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[摘要]目的：建立一種酶法工藝制備的頭孢丙烯中酶蛋白殘留的新檢測方法。方法：采用考馬斯亮藍法，配制標準蛋白線性溶液建立標準曲線，取考馬斯亮藍G-250染液加入到10%碳酸氫鈉溶液溶解的頭孢丙烯供試品溶液中，混勻反應10分鐘后使用紫外分光光度計測定吸光度，采用標準曲線法計算得到供試品溶液中的蛋白濃度，并計算出供試品所含酶蛋白殘留含量。結果：酶蛋白在25~1000μg/mL(相當于供試品0.05%~2.0%)濃度范圍內與吸光度呈良好線性關系(r=0.9976)；精密度RSD(n=12)為4.5%；平均回收率(n=12)為98.9%。結論：本方法簡單便捷、重復性好、快速準確，適用于酶法工藝制備的頭孢丙烯中酶蛋白殘留的含量測定。

[關鍵詞]頭孢丙烯；酶法；蛋白殘留；含量測定

頭孢丙烯是美國百時美-施貴寶公司研制的第二代非酯型口服頭孢菌素類廣譜抗菌藥(圖1)，也是FDA批準的第一個可有用于治療兒童中耳炎和鼻竇炎的口服頭孢菌素類抗生素，臨床上主要用于敏感細菌引起的呼吸道、皮膚和軟組織等感染[1]。目前已報道的合成頭孢丙烯的方法主要是采用化學合成法[2-3]，該合成法反應過程多，使用有機溶劑量大，產生的危險廢物多，對環境不友好。近年也有新的綠色環保的酶法合成頭孢丙烯制備工藝報道[4-6]。酶法合成相對化學合成，使用的有機溶劑少，路線簡單，能克服現有的化學合成法成本高、大量使用有毒試劑、生產周期長的不足，滿足經濟、環境和社會進步的需要。但是酶法合成頭孢丙烯的工藝中，使用到合成酶，其結構以蛋白質為主。如若較多殘留至成品中，服藥后有可能導致患者過敏等不良反應。因此，為了更好地控制酶法工藝制備的頭孢丙烯的藥品質量，有必要建立一種檢測方法，以檢測酶法制備的頭孢丙烯最終產品中酶蛋白的殘留量，從而保證用藥的安全性。目前，蛋白質的定量測定有多種方法，如考馬斯亮藍(Bradford)法[7]、福林酚(Lowry)法[8]、凝膠過濾(GFC)法[9]、熒光法[10]、質譜法(MS)等[11]。考馬斯亮藍法測定蛋白質含量是通過染料結合進行的，在游離狀態下呈現紅色，最大光吸收波長在488nm，當考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后變成藍色，該蛋白質-色素的結合物在595nm吸收波長下有最大吸收，其吸光度值與蛋白質的含量成正比[7]。其作為一種通用型方法，只需加一種檢測試劑就可以實現快速、簡單、方便的測定；靈敏度高，約為福林酚法的4倍；受干擾的物質少，優點突出，可以作為蛋白質含量測定的首選。牛血清白蛋白是極為常用的標準參照蛋白，一般蛋白質含量檢測方法所選取的稀釋劑多以水為主，而頭孢丙烯的溶解特性為微溶于水，因此需要選取合適的溶劑，既不能讓殘留的蛋白質變性，又能充分溶解頭孢丙烯，使酶蛋白殘留的檢測結果準確、可靠。本文采用考馬斯亮藍法，通過考察選擇合適的溶劑、建立了酶法工藝制備頭孢丙烯酶蛋白殘留的檢測方法，快速、簡便、經濟，并已用于實際樣品酶蛋白殘留的測定。

1儀器與試劑

1.1儀器。紫外分光光度計(島津UV-1800)、電子天平(梅特勒托利多)

1.2試劑。牛血清白蛋白：生物技術級96%，阿拉?。豢捡R斯亮藍G-250：上海綠鳥科技；磷酸：阿拉丁；乙醇：上海凱沃生物；碳酸氫鈉：廣州化學試劑廠；實驗用水：實驗室超純水一體機自制純化水；頭孢丙烯供試品：自制樣品S190701、S190702、S190703。

2方法與討論

2.1溶液配制。考馬斯亮藍G-250染液：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL乙醇中，加入磷酸100mL，用純化水稀釋定容至1000mL。10%碳酸氫鈉溶液：取碳酸氫鈉10g，加水100mL溶解，即得。

2.2空白溶液配制。取10mL考馬斯亮藍G-250染液，置西林瓶中，加入200μL10%碳酸氫鈉溶液，密封混勻，放置10min后，即得空白溶液。

2.3標準曲線溶液及供試品溶液配制。取牛血清白蛋白適量，用純化水溶解定容，得到標準蛋白儲備溶液，取上述儲備溶液適量，以10%碳酸氫鈉溶液進行稀釋，即得標準蛋白線性溶液；另取10mL考馬斯亮藍G-250染液，置西林瓶中，加入標準蛋白線性溶液200μL，密封，混勻；放置10分鐘后，即得標準曲線溶液。取頭孢丙烯供試品(批號：S190703)500mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，加10%碳酸氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；取10mL考馬斯亮藍G-250染液，置西林瓶中，加入200μL供試品溶液，密封混勻，放置10分鐘后，作為供試品測定溶液。

2.4檢測條件紫外檢測波長：595nm

2.5稀釋溶劑的選擇。因蛋白質在酸、堿、丙酮等物質中均易變性，實驗考察了多種溶劑如不同濃度的磷酸、冰乙酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉等溶劑，分別配制牛血清白蛋白標準溶液和供試品溶液，結果在上述溶劑中10%碳酸氫鈉溶液不但紫外響應高、吸光度與濃度亦呈現較好的線性關系，而且對頭孢丙烯的溶解度很大，較好地滿足了酶蛋白殘留的檢測要求。通過比較與選擇，最終選定了10%碳酸氫鈉溶液作為溶劑。

2.6放置反應時間的選擇。考馬斯亮藍法中染液與蛋白質結合時間較短，幾分鐘內可完成，結合以后的顏色可保持1小時穩定。選定溶劑后對放置時間進行了考察，結果顯示在5~20分鐘內吸光度結果相對穩定，綜合測定的快速性、反應充分性和結果的穩定性，最終選定放置10分鐘。

3驗證結果

3.1標準曲線的建立。稱量牛血清白蛋白適量，用純化水溶解定容至50mL容量瓶中，得到濃度約為2500μg/mL的標準蛋白儲備溶液。按下表分別取適量，以10%碳酸氫鈉溶液進行稀釋，共得7份標準蛋白線性溶液；各取10mL考馬斯亮藍G-250染液，分別置7個西林瓶中，分別加入下表1各標準蛋白線性溶液200μL，密封，混勻；放置10min后，即得7份標準曲線溶液。紫外分光光度計在595nm波長下，經過空白溶液校正后，取該7份標準曲線溶液分別放入紫外分光光度計讀取吸光度值，檢測結果如下表2：以蛋白溶度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，采用吸光度對蛋白溶液溶度以最小二乘法做線性回歸(圖1)，得線性回歸方程：y=0.000538852x+0.0244872(r2=0.9952)。結果表明標準蛋白溶度在24.8~993.5μg/mL的范圍內與吸光度線性關系良好，可適用于標準曲線的建立。

3.2精密度。3.2.1分析重復性按3.1建立標準曲線，取供試品，按2方法測定其蛋白殘留，供試品蛋白殘留濃度為22.76μg/mL，酶蛋白殘留0.045%；取同一供試品平行配制6份供試品溶液，按照標準溶液加入法，分別取10mL考馬斯亮藍G-250染液，分別置6個西林瓶中，分別加入100μL標準曲線中的相當于供試品0.2%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，均密封混勻，放置10min后，得到6份分析重復性溶液，取這6份分析重復性溶液測定吸光度值，通過標準曲線計算得到分析重復性溶液中所含蛋白濃度；分析重復性溶液的蛋白濃度減去對應供試品溶液所含蛋白濃度，得到實際加入的線性溶液的蛋白濃度，實際加入的蛋白濃度與理論加入的蛋白濃度的比值為回收率。如下表3所示，各分析重復性溶液的平均回收率為102.6%，RSD為4.6%，本方法的分析重復性良好。3.2.2中間精密度在不同日期不同實驗員按照3.2.1進行供試品蛋白殘留測定，供試品蛋白殘留濃度為22.66μg/mL，酶蛋白殘留0.045%；按照3.2.1平行配制6份中間精密度溶液測定并計算回收率。如下表4所示，各中間精密度溶液的平均回收率為97.6%，RSD為3.0%，本方法的中間精密度良好。綜合12份溶液平均回收率為100.1，RSD為4.5%，本方法的精密度良好。

3.3回收率。按3.1建立標準曲線，取供試品，按2方法測定其蛋白殘留為22.76μg/mL。準確度溶液1配制：取10mL考馬斯亮藍G-250染液，置西林瓶中，加入100μL標準曲線中的相當于供試品0.05%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，密封混勻，放置10min后，得到準確度溶液1；平行配制3份；準確度溶液2配制：取10mL考馬斯亮藍G-250染液，置西林瓶中，加入100μL標準曲線中的相當于供試品0.2%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，密封混勻，放置10min后，得到準確度溶液2；平行配制3份；準確度溶液3配制：取10mL考馬斯亮藍G-250染液，置西林瓶中，加入100μL標準曲線中的相當于供試品1.2%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，密封混勻，放置10min后，得到準確度溶液3；平行配制3份；準確度溶液4配制：取10mL考馬斯亮藍G-250染液，置西林瓶中，加入100μL標準曲線中的相當于供試品2.0%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，密封混勻，放置10min后，得到準確度溶液4；平行配制3份；取上述12份準確度溶液測定吸光度，通過標準曲線計算得到準確度溶液中所含蛋白濃度；準確度溶液所含的蛋白濃度減去供試品溶液所含蛋白濃度，得到實際加入的線性溶液的蛋白濃度，實際加入的蛋白濃度與理論加入的蛋白濃度的比值為回收率。如下表6所示，各準確度溶液平均回收率為98.9%，RSD為4.1%，回收率的95%置信區間在96.3%~101.5%，表明該方法測定頭孢丙烯酶蛋白殘留準確、可靠。

3.4樣品檢測。按3.1建立標準曲線，取各供試品，按2方法配制供試品溶液并測定其蛋白殘留，如下表7所示。

4結論

本論文中，我們采用考馬斯亮藍法，使用10%碳酸氫鈉溶液作為溶劑對酶法工藝制備頭孢丙烯中酶蛋白殘留進行了測定。在此條件下，方法簡便、靈敏度高、重復性好、結果快速準確，適用于酶法工藝制備頭孢丙烯中酶蛋白殘留的測定，為頭孢丙烯藥物研發、生產樣品的質量控制提供了參考。

作者:李慶 關晴 刁富城 單位:廣州白云山醫藥集團股份有限公司白云山化學制藥廠