前言：本站為你精心整理了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定范文，希望能為你的創(chuàng)作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

【摘要】目的探討人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，提高體外分離培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成功率。建立血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)模型，為體外研究血管內(nèi)皮細(xì)胞提供實驗基礎(chǔ)。方法取2根臍帶（至少20cm）沖凈淤血，采用加工穿刺針固定臍靜脈灌注消化液,一根用0.2％膠原酶Ⅱ，另一根用0.1％膠原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比較兩種酶的消化效果。收集細(xì)胞并用含有10ng/mL的VEGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長及傳代。并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點，同時用免疫組織化學(xué)的方法對所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期。結(jié)果兩種消化酶方法均獲得了相當(dāng)數(shù)量的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，膠原酶Ⅱ的消化效果稍優(yōu)于混合消化酶，且比較理想的消化時間均為13min，細(xì)胞接種后4～5h開始貼壁生長，1周左右可生長成單層，光鏡下呈多角形，“鋪路石”樣排列，免疫組織化學(xué)法可見內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中人第Ⅷ因子相關(guān)抗原呈陽性反應(yīng)。細(xì)胞周期顯示約有50.6%的細(xì)胞處于G0/G1期。結(jié)論膠原酶Ⅱ和膠原酶Ⅰ與胰酶等比混合消化液灌注法是獲得臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的一種可取方法，而膠原酶是分離培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的首選消化液，成功率高，可靠性大，可成功構(gòu)建體外研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的模型。

【關(guān)鍵詞】人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞周期；分離；鑒定

Cultivationandinvitroidentificationofendothelialcellsfromhumanumbilicalvein

〔Abstract〕ObjectiveToexploretheprimaryculturemethodofhumanvascularendothelialcells(ECs)fromumbilicalvein,enhancethesuccessrateofseparatingandculturingECsinvitro,establishthemodelofhumanvascularECs,andprovideanexperimentalmethodforresearchofECs.MethodsTheumbilicalveinsinhumanumbilicalcords,20cmlong,werefixedandfilledthedigestivefluids,0.2%collagenenaseⅡinonecordandthecomplexenzymeof0.25%trypsinand0.1%collagenaseⅠinanother,andthedigestiveresultswerecompared.Allthecellswerecollectedandculturedinfluidwith10mg/mLVEGF,theirprocreationandgenerationwereobserved,themorphologiccharacteristicsofECswereobservedwithlightmicroscopyandimmunohistochemistryunderinvertedmicroscope,andthecellcyclewasobservedbyflowcytometer.ResultsEnoughECswereobtainedfrombothdigestiveliquids,andcollagenenaseⅡwasbetterthancomplexenzyme,theeffectivedigestingtimewas13minutes.theculturingcellsgrewonthewallappearedafter4-5hoursandthemonolayercellswereformedafteroneweek.ⅧfactorintheECsshowedpositivereactionbyimmunohistochemistry.Cellcyclerevealedthat50.6%cellswereatstageofG0/G1.ConclusionTheperfusionwithcolla〔Keywords〕humanvascularendothelialcellinumbilicalvein;cellculture;flowcytometry;cellcycle;separation;identification

血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于血管內(nèi)壁的單層細(xì)胞，通過產(chǎn)生和分泌許多血管活性物質(zhì)，在維持血管舒縮、抗凝血及血管構(gòu)建等方面起重要作用，同時由于其特殊的解剖學(xué)部位使內(nèi)皮細(xì)胞能敏感地感知血流、壓力、炎癥信號以及血液循環(huán)中激素水平的變化，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與鄰近及遠(yuǎn)處的細(xì)胞相互聯(lián)系，對各種刺激作出反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定。內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)與多種疾病關(guān)系的重要方法。新生兒臍帶由于取材方便，來源充足，而成為血管內(nèi)皮細(xì)胞體外實驗的主要材料。本文利用健康產(chǎn)婦正常娩出的胎盤端游離臍帶，采用改進(jìn)的灌注消化法，運用不同的消化酶成功分離了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行了鑒定，從而為構(gòu)建體外研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的模型及進(jìn)一步實驗研究打下了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源與采集標(biāo)本均來自于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠娩出的新生兒臍帶。于無菌條件下剪下臍帶（至少20cm）放入裝有培養(yǎng)基的無菌容器中，快速移入實驗室，1h內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

1.1.2試劑PRMI-1640培養(yǎng)基、類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Hyclone)；L-谷氨酰胺（Sigma公司）；VEGF（Sigma公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；膠原酶Ⅰ、Ⅱ（Gibco公司）；兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；青-鏈霉素（Gibco公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器水套式CO2培養(yǎng)箱（2300型，SHEL-LAB）；超凈工作臺（SW-CJ-IF，蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；臺式多管自動平衡離心機(jī)（TDZ5-WS，長沙平凡儀器儀表有限公司）；倒置顯微鏡（XD-101型，南京江南光電股份有限公司）；制冰機(jī)（AF100型，斯科茨曼公司）；超純水儀（MaximaScientific，ELGA公司）；電熱重蒸水器（ZLSC，上海申安醫(yī)療器械廠）；座式自控電熱壓力蒸氣滅菌器(ZDX-35型，上海申安醫(yī)療器械廠)；電子分析天平（AB204N型，梅特勒－托力多有限公司）；流式細(xì)胞儀（BECTONDickinson）。

1.2方法

1.2.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的原代分離及培養(yǎng)將取來的臍帶迅速移入潔凈操作臺內(nèi)，無菌條件下將其放入提前盛有預(yù)熱PBS培養(yǎng)皿中，剪去有鉗夾痕及血腫的部分，擠出臍帶中的血，用剪刀修齊兩斷面，分成20cm的一段。找出臍靜脈（2根管腔較細(xì)的是臍動脈，1根管腔較粗的是臍靜脈），用帶平針頭的注射器從一端插入臍靜脈，血管鉗固定，再用預(yù)熱的PBS沖洗3次以上，將血跡完全沖洗干凈。為防止臍動脈殘留的血液混入，可將動脈分離少許用消毒線結(jié)扎，用止血鉗鉗夾另一端。從沖洗的針頭中注入0.1%膠原酶Ⅱ使其充盈，另一條以同樣的方法注入0.1%膠原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液。取出針頭，用止血鉗夾住注入端，移入無菌燒杯中，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育13min。取出，松開注入端的血管鉗，收集臍靜脈內(nèi)的消化液，然后注入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液再次沖洗管腔，將消化液與沖洗液一并收集于離心管，1000r/min，離心5min，棄上清，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液（含20%胎牛血清，10ng/mLVEGF。L-谷氨酰胺2mmoL/L,青霉素100U/mL,鏈霉素100mg/mL）,用巴氏吸管輕輕吹打均勻，按1×106個接種于培養(yǎng)瓶，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液去除未貼壁的細(xì)胞，然后每隔24h半定量換液1次至細(xì)胞生長鋪滿瓶底。

1.2.2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)待細(xì)胞生長融合成單層細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)液，加入0.125%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液2～3mL，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞回縮變圓后棄去消化液，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液5～10mL終止消化，用巴氏吸管吹打制成細(xì)胞懸液，按1∶2或1∶3比例將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定細(xì)胞換液后直接在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長特征，并作相差攝影，同時進(jìn)行常規(guī)HE染色觀察并攝片。鑒定采用DAB免疫組織化學(xué)法，在6孔培養(yǎng)板中放置載玻片，玻片上植入2mL含有1×106的細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，取出載玻片，放入-20℃的冷丙酮中固定30min,用PBS沖洗3次，每次2min,滴加3%H2O2室溫孵育10min，PBS沖洗3次，每次2min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。滴加兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原多抗工作液，放入濕盒內(nèi)4℃過夜，同時另一蓋玻片不加一抗作陰性對照。次日，用PBS沖洗3次，每次2min,滴加辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG,37℃孵育30min,PBS沖洗3次，每次2min，用DAB底物混合工作液顯色，顯微鏡下觀察，待出現(xiàn)特異性染色后，終止顯色，進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明，封片，相差顯微鏡下觀察攝影。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期將消化所得的細(xì)胞懸液1000r/min離心5min，棄去上清，用PBS洗3次，加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量大于106以上，重懸、固定12h以上，取1mL細(xì)胞懸液，用PBS洗3次，細(xì)胞重懸于1mL的PI染液中，37℃孵育30min進(jìn)行流式分析，檢測細(xì)胞周期。

2結(jié)果

2.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

相差倒置顯微鏡下觀察，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞貼壁單層生長，呈短梭狀或鋪路石樣鑲嵌排列，細(xì)胞為扁平多角形，邊界清楚，胞漿豐富（見圖1-B、C）。胞核清晰可見，為圓形或橢圓形。原代培養(yǎng)細(xì)胞，于接種后2h開始貼壁生長（見圖1-A），傳代細(xì)胞約0.5h后即開始貼壁生長。原代細(xì)胞1周左右可長滿，傳代細(xì)胞生長旺盛，有時可見多核細(xì)胞。

2.2Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)鑒定

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)染色可見細(xì)胞呈圓形、梭形或多邊形，胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒（見圖1-D），核周密集，而對照組內(nèi)未見著色。證實培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期

結(jié)果顯示S期的細(xì)胞約有36.5%，S+G2+M期的細(xì)胞約有47.6%活躍于增殖期，而處于G0/G1期的細(xì)胞約占有50.6%左右（見圖2），臺盼藍(lán)排除實驗示活細(xì)胞的百分比為94.5%，換3個視野算平均值為92.3%。

3討論

新生兒臍帶來源充足，取材、操作方便可行。且臍靜脈在許多方面具有與動脈相似的生物學(xué)特性。因而，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成為血管內(nèi)皮細(xì)胞體外實驗的主要材料。成功地獲得大量臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，是體外建立血管內(nèi)皮細(xì)胞模型的保證。

在培養(yǎng)細(xì)胞的獲取上，多采用機(jī)械刮取法和酶消化法。機(jī)械刮取法是將臍靜脈剪開，用手術(shù)刀背等刮取內(nèi)皮細(xì)胞或使用帶有尼龍篩的分離管[1]，但這一方法很難掌握力度，易損傷內(nèi)皮細(xì)胞，而且多混有其它細(xì)胞如成纖維細(xì)胞等。現(xiàn)多采用酶消化法，胰蛋白酶、膠原酶均可作為消化血管內(nèi)皮細(xì)胞的酶，但膠原酶的性較溫和，效果較好。尤其膠原酶Ⅱ可認(rèn)為是消化臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的理想酶[2]，價格較昂貴。胰蛋白酶價廉，但對細(xì)胞有毒性作用。在本實驗中我們選用膠原酶Ⅱ和膠原酶Ⅰ與胰蛋白酶等比混和消化液，消化13min，均成功獲取了足夠量的血管內(nèi)皮細(xì)胞，但膠原酶Ⅱ獲取的細(xì)胞數(shù)量要稍多于混合消化液，不過混合消化酶也不失為一種可取的消化液。因此選用合理的消化酶并掌握好消化時間，是成功獲取內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵之一。同時，標(biāo)本材料的新鮮程度也影響獲得內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。有研究表明[3]，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞離體后，隨著時間的延長，細(xì)胞內(nèi)一些物質(zhì)的含量會發(fā)生變化，如離體超過6h，內(nèi)皮細(xì)胞第Ⅷ因子相關(guān)抗原釋放量以及前列環(huán)素生長量均隨著存放時間的延長而呈下降趨勢，時間超過12h后，細(xì)胞會出現(xiàn)水腫、變性，活力下降，甚至無法存活。還有研究表明[4]，臍帶離體3h內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞存活率為90%，離體24h后僅有50%存活。本試驗于1h內(nèi)進(jìn)行消化和原代分離培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量多增殖良好。培養(yǎng)基的pH值也是影響細(xì)胞生長的因素之一。內(nèi)皮細(xì)胞生長最適pH7.2～7.4，起初可稍低（7.0左右），這樣易于貼壁生長。提前用多聚賴氨酸預(yù)包被培養(yǎng)瓶也有助于細(xì)胞的貼壁。細(xì)胞營養(yǎng)液血清的選擇也是決定血管內(nèi)皮細(xì)胞能否存活的決定因素。高質(zhì)量的各種血清均能保證內(nèi)皮細(xì)胞的正常生長，有試驗結(jié)果顯示[5-6]：高質(zhì)量的胎牛血清對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長有良好的促進(jìn)作用，是體外成功培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵。我們在實驗中選用類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，細(xì)胞生長良好。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外生長能力較差，增殖緩慢，原代培養(yǎng)不易成功，傳代培養(yǎng)也只能傳3～4代，在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入適量的生長刺激因子，這些因子有高效特異的促有絲分裂作用，可明顯促進(jìn)細(xì)胞生長[7]。我們在總結(jié)失敗經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，在完全培養(yǎng)液中加入10ng/mL的VEGF，成功傳代8代后，細(xì)胞仍然生長良好。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相對其他血管內(nèi)皮易分離取得，經(jīng)濟(jì)實用，成功獲取大量的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，為體外研究建立血管內(nèi)皮提供實驗?zāi)Ｐ停瑸檫M(jìn)一步研究血管內(nèi)皮的生物學(xué)特性及其與各種疾病的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]PiebeM,PaulsenF,JalnkeT,etal.Mechanicalbrushcatheterabrasionmethodfortheisclationandcrltureofhumanconbilicalveirendothelialcells[J].Firstinvitroresults，2001，173(10):955-958.

[2]張小燕,梁朝,趙林,等.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)的改進(jìn)及其鑒定[J].中華醫(yī)學(xué)研究雜志，2005,5(6):386.

[3]王建氏,劉萌秋,賴西南.正常臍靜脈離體后不同時期內(nèi)某些物質(zhì)含量的變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,1995,17(1)：86.

[4]程滿根.血管內(nèi)皮細(xì)胞單克隆抗體研究[J].國外醫(yī)學(xué)·生理病理科學(xué)與臨床分冊，1989,10(3):138-141.

[5]徐燕,訾自強(qiáng),蘇琦華,等.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000,6(4):374.

[6]王立巖,佟曉紅,宮桂蘭,等.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及形態(tài)學(xué)觀察[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000,26(1):28.

[7]DuXL,SuiGz,StocklauserFK,etal.Inductionofapoptosisbyhighproinsulinandglucoseinculturedhumanumbilicalveinendothelialcellsismediatedbyreactiveoxygenspecies[J].Diabetologia,1998,41:249-253.genenaseⅡandthecomplexenzymeandcollagenaseⅠisaneffectivemethodtogainECs,andcollagenenaseisthedigestivefluidforprimarychoice,andcansuccessfullyestablishthemodelforresearchofECs.