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愛(ài)牙知識(shí)范文第1篇

親愛(ài)的，我的內(nèi)心中始終不肯接受，始終不敢相信，我終于失去了你。雖然我們已經(jīng)闊別了十多年，我的心依然不時(shí)地在想著你。

親愛(ài)的，那個(gè)屬于我們的日子，我翹首算著，終于到來(lái)：一樣的月份，一樣的日期號(hào)碼，一樣的星期六，但是時(shí)空已經(jīng)相隔了十多年。看著鏡中鬢角的白發(fā)，還有年輕不再越發(fā)衰老的面容，我終于知道，我已經(jīng)永遠(yuǎn)地失去了你。

你的離去，讓我的世界仿佛塌了天，我的心如墜入無(wú)底深淵。望著你憂傷的面容，聽(tīng)著你決絕的話語(yǔ)，我已無(wú)法言語(yǔ)，更無(wú)法挽留，盡管我敏感的心早已有了不祥的隱憂。十多年來(lái)，那段碎裂的冰封的愛(ài)，化作了涓涓細(xì)流，一直濕潤(rùn)著這顆被歲月塵封的依舊愛(ài)你的心。

親愛(ài)的，你不會(huì)知道，我對(duì)你的思念有多深，我對(duì)你的愛(ài)戀有多重。

想你的時(shí)候，我給你寫信，給你說(shuō)我心中的話，盡情吐露我的心思。那蒙塵的墻角，見(jiàn)證了我對(duì)你的思念，按下了我一堆沒(méi)有寄出的情書。我害怕它們會(huì)給你帶來(lái)傷害，害怕它們會(huì)給你添加煩惱，更害怕你無(wú)情的拒接。我一直默默地用自己的方式愛(ài)你，我也想用這樣的方式來(lái)淡化內(nèi)心中的你，因?yàn)槲矣袝r(shí)也會(huì)清醒地認(rèn)識(shí)到我們已經(jīng)分離。十多年得日子不算短，雖然我不會(huì)每時(shí)每刻都想起你，但你常常出現(xiàn)在我的夢(mèng)里，你如花的笑靨、善脈的眸子，總會(huì)讓我醒來(lái)痛心不已，痛徹心脾，往復(fù)不止。我知道愛(ài)需要勇氣，愛(ài)需要鼓勁向前沖，但我卻懦弱地寸步不前，總害怕沒(méi)有一點(diǎn)回旋余地沒(méi)有一點(diǎn)冀望的結(jié)局不知如何自己。我寧愿把你藏在心底，把愛(ài)埋藏內(nèi)心，留一點(diǎn)希望，自我安慰自己。

想你的時(shí)候，閉上雙眼，腦中立刻就浮現(xiàn)你的容顏。那清晰的畫面，那深深刻印的痕跡，一如我基因攜帶與生俱來(lái)。人們都說(shuō)時(shí)間是撫平創(chuàng)傷的手，十多年的歲月，六千多個(gè)日夜，依然未能抹去你在我心中的點(diǎn)滴，依然未能模糊你在我心中的身影，反因苦痛經(jīng)年，歷久彌新。想著你，想著你的一顰一笑，想著你身上特有的體香，想著你欲言又止的神情，你早已是我心中的最愛(ài)，你就是我今生痛苦的根源。

想你的時(shí)候，又記起那串熟悉的數(shù)字，心，一如當(dāng)年的激動(dòng)和遲疑。想給你電話，總是想象你正在做著自己的事，怕打擾你，總想等到你有空閑再打給你，總想等等，再等等。時(shí)間就在我的等待中悄悄溜走，我的勇氣在等待中泄去，我的面容在等待中老去，等待蹉跎了歲月，等待荒蕪了心田，一晃已經(jīng)在等待中逝去了十多個(gè)春秋，我在等待中錯(cuò)失了良機(jī)，我在等待中錯(cuò)失了今生的最愛(ài)。

實(shí)在想你的日子，無(wú)法排遣心中的苦寂，便花上半個(gè)小時(shí)，來(lái)到你的城市。記不住重走了多少次曾經(jīng)與你走過(guò)的路，不為與你重逢，只求重拾當(dāng)初的美麗記憶。那段路鐫刻了我們相偎相依的身影，灑下了我們的歡聲與笑語(yǔ)，見(jiàn)證了我們的那段純真的感情。路，依然在，匆匆擦過(guò)許多陌生的身影，心中多么希望還能遠(yuǎn)遠(yuǎn)地、遠(yuǎn)遠(yuǎn)地望見(jiàn)你的倩影，直到華燈初上，美麗關(guān)城萬(wàn)家燈火，夜意闌珊。

今夜，夢(mèng)中依然有你。夢(mèng)中的你依舊笑靨如初。

夢(mèng)醒，物是人非。

夢(mèng)醒，依舊心痛。

夢(mèng)中咫尺，現(xiàn)實(shí)天涯！

咫尺天涯！

愛(ài)牙知識(shí)范文第2篇

演出前，英國(guó)協(xié)奏團(tuán)的音樂(lè)總監(jiān)，同時(shí)也是音樂(lè)會(huì)指揮和羽管鍵琴演奏家的哈利?畢克特（Harry Bieket），女高音歌唱家瑪麗?貝文（Mary Bevan）以及假聲男高音歌唱家蒂姆?梅德（Tim Mead）接受了媒體的采訪。“這次我們選擇的音樂(lè)幾乎所有選段都是關(guān)于愛(ài)，”哈利?畢克特介紹道，“愛(ài)所帶來(lái)的喜悅、悲傷與痛徹心扉，這是所有時(shí)代的人類共有的情感。”

同時(shí)，這也是上海大劇院“愛(ài)上莎士比亞”藝術(shù)季的“收官之作”。上海大劇院在2016年特別策劃了貫穿全年的“愛(ài)上莎士比亞”藝術(shù)季，共囊括了來(lái)自英國(guó)、瑞士、美國(guó)、俄羅斯、中國(guó)的十臺(tái)二十場(chǎng)演出，以及四次大型的莎士比亞主題劇院開(kāi)放日和莎翁市集，包括講座、對(duì)談、公開(kāi)排練、工作坊、展覽、廣場(chǎng)放映等超過(guò)百場(chǎng)活動(dòng)，與數(shù)萬(wàn)名觀眾一起分享音樂(lè)、舞蹈、戲劇等表演藝術(shù)。

十七世紀(jì)的不列顛，進(jìn)入王政復(fù)辟時(shí)代的英國(guó)劇壇重獲新生，掀起了一股仿古典主義的熱潮。人們迷戀著伊麗莎白時(shí)代偉大的詩(shī)人們，戲劇成為一種風(fēng)尚，對(duì)音樂(lè)的影響也無(wú)處不在。英國(guó)音樂(lè)史上兩位鼎鼎大名的作曲家普賽爾和亨德?tīng)柤茨莻€(gè)年代的代表人物，他們皆創(chuàng)作出了以莎翁原作為靈感的不朽名作――普賽爾的《仙后》改編自莎士比亞的《仲夏夜之夢(mèng)》，亨德?tīng)柕摹秳P撒大帝》改編自莎士比亞的《安東尼與克里奧佩特拉》。

上半場(chǎng)的曲目以普塞爾《仙后》的詠嘆調(diào)及器樂(lè)作品為主。亨利?普賽爾于1692年創(chuàng)作出了《仙后》，同年4月在倫敦的多塞特花@劇院首演，大獲成功。《仙后》的音樂(lè)優(yōu)美動(dòng)聽(tīng)，充滿了趣味與浪漫色彩，是普塞爾的最后一部代表作。三年后，年僅三十六歲的普賽爾就英年早逝了。

普賽爾被視為最杰出的巴洛克音樂(lè)大師和英國(guó)歷史上最偉大的作曲家之一，在其短暫的一生中創(chuàng)作出了數(shù)量驚人的音樂(lè)作品，包括器樂(lè)、歌曲、話劇配樂(lè)及大量的歌劇，這在英國(guó)古典音樂(lè)史上是神話般的、無(wú)人可超越的成績(jī)。普賽爾辭世后仍獨(dú)霸英國(guó)樂(lè)壇兩百多年，一直到二十世紀(jì)初愛(ài)德華?埃爾加成名之前，都沒(méi)有任何一個(gè)英國(guó)本土作曲家可以達(dá)到他那樣高的成就。

就在普塞爾出生后一年，英國(guó)發(fā)生了巨大的社會(huì)變革，清教徒禁欲的時(shí)代終于結(jié)束了。人們又可以恣意尋歡、重新縱隋于聲色之間了，被奧利弗?克倫威爾（Oliver Cromwell）整頓的無(wú)事可干的宮廷樂(lè)隊(duì)和歌唱家們終于又找到了用武之地。劇院的大門重新敞開(kāi)，人們瘋狂地要求上演莎士比亞和其他劇作家的戲劇。當(dāng)時(shí)英國(guó)還沒(méi)有真正意義上的歌劇，而是盛行一種源自意大利和法國(guó)宮廷的“假面劇”，或稱“半歌劇”（semi-opera）。它有別于歌劇，是一種融合了戲劇（說(shuō)白角色）、舞蹈（舞者）和歌唱（歌手）為一爐的英國(guó)“特產(chǎn)”。

《仙后》便屬于這樣一種“假面劇”，不過(guò)普塞爾增加了其中器樂(lè)的比重，因?yàn)榘凑沼?guó)假面劇的傳統(tǒng)，音樂(lè)并不重要。《仙后》中的說(shuō)白部分基本使用了莎士比亞的原版劇本，歌唱部分則重新寫了腳本。事實(shí)上，這是一部有著更多普塞爾自己創(chuàng)作思路的作品，正如1966年《仙后》總譜出版時(shí)，安東尼劉易斯爵士在序言中所說(shuō)的：“普塞爾沒(méi)有為莎士比亞的―行詩(shī)句譜過(guò)曲，他所譜寫的音樂(lè)包括五幕中每一幕結(jié)尾的短小的假面劇。它與莎士比亞的關(guān)系是通過(guò)仙后狄坦妮婭與她的侍從仙女們來(lái)連接的，因此，劇本有了這個(gè)名字。”

既然《仙后》是“半歌劇”的形式，音樂(lè)只是穿插于戲劇對(duì)白之中，那么這次演出時(shí)，原作中的對(duì)白是否會(huì)保留？對(duì)此，哈利-畢克特表示，考慮到大段大段的莎劇對(duì)白對(duì)中國(guó)觀眾來(lái)說(shuō)可能并不是很合適，所以他們摒棄了原作中的臺(tái)詞，但音樂(lè)之間會(huì)有一種非常抽象的、微妙的連接。“比如使用了普塞爾同時(shí)代作曲家托馬斯和約翰?威爾頓（John Weldon）的一些歌曲或舞曲作為補(bǔ)充。還有，比如蒂姆?梅德唱的《如果愛(ài)情是一種精神食糧的話》，其實(shí)是要告訴大家，我要唱一個(gè)愛(ài)的主題，接著，歌曲中會(huì)說(shuō)到，進(jìn)入森林，碰到一個(gè)女子，發(fā)生了什么樣的故事，等等。”

音樂(lè)會(huì)的下半場(chǎng)以亨德?tīng)柕摹秳P撒大帝》為主打。亨德?tīng)柍錾诘聡?guó)的哈雷，1710年被任命為漢諾威宮廷樂(lè)長(zhǎng)，在德國(guó)成為了受人矚目的音樂(lè)家。然而，倫敦這座充滿魅力的城市頻頻地向亨德?tīng)柊l(fā)出召喚。自從普賽爾去世后，英國(guó)音樂(lè)逐漸呈現(xiàn)出衰弱的、分裂的態(tài)勢(shì)，非常需要強(qiáng)有力的人物登高一呼，因此亨德?tīng)枦Q定去冒一次險(xiǎn)。亨德?tīng)栂仁堑絺惗刂笓]上演了自己的歌劇《里納爾多》，敏銳地意識(shí)到英國(guó)存在更多的發(fā)展機(jī)會(huì)，最終于1712年重返倫敦并定居。此后，亨德?tīng)枮閲?guó)王劇院、王后劇院先后寫了近三十部歌劇，其中尤以場(chǎng)面宏大的《凱撒大帝》最為出名。

愛(ài)牙知識(shí)范文第3篇

此次我所率領(lǐng)的化妝師志愿者團(tuán)隊(duì)將為千余名演員化妝造型，由于化妝師人數(shù)極其有限，所以其中大部分演員的妝是在化妝師現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)下完成的，這與以往開(kāi)幕式的工作方式是不同的！

六大亮點(diǎn)之一：《奔跑》

星光人擺出“西關(guān)花窗”。由800名武警手持發(fā)光花束在三色光流的引領(lǐng)下急速跑動(dòng)匯聚，在場(chǎng)地中心定格為會(huì)徽－“西關(guān)花窗”。此時(shí)，一個(gè)奔跑著的巨大的機(jī)器人從空而降，最后與阿拉伯?dāng)?shù)字“1”相碰撞。

六大亮點(diǎn)之二：國(guó)旗

盲童手捧國(guó)旗感動(dòng)出場(chǎng)。這個(gè)方式另人耳目一新：一位盲童手捧國(guó)旗，在母親的引領(lǐng)下出場(chǎng)，20位殘疾人緊隨其后，與儀仗隊(duì)相會(huì)。儀仗隊(duì)在母子面前打開(kāi)國(guó)旗，盲童和母親深情地親吻并撫摸國(guó)旗。此時(shí)國(guó)旗奏唱，國(guó)旗升志，莊嚴(yán)之余絲絲暖流在心間涌動(dòng)。

六大亮點(diǎn)之三：入場(chǎng)式

母親獻(xiàn)禮運(yùn)動(dòng)員入場(chǎng)。400多殘疾人的母親率先出場(chǎng)，她們和現(xiàn)場(chǎng)眾多歌手一起用歌聲歡迎來(lái)自亞洲41個(gè)國(guó)家的殘疾人運(yùn)動(dòng)員入場(chǎng)。

六大亮點(diǎn)之四：《心聲》

手語(yǔ)帶領(lǐng)現(xiàn)場(chǎng)表達(dá)愛(ài)。8只巨大的發(fā)光鴿子從四周飛往舞臺(tái)中央，此時(shí)殘藝著名主持人姜馨田用手語(yǔ)帶領(lǐng)現(xiàn)場(chǎng)所有演員及六萬(wàn)名觀眾說(shuō)出“世界我愛(ài)你”，令人驚嘆的是后面的舞臺(tái)背景上真的用煙火和燈光打出了這句話！

六大亮點(diǎn)之五：《追夢(mèng)》

盲人美麗世界震撼亮相。《追夢(mèng)》主要是針對(duì)盲殘人士的，演員們扮演成螞蟻七星瓢蟲螢火蟲和青蛙，更有從空而降的蝴蝶和蜻蜓，營(yíng)造出童話般的夢(mèng)幻氣氛。

愛(ài)牙知識(shí)范文第4篇

    我有一個(gè)很懂事的弟弟,如果說(shuō)我還有什么值得驕傲的話,那么就是我這個(gè)懂事的弟弟了!

    因?yàn)榧业脑?弟弟跟我一樣,在逆境中選擇了面對(duì)風(fēng)雨,把自己煅煉得有個(gè)性,樂(lè)觀,有主見(jiàn)!

    弟弟的性格很好,同學(xué)朋友都很喜歡他,他學(xué)習(xí)也好,中升高的時(shí)候考上了我們那里最好的一所高中.縱使家里的環(huán)境是那樣的不好,但是他一樣可以把事情分得很清.不像我,做了很多無(wú)謂的爭(zhēng)扎,因?yàn)楦赣H的出格,曾無(wú)數(shù)次給父親寫信,不回家等等,最后還是喚不回父親的心,還是離開(kāi)了我們.所以有時(shí)候我覺(jué)得我很笨,相反,我小弟不會(huì),他會(huì)跟父親舉例說(shuō),這樣做不行,雖然也沒(méi)效果,但是他撐過(guò)來(lái)了,還是能考上最理想的學(xué)校!

    弟弟很愛(ài)媽媽,也很愛(ài)我跟妹妹.記得去年小弟大一暑假,他出來(lái)打暑期工,發(fā)了第一份工資,就是買好的菜回來(lái)給我們吃,然后帶上我跟妹妹一起去狂街,給我跟小妹買了好幾套衣服!這是他人生中第一份工資,雖然他應(yīng)該把他留作當(dāng)學(xué)費(fèi),但是他選擇了拿他人生的第一分薪水來(lái)好好表達(dá)他對(duì)我們的心!

    弟弟很有耐心,因?yàn)槊妹貌皇呛芏?我和弟弟輪流著教妹妹.我跟弟弟的教育方式不一樣,我心比較急,看到教了一次又一次,妹妹還是聽(tīng)不進(jìn)去,我會(huì)很氣.但是弟弟不會(huì),弟弟文化比我高,他會(huì)教妹妹講幾句簡(jiǎn)單的英語(yǔ),妹妹問(wèn)了一遍又一遍,他也不會(huì)生氣,他會(huì)慢慢的跟妹妹解說(shuō).還會(huì)勸我慢慢來(lái)!

    弟弟妹妹很貼心,放假的時(shí)候,他們會(huì)過(guò)來(lái)我邊,我租了個(gè)單間,才五十幾平方的地方,地上輔上報(bào)紙,再放上被子就睡覺(jué)的空間,也許顯得妻涼,但我們過(guò)得很開(kāi)心!他們會(huì)煮好飯等我下班吃,有時(shí)候我會(huì)加班很晚,但是他們會(huì)等到我回來(lái)才吃!吃完飯后,我們?nèi)愕軙?huì)一起去散散步,到外面走走!

    有時(shí)候星期天我會(huì)出去幫人做賬,因?yàn)槲冶粨尡煌颠^(guò),所以只要他在我這邊的時(shí)候,他會(huì)陪我一起去,會(huì)比較放心,也可以陪陪我.他跟我去到別的公司,會(huì)有那些同事跟他聊天,因?yàn)樾〉鼙容^健談也喜歡學(xué)一些他不知道的東西.對(duì)于弟弟來(lái)說(shuō),外面很多事情他都想知道和去學(xué),不管是什么,他總是很有分寸的去學(xué)!

    弟弟很細(xì)心.放假,我們?nèi)忝镁鸵黄鸪鋈ネ姹本┞?上下九.在沒(méi)空調(diào)的公車上很熱,妹妹的身都溫了,弟弟會(huì)幫妹妹把背后的衣服來(lái)回的拉,以至可以讓背后涼一點(diǎn).看到我和妹妹的熱跑出來(lái)了,他會(huì)給我們遞紙幣......

    這兩年,我的收入算是比較穩(wěn)定了,我不再需要弟弟一邊上學(xué)一邊打工來(lái)賺錢做生活費(fèi)了,因?yàn)槲业男剿呀?jīng)足夠交起弟弟的學(xué)費(fèi)和生活費(fèi)了,我打電話讓他不要去做兼職,因?yàn)橄胱屗煤玫陌褜I(yè)讀好,課余也可以多背背英語(yǔ)和做他想做的事.他喜歡打籃球,但是因?yàn)橥砩弦蚬?那兼職很遠(yuǎn),單單是坐車來(lái)回兩個(gè)鐘),所以他很少運(yùn)動(dòng),加上前些年我的工作不穩(wěn)定,時(shí)有時(shí)無(wú)的給他寄生活費(fèi),讓他總是緊巴巴的,身體病了,他從來(lái)不向我說(shuō)!他不做兼職了,兩個(gè)星期后,他打電話跟我說(shuō):姐,好無(wú)聊呢,不打工好像好悶,有太多的時(shí)間了,我再找兼職...

    弟弟很聽(tīng)話,每隔一段時(shí)間,他都會(huì)給我跟媽媽打電話,問(wèn)我們?nèi)兆舆^(guò)得怎么樣,身體怎么樣,我心里知道我疼這個(gè)弟弟沒(méi)疼錯(cuò),因?yàn)樗饲?懂親情,所以我很愛(ài)我這個(gè)弟弟.雖然我年齡不小了,但是為了他和媽媽,小妹,我想就這樣過(guò)一輩子我也無(wú)悔,因?yàn)槿藗儾恢?有些東西就是可以讓人用一生的時(shí)間去守候,而對(duì)于我來(lái)講,親情就是我一生的依靠!

    就有那么一部電視把親情演得很好,"守望幸福"真的把親情淋漓盡致的演繹出來(lái)了,我喜歡那片子,現(xiàn)在還有一部"銀杏飄落"也是,演得好,所以呀,人就得這樣對(duì)待親人!

    再過(guò)三年,弟弟就大學(xué)畢業(yè)了,等他出來(lái),我們就一起攢錢在廣州供房子,我們希望有一個(gè)真正屬于我們的家,不想再流浪,所以我等待著弟弟的出來(lái),這樣的話,家離我們就不在遙遠(yuǎn)!

    我相信我們姐弟一定會(huì)成功的,因?yàn)樯咸鞆牟惶澊墓?

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愛(ài)牙知識(shí)范文第5篇

1 材料和方法

1.1 試劑

ACC高轉(zhuǎn)移株ACCM、低轉(zhuǎn)移株ACC2由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。Trizol試劑盒（Life Technologies公司，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（TaKaRa公司，日本），MMP9抗體、山羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物及顯色劑DAB抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抗體（Bioworld Technology公司，美國(guó)），磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（phospho-rylation epidermal growth factor receptor，P-EGFR）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorylation extra-cellular signal-regulated kinase，P-ERK）、KGF抗體（Abcam公司，美國(guó)）。過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物（Millipore公司，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

ACC細(xì)胞培養(yǎng)：在RPMI 1640、10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1鏈霉素培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞傳代采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ACC2接種于培養(yǎng)面積為25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，設(shè)定壓力強(qiáng)度為103.74 kPa，根據(jù)加壓時(shí)間不同將實(shí)驗(yàn)組分為3 h組、6 h組、12 h組、24 h組。另外將加壓培養(yǎng)的ACC2設(shè)置為陰性對(duì)照組，未加壓培養(yǎng)的ACCM設(shè)置為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4 免疫組織化學(xué)法半定量檢測(cè)EGFR的表達(dá)

將密度為5×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液滴于爬片中央，待細(xì)胞貼壁后，在孔板內(nèi)追加培養(yǎng)基，孵育過(guò)夜，于103.74 kPa加壓3、6、12、24 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min。所有的細(xì)胞爬片均按免疫ABC法進(jìn)行檢測(cè)。3%過(guò)氧化氫液37 ℃孵育20 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；羊血清37 ℃封閉30 min；滴加EGFR抗體4 ℃過(guò)夜，次日37 ℃復(fù)溫1 h；二抗37 ℃孵育30 min；辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物37 ℃ 30 min，DAB顯示1 min。設(shè)立空白對(duì)照：兔血清代替一抗；陰性對(duì)照：PBS代替一抗。顯微鏡下細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒即為EGFR表達(dá)陽(yáng)性。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase poly-merase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)MMP9和EGFR mRNA的表達(dá)取各組細(xì)胞，以Trizol試劑盒方法提取總RNA，取等量RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，經(jīng)Taq-DNA聚合酶作用擴(kuò)增目標(biāo)基因MMP9、EGFR、GAPDH。以GAPDH為內(nèi)參，分析MMP9和EGFR基因的mRNA水平。以未加壓組基因的表達(dá)量為基線，分析各處理組表達(dá)量的改變。MMP9引物序列：5’TCCAGTAGACAATCCTTGCAATGTG3’（正義鏈），5’CTC-CGTGATTCGAGAACTTCCAATA3’（反義鏈）；EGFR引物序列：5’GAGTAACAAGCTCACGCAG-TTG3’（正義鏈），5’GAGGAC ATAACCAGCCA-CCTC3’（反義鏈）；GAPDH引物序列：5’CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC3’（正義鏈），5’GTA-GAGGCAGGGATGATGTTCT3’（反義鏈）。

1.6 Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，以PBS清洗，加入細(xì)胞裂解混合液后，將細(xì)胞刮下，14 000 r·min-1離心15 min，取上清并[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]行蛋白含量測(cè)定。加入等體積5×SDS-PAGE上樣緩沖液，置沸水浴中加熱10 min。樣本在10% SDS-PAGE凝膠中電泳，電壓100 V。電泳完成后濕轉(zhuǎn)或半干PVDF膜上，再將此膜于4 ℃封閉過(guò)夜。次日按Western blot試劑盒說(shuō)明書，利用抗人MMP9、EGFR、P-EGFR、KGF、P-ERK單抗進(jìn)行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 加壓環(huán)境對(duì)細(xì)胞內(nèi)EGFR表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明：陰性對(duì)照組ACC2低表達(dá)EGFR，隨著加壓時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組EGFR表達(dá)逐漸增加，整體呈時(shí)間正相關(guān)性，加壓12 h后達(dá)到最大，與陽(yáng)性對(duì)照組ACCM的表達(dá)接近（圖1）。

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明：1）與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組EGFR的表達(dá)量在加壓3 h后達(dá)到峰值，超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照組中EGFR蛋白表達(dá)量，但是其蛋白表達(dá)量并未隨著加壓時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增加，在加壓24 h后降至與陰性對(duì)照組相似水平。盡管EGFR的表達(dá)量未體現(xiàn)出明顯的時(shí)間相關(guān)性，但在加壓后，總蛋白的表達(dá)量仍有明顯的上調(diào)。2）實(shí)驗(yàn)組P-EGFR的表達(dá)量呈時(shí)間正相關(guān)性，隨著加壓時(shí)間的延長(zhǎng)，P-EGFR蛋白表達(dá)量逐漸增長(zhǎng)，并在加壓24 h后達(dá)到峰值，而陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組中P-EGFR均為低表達(dá)（圖2）。

2.2 加壓環(huán)境對(duì)MMP9和EGFR mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果表明：MMP-9和EGFR mRNA的表達(dá)量在加壓6 h開(kāi)始上 調(diào)，在加壓24 h達(dá)到最大，表達(dá)量整體表現(xiàn)出時(shí)間正相關(guān)性。MMP-9加壓24 h后其表達(dá)量是陰性對(duì)照組的3.8倍，EGFR加壓24 h其表達(dá)量是陰性對(duì)照組的4.5倍（圖3）。

2.3 壓力刺激對(duì)轉(zhuǎn)移黏附相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組隨著加壓時(shí)間的延長(zhǎng)，MMP9、KGF、P-ERK蛋白的表達(dá)量均逐漸增加。MMP9及P-ERK的表達(dá)量在加壓6 h后明顯增加，加壓24 h后略有降低；KGF的表達(dá)量與時(shí)間呈正相關(guān)，蛋白表達(dá)量在加壓24 h后達(dá)到最大。陰性對(duì)照組的MMP9、KGF、P-ERK均低表達(dá)。

3 討論

為了驗(yàn)證腫瘤微環(huán)境能與各種基因相互作用，本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)半定量檢測(cè)不同加壓時(shí)間對(duì)EGFR表達(dá)的影響，結(jié)果顯示ACC2細(xì)胞在間質(zhì)液壓升高的情況下上調(diào)EGFR表達(dá)量。為了更準(zhǔn)確地證明間質(zhì)液壓的升高可以影響EGFR蛋白水平的表達(dá)，本研究還采用Western blot方法檢測(cè)了EGFR及P-EGFR的表達(dá)情況，結(jié)果也證實(shí)了腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)液壓與ACC2中蛋白表達(dá)改變的相關(guān)性。

MMP9與細(xì)胞侵襲遷移能力相關(guān)，且ACC細(xì)胞的侵襲性與加壓時(shí)間呈正相關(guān)性[7]。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了MMP9的mRNA及蛋白表達(dá)量，RT-PCR結(jié)果顯示IFP的升高可從mRNA水平上調(diào)MMP9基因的表達(dá)，從而改變細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)一步證實(shí)了腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用；然而蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果卻是在加壓環(huán)境中MMP9的蛋白表達(dá)量并未隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增加，僅在加壓6 h及12 h后出現(xiàn)了表達(dá)高峰。筆者推測(cè)，在ACC中可能還存在其他的與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子。研究認(rèn)為：P-ERK的上調(diào)與ACC肺轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù)，歡迎您的光臨dylw.net]，KGF是與腺樣囊性癌密切相關(guān)的黏附相關(guān)分子，加之腫瘤微環(huán)境中IFP的升高也為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供了有利環(huán)境[4，8-9]。在本實(shí)驗(yàn)中筆者檢測(cè)了加壓環(huán)境中P-ERK及KGF在ACC中的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果在一定程度上證實(shí)了這兩種蛋白的表達(dá)量隨著加壓時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增加。這就為加壓環(huán)境中腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移能力增加提供了分子基礎(chǔ)。同時(shí)蛋白水平的檢測(cè)也證實(shí)了EGFR及P-EGFR的表達(dá)量隨著環(huán)境的改變而改變。這一結(jié)果表明腫瘤微環(huán)境可與腫瘤細(xì)胞相互作用，改變細(xì)胞的生物學(xué)行為。隨著IFP的升高，細(xì)胞內(nèi)與惡性表型相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)量增加，為ACC2侵襲轉(zhuǎn)移提供了分子基礎(chǔ)。

IFP的升高與調(diào)控血管生成的基因相關(guān)，降低其表達(dá)或者改善間質(zhì)流體動(dòng)力學(xué)可早期降低IFP，從而利于常規(guī)放化療的進(jìn)行[4]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ）、丙酮酸脫氫酶激酶1等基因產(chǎn)物可改變血管的滲透性，降低間質(zhì)液壓，改善細(xì)胞外酸化和缺氧，從而克服腫瘤微環(huán)境成為治療屏障這一問(wèn)題[10]。趨化因子受體CXCR4與腺樣囊性癌的組織學(xué)類型及轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)性。在高壓環(huán)境下黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）以及Src的激活有利于直腸癌細(xì)胞的黏附。那么IFP的升高會(huì)影響ACC細(xì)胞的黏附能力嗎？能否解釋ACC的極易復(fù)發(fā)、早期轉(zhuǎn)移以及神經(jīng)侵襲性的生物學(xué)行為呢？因此在今后的實(shí)驗(yàn)中，將繼續(xù)檢測(cè)與血管相關(guān)的分子（如血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、VEGF-A、VEGF-C及組織纖維蛋白溶酶原激活劑以及Src等）在加壓環(huán)境中表達(dá)量是否改變，進(jìn)一步建立體內(nèi)模型；并且，利用VEGF抑制劑、CAⅨ以及丙酮酸脫氫酶激酶1的基因產(chǎn)物來(lái)改善腫瘤微環(huán)境中升高的間質(zhì)液壓，觀察ACC的生物學(xué)行為以及上述指標(biāo)的表達(dá)情況，為腫瘤治療提供理論依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤微環(huán)境中間質(zhì)液壓的升高可從mRNA及蛋白水平兩方面影響MMP9、KGF、P-ERK的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲能力。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Jaso J， Malhotra R. Adenoid cystic carcinoma[J]. Arch Pa-thol Lab Med， 2011， 135（4）：511-515.

[2] Maruyama S， Cheng J， Yamazaki M， et al. Metastasis-asso-ciated genes in oral squamous cell carcinoma and salivary adenoid cystic carcinoma： a differential DNA chip analysis between metastatic and nonmetastatic cell systems[J]. Can-cer Genet Cytogenet， 2010， 196（1）：14-22.

[3] Fukumura D， Jain RK. Tumor microvasculature and microen-vironment： targets for anti-angiogenesis and normalization

[J]. Microvasc Res， 2007， 74（2/3）：72-84.

[4] Lunt SJ， Fyles A， Hill RP， et al. Interstitial fluid pressure in tumors： therapeutic barrier and biomarker of angiogenesis

[J]. Future Oncol， 2008， 4（6）：793-802.

[5] Rofstad EK， Tunheim SH， Mathiesen B， et al. Pulmonary and lymph node metastasis is associated with primary tumor interstitial fluid pressure in human melanoma xenografts[J]. Cancer Res， 2002， 62（3）：661-664.