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【摘要】將雙糖培養(yǎng)基改進(jìn)為三糖鐵尿素斜面培養(yǎng)基，易于尿素酶陽性菌的結(jié)果觀察。在雙糖培養(yǎng)基基礎(chǔ)上再加入2%尿素，0.2%KH2PO4，1%蔗糖制成三糖鐵尿素培養(yǎng)基。結(jié)果經(jīng)改進(jìn)后的三糖鐵尿素培養(yǎng)基與相關(guān)的目的菌進(jìn)行性能測(cè)定試驗(yàn)后的反應(yīng)符合要求。結(jié)論改進(jìn)后的培養(yǎng)基易于尿素酶陽性菌的觀察，可以減少單管試驗(yàn)。配制方法簡(jiǎn)便易行、省時(shí)省力，尤其適用于基層實(shí)驗(yàn)室工作。

【關(guān)鍵詞】雙糖尿素培養(yǎng)基

【Abstract】ObjectiveToquicklydetecttheintestinalbacteria.Methodsagarmediaoftriplesugariron(TSI)wasmadefrom2%ofurea,0.2%ofKH2PO4and1%ofsucroseonthedoublesugaragarandtestedforitsfunctionbyusingtherelatedbacteria.ResultsThetargetbacteriaweresuccessfullyculturedbyusingTSIagar.ConclusionThemodifiedculturemediumisfittoobservemasculinefungiofureaseandcanreducethesingle-valveexperiment.Theconfigurationmethodiseasy,timesavingandlaborsaving,especiallysuitableforthebasiclaboratory.

【Keywords】Doublesugariron;urea;culturemedium

為了能簡(jiǎn)便快速的鑒定出腸道致病菌，以滿足基層實(shí)驗(yàn)室的需求，我們根據(jù)現(xiàn)有的雙糖鐵瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行改良配制后，選用各不同生化反應(yīng)的腸桿菌科的目的菌株對(duì)改進(jìn)后的培養(yǎng)基進(jìn)行了性能測(cè)定，證明效果尚佳，現(xiàn)將方法介紹如下。

1材料與方法

1.1材料來源

1.1.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基雙糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（上、下層），購于杭州微生物試劑廠。三糖鐵瓊脂，購于杭州微生物試劑廠。尿素；KH2PO4均購于西安化學(xué)試劑廠。

1.1.2待檢菌株志賀菌(1.1869)；由GGMCC提供，沙門菌（1.1174）；由GGMCC提供，地方株：宋內(nèi)志賀菌株，菌號(hào)：05002；傷寒沙門菌株，菌號(hào)：04010；腸炎沙門菌株，菌號(hào)：05007；大腸埃希菌（ETECO78:K80，）菌號(hào)：05008；普通變形桿菌，菌號(hào)：07016；弗勞地枸櫞酸桿菌，菌號(hào)：040011，以上菌株均由本室保存。

1.1.3診斷血清志賀菌屬診斷血清（48種）；沙門菌屬診斷血清（59種）；腸致病性大腸埃希菌診斷血清（15種）以上各屬血清均由衛(wèi)生部蘭州生物制品所提供。腸侵襲性、產(chǎn)毒性大腸埃希菌診斷血清（16種）由衛(wèi)生部成都生物制品研究所提供。以上各屬血清均在有效期限內(nèi)使用。

1.2方法

1.2.1三糖鐵尿素培養(yǎng)基的配制配制培養(yǎng)基用華氏小試管應(yīng)清洗干凈后加塞包裝好，經(jīng)15Pa20min高壓滅菌后備用。將成品雙糖鐵瓊脂培養(yǎng)基按說明分別稱量配制上、下層后混勻，將已配好的上層培養(yǎng)基內(nèi)加入1%的蔗糖，稍加溫溶解混勻后分裝于適量的小三角燒瓶?jī)?nèi)高壓備用。再按2%尿素、0.2%KH2PO4的量加入已稱量配好的下層培養(yǎng)基內(nèi)，稍加溫后混勻待溫度冷卻后用NaOH校正pH至7.0。將配好的該培養(yǎng)基下層分裝于已高壓滅菌好的華氏小試管中約1.5～2ml直立包裝。再與上層培養(yǎng)基一同經(jīng)10Pa10min高壓滅菌后置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)前可將配制好的上層培養(yǎng)基溶解后，以無菌操作下分裝于已配制好并高壓滅菌的下層培養(yǎng)基管中2～2.5ml制成斜面?zhèn)溆?。此時(shí)的培養(yǎng)基即為三糖鐵尿素半固體斜面培養(yǎng)基。

1.2.2樣品接種將待檢目的菌進(jìn)行復(fù)活后，分別劃種于S.S瓊脂平板上置37℃溫箱培養(yǎng)18～24h，再取配制好的三糖鐵尿素半固體斜面培養(yǎng)基注明菌號(hào)后，挑取經(jīng)S.S瓊脂平板上培養(yǎng)后的典型菌落，分別穿刺接種于上述培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃溫箱培養(yǎng)18～24h后觀察結(jié)果，各待檢菌的初步生化反應(yīng)結(jié)果見表1。表1不同菌株在三糖鐵尿素斜面上的反應(yīng)注：（1）K為紅色；A為黃色；＋為陽性；-為陰性；+/-大多時(shí)為陽性，少時(shí)為陰性；-/+少時(shí)為陰性，大多時(shí)為陽性；(-)多時(shí)為陰性；(+)多時(shí)為陽性；D為不定。

1.2.3配制時(shí)應(yīng)注意點(diǎn)尿素酶極受溫度,高壓時(shí)溫度過高過久，都有可能使尿素酶分解，如加熱不足，又可造成滅菌不徹底，所以準(zhǔn)確的把握滅菌溫度及加熱時(shí)間是關(guān)鍵。

加入適量的KH2PO4后，能阻止尿素在滅菌過程中產(chǎn)生的氨與二氧化碳聯(lián)結(jié)為氨基甲酸銨，同時(shí)KH2PO4還可起到緩沖作用，如果溫度掌握適中可使下層培養(yǎng)基pH保持在7.0～7.1，加入KH2PO4后，可發(fā)揮尿素酶的最大活力，易于尿素酶陽性菌的結(jié)果觀察。

2結(jié)果

我們將改進(jìn)后的培養(yǎng)基經(jīng)過實(shí)驗(yàn)后的反應(yīng)歸納有以下幾種：斜面不變色、底層變黃色，不產(chǎn)氣、無動(dòng)力，硫化氫陰性，不分解尿素酶者可考慮為志賀菌屬細(xì)菌；

斜面不變色、底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣、產(chǎn)生硫化氫，不分解尿素酶者可考慮為沙門菌屬細(xì)菌；

斜面不變色，底層產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，尿素酶陰性、可產(chǎn)生少量硫化氫者可考慮傷寒沙門菌；

斜面和底層均變紅色，有動(dòng)力，產(chǎn)或不產(chǎn)氣，硫化氫陽性或陰性，尿素酶陽性者可考慮為變形桿菌屬細(xì)菌。

根據(jù)以上各生化反應(yīng)，能初步判斷所屬的屬或種，然后再以血清學(xué)試驗(yàn)加以證實(shí)確定屬或種，同時(shí)還可以從以上生化試驗(yàn)中判定出無診斷血清的其它菌屬［1］。

3討論

細(xì)菌檢驗(yàn)需要經(jīng)過分離、培養(yǎng)、繁殖、動(dòng)態(tài)觀察以及生化特性的不固定變化等因素綜合判定并認(rèn)真鑒定后才能拿到確定的菌株，與其他檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)方面最大的不同也在于此,至今仍離不開傳統(tǒng)的手工操作。改進(jìn)后的三糖鐵尿素半固體斜面培養(yǎng)基與其他腸桿菌科培養(yǎng)基最大的優(yōu)點(diǎn)是易于觀察尿素酶的結(jié)果，可以不做其他輔助生化。在一支培養(yǎng)基中，同時(shí)觀察多種生化反應(yīng)和生長(zhǎng)情況，可以防止尿素酶陽性的細(xì)菌漏檢。用于腸道菌檢查用的單糖，雙糖、三糖、四糖等培養(yǎng)基配制很多［2］，但由于配制耗時(shí)和基層實(shí)驗(yàn)室在配制中的諸多，以致在許多基層實(shí)驗(yàn)室不能正常使用。市場(chǎng)上出售的雙糖鐵（kligler）和三糖鐵（TS1）瓊脂培養(yǎng)基干粉成品［3］，雖已廣泛用于腸道細(xì)菌的檢驗(yàn)工作，但均不含尿素成份。如果檢驗(yàn)?zāi)蛩孛戈栃缘募?xì)菌須另做單獨(dú)的尿素管，改進(jìn)后的培養(yǎng)基就可以減少繁瑣的單管試驗(yàn)方法。該培養(yǎng)基的配制方法簡(jiǎn)便易行、省時(shí)省力，不需要任何高端技術(shù)和儀器，適用于各類實(shí)驗(yàn)室，尤其適用于基層腹瀉病門診實(shí)驗(yàn)室工作。

我們推薦使用的該培養(yǎng)基經(jīng)過同行多年的工作實(shí)踐，已在當(dāng)?shù)赝扑]并長(zhǎng)期使用，效果很好。我們相信該培養(yǎng)基在傳統(tǒng)的微生物分離技術(shù)上會(huì)給同行帶來方便，我們?cè)概c同行共享。

【】

1P.R愛德華，W．H．愛文.腸桿菌科的鑒定.衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所.江西省衛(wèi)生防疫站，第3版，1997：92.

2陳夫元，劉捷.細(xì)菌培養(yǎng)基.北京：技術(shù)出版社，1992,149-156.

3扳琦利一．他．新細(xì)菌培地講座（第二版）下1.東京:近代出版社，1993,180