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【摘要】目的觀察氯化兩面針堿在體外對(duì)人胚腎細(xì)胞293的毒性作用。方法采用MTT法檢測(cè)不同濃度氯化兩面針堿對(duì)人胚腎細(xì)胞293的毒性。結(jié)果氯化兩面針堿在體外對(duì)人胚腎細(xì)胞293有一定的毒性作用。結(jié)論氯化兩面針堿可抑制人胚腎細(xì)胞293的增殖，對(duì)腎臟有一定的毒性。

【關(guān)鍵詞】氯化兩面針堿;人胚腎細(xì)胞293;體外腎毒性

中藥抗腫瘤是目前醫(yī)學(xué)界研究的一個(gè)熱點(diǎn)，很多中藥成分被證實(shí)具有較好的抗腫瘤效果而得以逐步走向臨床。氯化兩面針堿是兩面針制劑的主要有效成分，在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、心血管系統(tǒng)等方面的作用已有較多報(bào)道。氯化兩面針堿有較強(qiáng)的抗癌作用，據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道，氯化兩面針堿對(duì)LEWIS肺癌、鼻咽癌、肝癌、慢性粒細(xì)胞白血病均有抑制作用，對(duì)小鼠艾氏水癌、肝癌腹水也有效，而其對(duì)腎的毒性問(wèn)題未見(jiàn)報(bào)道,特別是在細(xì)胞水平、分子水平都未見(jiàn)報(bào)道。作為一個(gè)新型的抗腫瘤藥物，其腎毒性大小至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)中，我們考察了氯化兩面針堿在體外對(duì)人胚腎細(xì)胞293的毒性作用。

1材料與儀器

1.1試藥氯化兩面針堿標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);四噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司);DMEM(美國(guó)GIBCOBRL公司);胎生牛血清(杭州四季青生物材料研究所公司);胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司公司);谷氨酰胺(美國(guó)Amresco公司);PBS(美國(guó)Amresco公司);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司);注射用硫酸鏈霉素(大連美羅大藥廠);HEPES(Sigma公司)。

1.2儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)FormaScientific公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);酶標(biāo)儀(芬蘭thermo公司);超低溫冰箱(日本三洋公司);96孔培養(yǎng)板(美國(guó)BIO-RAD公司);6孔培養(yǎng)板(美國(guó)BIO-RAD公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.3細(xì)胞株人胚腎細(xì)胞293細(xì)胞株(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

2方法

2.1DMEM培養(yǎng)液的配置DMEM培養(yǎng)干粉以1000ml三蒸水充分溶解，加入NaHCO32.0g,HEPES4.766g，加入青霉素、鏈霉素使其終濃度為100U·ml-1，在超凈工作臺(tái)中過(guò)慮除菌，分裝成90ml/瓶，-20℃保存?zhèn)溆茫R用前加10ml熱滅活(56℃，30min)胎牛血清。

2.2梯度氯化兩面針堿的制備精密稱定氯化兩面針堿標(biāo)準(zhǔn)品適量用DMSO溶解后，用無(wú)血清培養(yǎng)液依次稀釋，配置成0.78125，1.5625，3.125，6.25，12.5μg/ml濃度梯度的氯化兩面針堿系列濃度樣品，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3細(xì)胞培養(yǎng)人正常胚腎細(xì)胞293分別培養(yǎng)于含DMEM完全培養(yǎng)液的玻璃培養(yǎng)瓶中，置于37℃，飽和濕度，5%CO2的培養(yǎng)箱中，定期觀察更換培養(yǎng)液。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部時(shí)傳代，用PBS沖洗兩次，加入0.25%胰蛋白酶2ml消化液，置37℃約1min，倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間連接消失，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度，吸取上清液，加入完全培養(yǎng)液2ml，反復(fù)吹打，將細(xì)胞吹打均勻，調(diào)整培養(yǎng)瓶中細(xì)胞濃度至1×105/ml,加入完全培養(yǎng)液，置于CO2的培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活細(xì)胞數(shù)大于95%。

2.4氯化兩面針堿的腎毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人正常胚腎細(xì)胞293用胰酶消化后，用DMEM培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，每孔190μl，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h待細(xì)胞完全貼壁后，受試孔加入系列濃度受試藥物10μl每藥3孔，陰性對(duì)照孔加入含0.5%DMSO的無(wú)血清培養(yǎng)基10μl，空白對(duì)照孔加入等量的含藥無(wú)血清培養(yǎng)基而無(wú)細(xì)胞，各孔加培養(yǎng)基至200μl，培養(yǎng)箱孵育24，48，72h，加入5mg/ml的MTT10μl，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，取出96孔板頃去上清液，加入DMSO每孔150μl，在搖床上振動(dòng)搖勻10min，在酶標(biāo)儀570nm和630nm的波長(zhǎng)下測(cè)得各孔OD值。按下式計(jì)算藥物對(duì)293細(xì)胞的抑制率。

抑制率(%)=對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值對(duì)照組OD值×100%

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均抑制率。

2.5SOD，MDA，LDH的測(cè)定(紫外分光光度法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人正常胚腎細(xì)胞293用胰酶消化后，用DMEM培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液加入6孔培養(yǎng)板，每孔1.9ml，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h待細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)孔加入3.125μg/ml氯化兩面針堿0.1ml，另設(shè)空白對(duì)照組。在藥物作用的12，24，48h后，取培養(yǎng)液的上清液按SOD，MDA，LDH試劑盒中所述方法進(jìn)行SOD，MDA，LDH的測(cè)定。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)以±s表示，組間的均數(shù)采用方差分析進(jìn)行兩兩比較，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理。采用Bliss法計(jì)算IC50值。

3結(jié)果

3.1MTT測(cè)定結(jié)果藥物干預(yù)組與空白對(duì)照組比較，在0.78125～12.5μg/ml濃度范圍內(nèi)，吸收度A值隨藥物濃度的增加逐漸減小，說(shuō)明氯化兩面針堿對(duì)人正常胚腎細(xì)胞293有一定的毒性作用，且隨氯化兩面針堿濃度的增大對(duì)細(xì)胞的毒性增加。結(jié)果見(jiàn)表1。表1MTT法測(cè)定氯化兩面針堿對(duì)293細(xì)胞株的毒性作用

3.2SOD，MDA，LDH的測(cè)定結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表2。表2紫外分光光度法測(cè)定氯化兩面針堿對(duì)人胚腎細(xì)胞293毒性作用

3.3藥物作用前后腎細(xì)胞的變化正常的腎細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，藥物作用前的腎細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)為不規(guī)則多邊形，胞漿豐富，單核、雙核細(xì)胞較多見(jiàn)，偶可見(jiàn)多核細(xì)胞，細(xì)胞核圓、透亮，培養(yǎng)12h后可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始貼壁，貼壁細(xì)胞透亮、呈不規(guī)則多角形，邊界清晰，胞漿內(nèi)容物豐富，少許未貼壁細(xì)胞浮于液面。培養(yǎng)24h的肝細(xì)胞大部分貼壁。見(jiàn)圖1。藥物作用12h后腎細(xì)胞開(kāi)始萎縮，細(xì)胞膜完整,出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象,并有膜包裹的凋亡小體出現(xiàn)，細(xì)胞密度下降。藥物作用24h后腎細(xì)胞隨時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞密度下降較明顯，出現(xiàn)較多凋亡小體懸浮于培養(yǎng)液中。藥物作用48h后腎細(xì)胞死亡較多，密度進(jìn)一步降低，出現(xiàn)較多凋亡小體懸浮于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。結(jié)果見(jiàn)圖1～4。

4討論

腎臟是人體重要臟器之一,更是主要的排泄器官。藥物在體內(nèi)經(jīng)腎臟代謝,多數(shù)藥物以原形或分解產(chǎn)物形式從腎臟排泄出體外，但許多藥物具有腎毒性,如過(guò)量使用(尤其在患腎病時(shí)),會(huì)對(duì)腎產(chǎn)生毒性作用,繼而引起或加重腎損害。中草藥引起的腎損害與用藥劑量的大小,持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短、性別、個(gè)體敏感性有關(guān)。當(dāng)劑量達(dá)到一定程度后即可引起腎損害。曾有報(bào)道一次用木通60g可引起急性腎衰竭。通常認(rèn)為中藥毒性小,用量有日益增大的趨勢(shì)。故使用中藥應(yīng)遵循少而精的原則,要時(shí)刻考慮是否會(huì)加重腎臟負(fù)擔(dān)或是否可引起不可逆的腎損害。

考察藥物的毒性是確定該藥物有無(wú)繼續(xù)研究和開(kāi)發(fā)價(jià)值的重要因素，早期發(fā)現(xiàn)和掌握藥物的有關(guān)毒理學(xué)資料對(duì)于后續(xù)研究有著重要的指導(dǎo)意義，因此建立一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜋z測(cè)藥物毒性對(duì)于新藥的研究與開(kāi)發(fā)具有重要意義。腎為人體重要的代謝器官，所以考察一個(gè)藥物的毒性大小以腎細(xì)胞為對(duì)象具有代表性作用。腎毒性檢測(cè)是研究新化合物毒理學(xué)的重要組成部分，而通過(guò)體外腎細(xì)胞模型進(jìn)行新化合物的腎毒性研究更是有著自身的眾多優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，我們選取了人胚腎細(xì)胞293為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，考察氯化兩面針堿對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用。

通過(guò)測(cè)定加入藥物作用后的6孔板中培養(yǎng)上清液的SOD，MDA，LDH值可以看出，加入藥物后，可以抑制腎細(xì)胞的增殖，與未加藥物作用的值比較，兩者具有顯著性差異。說(shuō)明氯化兩面針堿具有一定的腎毒性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為臨床應(yīng)用提供參考。超級(jí)秘書網(wǎng)：

【參考文獻(xiàn)】

[1]楊倉(cāng)良.毒藥本草[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1993:431