionsofhumansandkoalas.InfectImmun，2000，68(5)：2744-2747.

8MuhlestainJB，HammondEH，CarlquistJF，etal.Increasedincidencesymptomaticatheroscleroticversusotherformsofcardiovascelardisease.JAmCollCardiol，1996，27J：1555-1561.

9王衛群，袁佶，王岫南，等.家兔的肺炎衣原體感染和動脈粥樣硬化模型.上海醫科大學學報，2000，27(4)：292-294.

10DirkSander，KerstinWinbeck，JürgenKlingelh?fer，etal.ProgressionofEarlyCarotidAtherosclerosisIsOnlyTemporarilyReducedAfterAntibioticTreatmentofChlamydiapneumoniaeSeropositivity.Circulation，2004，109：1010-1015.

11袁佶，余竹元，黃士通.冠狀動脈粥樣硬化性疾病患者肺炎衣原體抗體檢測.中國人獸共患病雜志，1999，15(1)：12-13.

12BodettiTJ，TimmsP.DetectionofChlamydiapneumoniaeDNAandantigeninthecirculatingmononuclearcellfractionsofhumansandkoalas.InfectImmun，2000，68(5)：2744-2747.