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音標學習計劃范文第1篇

【關鍵詞】 高血壓 趨化因子 單核細胞 基因表達 逆轉錄聚合酶鏈反應 酶聯免疫吸附測定

原發性高血壓（essential hypertension，EH）是常見的心血管疾病，也是導致心腦血管疾病的重要危險因素。近年來，越來越多的學者認為EH是一種與遺傳、環境、代謝極為相關的復雜疾病[1～3]，當EH與其他相關危險因素并存時，單純的血壓控制只能使不到60%的患者獲益，而危險因素的干預才能獲得更大的益處。因此，積極探討EH的發病機制及其影響因素，對更有效的控制EH，減輕其危害已成為醫務工作者的共識。有學者研究發現，炎癥可能在EH的發病機制中起著重要的作用[4]，2007年2月～12月實驗檢測EH患者外周血單核細胞趨化因子1（monocyte chemotactic protein1，MCP1）蛋白水平及單個核細胞MCP1 mRNA的表達，探討外周血MCP1的變化與EH的關系。

1 對象與方法

1.1 對象及分組

按《中國高血壓防治指南（2005年修訂版）》[5]制定的標準，選取心血管科住院和門診新診斷或未經正規降壓治療的EH患者62例，同時選取血壓正常的30例健康體檢者作為對照組。排除繼發性高血壓、血栓出血性疾病、糖尿病、高脂血癥、感染、嚴重肝腎疾病、自身免疫性疾病及腫瘤性疾病，排除近期有手術或外傷史等影響MCP1的因素。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 人淋巴細胞分離液（上海捷瑞），Trizol試劑（美國Invitrogen），焦炭酸二乙酯（瑞興），逆轉錄試劑盒（Promega），PCR試劑盒（Promega），100 bp DNA Ladder Marker、D2000 DNA Marker（天根生化），人MCP1 ELISA 試劑盒（美國R＆D公司）；ULT13863三洋-80 ℃低溫冰箱(日本)，5745臺式冷凍離心機(德國)，Eppendorff centrifuge 5810R 高速離心機，Amersham核酸蛋白分析儀，PCR儀（PE geneAmp PCR System 2400）（Perkin Elmer），DNA成像分析儀（Gel Doc EQ，BioRad），酶標儀（ELx800，BioTek公司）。MCP1引物設計由上海生工合成，上游引物5' AGGAAGATCTCAGTGCAGAGG 3'，下游引物5' – AGTCTTCGGAGTTTGGGTTTG 3'；βaction：上游引物5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT 3'，下游引物5'GGGCACGAAGGCTCATCATT 3'。

1.2.2 標本采集 受檢者空腹12 h，于次日清晨6∶00～7∶00采集肘正中靜脈血8 ml，其中4 ml置普通生化管中，室溫靜置2 h，自然凝固后予離心10 min，1 000 r/min收集上清液置于-80℃冰箱保存待測；另4 ml置于EDTA抗凝試管中搖勻后即刻置40 ℃冰箱冷存，于6 h內提取RNA用。

1.2.3 外周血MCP1蛋白含量測定 用保存待測的血清，依照MCP1 ELISA試劑盒說明書的步驟操作。用酶標儀檢測450 nm波長下各孔吸光度，根據吸光度值計算標本中MCP1的濃度。

1.2.4 人血單個核細胞中RNA提取和逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR） 淋巴細胞分離液提取外周血中單個核細胞后，按照說明書的步驟提取總RNA；按逆轉錄試劑盒說明書步驟合成cDNA，并用PCR技術擴增目的片段，PCR產物用1.5% 瓊脂糖凝膠跑電泳，溴乙錠顯色。測定各條帶灰度值，以βactin為內參，用MCP1與βactin的灰度比值定量MCP1。

1.2.5 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件進行數據分析處理，數據以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 一般資料

EH組及對照組的一般資料見表1。兩組研究對象的年齡、性別、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、總膽固醇、空腹血糖和外周血白細胞比較，無統計學差異。表1 EH組及對照組的基本資料注：TC示總膽固醇，TG示甘油三酯，FBG示空腹血糖，LDL示低密度脂蛋白，HDL示高密度脂蛋白，WBC示白細胞。

2.2 MCP1水平及MCP1 mRNA表達

見表2。與對照組比較，EH組外周血MCP1蛋白水平及單個核細胞MCP1mRNA表達均顯著增高（P＜0.01)。表2 外周血MCP1水平及單個核細胞MCP1mRNA表達注：（1）與對照組比較， P＜0.01。

3 討論

EH是最常見的心血管疾病之一。傳統觀念認為，EH是多種因素引起的血液流變學異常，表現為心搏出量和（或）外周阻力增加，治療目標也僅限于用藥物控制血壓。隨著對EH發病機制的深入研究，發現在EH發生發展的不同階段，血管炎癥是一個主要的、共同的病理特征，提示EH與炎癥關系密切[6]。

MCP1為堿性蛋白，屬于趨化因子超家族，可由炎癥介質刺激的單核-巨噬細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、內皮細胞及平滑肌細胞分泌。MCP1在體內及體外均有強大的誘導單核-巨噬細胞聚集、附壁、游走的功能，是炎癥的始動因子及標志[7]。研究發現，原發性高血壓患者外周血MCP1蛋白含量升高，認為EH可能是一種慢性炎癥過程[8]。本研究顯示，EH患者外周血MCP1蛋白水平顯著升高，提示MCP1可能參與了EH的病理生理過程。因此，積極探索控制炎癥的方法可能是高血壓乃至冠心病具有前景的治療策略之一。

EH患者外周血MCP1升高的機制尚不十分明了，可能來源于與內皮細胞、血管平滑肌細胞等上調表達MCP1 mRNA有關，但外周血MCP1蛋白的升高是否與外周血單個核細胞中MCP1 mRNA表達上調有關尚未見報道。本研究顯示，與對照組比較，單純EH組外周血單個核細胞中MCP1 mRNA表達顯著增高，提示外周血單個核細胞的MCP1 mRNA表達上調可能是導致EH患者外周血MCP1蛋白含量升高的一個因素，但是否與內皮細胞等其它因素有關，需進一步實驗證實。由于MCP1蛋白可能進一步激活CCR2趨化因子受體，介導趨化活性，使單核細胞和巨噬細胞發生移行，黏附于血管內皮細胞，進一步損傷血管內皮[9]，使其產生更多的炎癥因子，加速血管重構，使血管壁順應性下降，從而使血壓升高。因此，針對炎癥的治療，或許對控制血壓有一定意義。

參考文獻

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音標學習計劃范文第2篇

【摘要】 目的 構建細粒棘球蚴鐵蛋白基因的重組表達質粒ferritin/pET-28a，表達、純化出重組蛋白，并對重組蛋白的免疫學特性進行初步研究。方法 將目的基因亞克隆至表達載體pET-28a，轉化入大腸桿菌BL21(DE3)plysS，加入IPTG對其進行誘導表達。通過Ni2+的His-bind樹脂柱純化出重組蛋白，用50μg/100μL免疫ICR小鼠，獲得抗血清，通過western-blot及ELISA對重組鐵蛋白的免疫學特性進行初步研究。結果 表達并純化出分子量約19kD重組鐵蛋白，western-blot顯示重組蛋白免疫制備的抗血清可識別純化的重組蛋白及抗原囊液、原頭蚴，位置大致相同，約19kD。ELISA結果顯示實驗組小鼠與對照組小鼠血清中IgG的OD值有統計學意義(P＜0.01)。結論 細粒棘球蚴重組鐵蛋白Eg.ferritin具有較好的抗原性及免疫原性，具有成為包蟲疫苗候選分子的潛能。

【關鍵詞】 細粒棘球蚴；重組鐵蛋白；純化；免疫特性

鐵蛋白(ferritin)是普遍存在于生物體內的一種保守性較高的多功能多亞基蛋白，其作用是儲存鐵，對生物體內鐵含量進行調控，在生物體內鐵含量過多時起到解毒作用［1-2］，它的存在保證了生命體的正?；顒?。本實驗中心已構建了重組表達質粒ferritin/pGEX-6p-1，但由于重組蛋白ferritin/GST以包涵體形式存在于細胞中，無法通過親和層析柱純化出單一的Eg.ferritin［3］。只能通過切膠純化的方法獲得融合蛋白Ferritin/GST，雖然試驗結果說明該融合蛋白具有較好的抗原性及免疫原性，但影響蛋白特性的因素較多，不能很好的反映蛋白的實際特性，因此本次試驗將鐵蛋白基因重組到表達質粒pET-28a中，pET-28a是個高效表達載體，能純化變性及非變性的蛋白，通過表達純化可獲得較純的Eg.ferritin，以便更好地研究蛋白的特性，為鐵蛋白能成為包蟲病候選疫苗提供依據。

1 材料與方法

1.1 質粒與菌種 Eg.ferritin/pGEM-T/JM109及E.coli BL21(DE3)plysS由本室保存；pET-28a表達載體購自Novagen公司。

1.2 試劑 T4連接酶、限制性內切酶BamH I、Not I、IPTG、N'N'N'N-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自Promega公司；β-巰基乙醇、二甲基亞砜、弗氏完全(不完全)佐劑、過硫酸銨、Tween-20等試劑購自于SIGMA公司；考馬斯亮藍購自BIOMOL公司；酵母提取物、蛋白提取物購自OXOID公司；蛋白預染Marker購自北京賽百盛；卡那霉素、TMB、4-氯-1-奈酚購自AMRESCO；羊抗鼠HRP-IgG、質粒DNA提取試劑盒等購自北京華美公司；DNA純化回收試劑盒購自北京賽百盛生物有限公司；標準蛋白分子量Marker 購自中國科學院上海生物化學研究所；含Ni2+的His-bind樹脂純化試劑盒購自Novagen公司；其它常用試劑為國產分析純。

1.3 實驗動物 ICR小鼠，6～8周，(18±2)g，雌性，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供。

1.4 Eg.ferritin/pET-28a重組質粒的構建及鑒定 取Eg.ferritin/pGEM-T/JM109菌株劃板接菌［4］，并挑單個菌落進行培養，通過堿裂解法提取重組質粒；同時取適量的表達載體pET-28a，將兩者分別用BamH I，Not I進行雙酶切處理，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離帶有雙黏性末端的目的片段和表達載體，切膠，經DNA回收試劑盒純化目的片段及載體。目的片段與表達載體在T4連接酶的作用下，16℃連接過夜。繼而將連接產物轉化到已制備好的感受態菌BL21(DE3)plysS中［5］，經含卡那霉素終濃度為50μg/mL的LB固體培養基篩選陽性菌株［6］。挑取陽性菌株含卡那霉素的LB培養基中振蕩培養，經質粒提取試劑盒純化重組質粒，用限制性內切酶BamH I，Not I進行酶切鑒定。

1.5 重組鐵蛋白的表達、純化

1.5.1 重組蛋白的表達 將重組菌接種于含卡那霉素(終濃度為50μg/mL)的3mL 的LB培養基中，37℃ 200 r/min 振蕩培養數小時，按1∶50接種于50mL培養基中，37℃，220 r/min，培養至OD600=0.5時，加入IPTG至終濃度為0.05mmol/L，繼續振蕩培養6h，4℃ 4000r/min 離心15min，棄上清，收集細菌沉淀，SDS-PAGE觀察表達情況。

1.5.2 表達產物的鑒定 將樣本與2×SDS-PAGE樣本緩沖液混合，經12% SDS-PAGE，180V電壓，電泳至溴酚蘭指示劑到膠底為止，用0.2%考馬斯亮藍R250染色2h，用含7%冰醋酸5%甲醇的脫色液脫色至本底無色。

1.5.3 重組抗原的純化及制備 對細胞進行裂解，發現重組蛋白以包涵體的形式存在，按照Novagen公司His-bind樹脂純化試劑盒說明書中的包涵體大量純化方法進行純化，然后將純化好的包涵體蛋白放入透析袋中，用1×PBS透析去除尿素。

1.6 動物免疫及特異性抗血清的制備

1.6.1 動物免疫 ICR小鼠分兩組，即免疫組與對照組，每組10只。1)免疫組每只注射弗氏佐劑與重組抗原Eg.ferritin的乳化劑50μg/100μL。對照組注射弗氏佐劑和PBS的乳化劑100μL。根據Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝膠分析系統對純化的抗原進行定量。2)免疫方法 每組小鼠在0、2、4周各免疫1次，共3次，第1次基礎免疫用弗氏完全佐劑，以后2次為加強免疫均用弗氏不完全佐劑。采用背部皮下多點注射免疫，每次注射量為100μL/只。分別于0、2、4、6周斷尾采血，共4次，8周眼眶取血并處死小鼠。

1.6.2 特異性抗血清的制備 將血液4000r/min 離心 10min，提取血清，-20℃保存。

1.7 血清特異性識別 純化的重組抗原Eg.ferritin、天然可溶性抗原囊液、原頭蚴通過10%分離膠及5%的濃縮膠，180V電壓下進行SDS-PAGE電泳 1h。在30mA下對硝酸纖維膜進行印跡轉移1h。然后將硝酸纖維膜浸入5%的脫脂奶粉溶液中，37℃ 封閉1h，以PBS-T(PBS中含0.5‰ Tween-20)溶液洗3次，每次5min。再將硝酸纖維膜剪開分別浸泡于1∶100稀釋的Eg.ferritin免疫的特異性小鼠抗血清及對照組鼠血清中，4℃ 過夜。次日將膜用PBS-T溶液洗3次，每次5min，然后與1∶1000稀釋的羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)結合，37℃反應1h。再以PBS-T溶液洗4次，每次10min。加入新配制的底物液(6mg 4-氯-1-奈酚，2mL冷甲醇，10mL的TBS，12μL的H2O2)37℃顯色5min，最后用蒸餾水沖洗終止反應。

1.8 抗血清中IgG的測定 采用ELISA法，用純化的Eg.ferritin 5μg/mL包被酶標板100μL/孔，4℃過夜。次日，PBS-T洗3次，5％牛奶封閉100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗3次，取0～8周的免疫組及對照組小鼠血清作為一抗，按1∶100稀釋，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，羊抗鼠HRP-IgG為二抗，按1∶1000稀釋，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，加入顯色劑100μL/孔，待對照孔顯色時，加入2M H2SO4 50μL/孔 終止反應。以包被抗原及進行牛奶封閉的孔為空白調零，置酶標儀450nm波長處測OD值。

1.9 統計學方法 應用SPSS11.0統計學分析軟件，采用兩樣本t檢驗的方法對測定的OD值進行分析。

2 結果

2.1 表達質粒Eg.ferritin/pET-28a的酶切鑒定

將構建的重組表達質粒Eg.ferritin/pET-28a 用限制性內切酶BamH I和Not I 雙酶切后，經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測到插入片斷大小約560bp，與目的基因片段相符。M1.Lambda DNA/HindⅢMarker；1.pET-28a空質粒；2.Eg·ferritin/

2.2 Eg.ferritin 的純化

含Ni2+的His-bind樹脂親合柱純化Eg.ferritin/pET-28a表達的蛋白，經SDS-PAGE，根據標準蛋白分子量可知，純化蛋白的分子量約19kD.

2.3 特異性抗血清識別純化蛋白和天然抗原

純化Eg.ferritin免疫小鼠制備的抗血清可特異性識別未純化的重組Eg.ferritin，純化的Eg.ferritin 及天然抗原(原頭蚴、囊液)，識別蛋白條帶的位置大致相同約19kD(見圖3)。

2.4 小鼠血清IgG水平變化

根據對小鼠血清IgG水平在0～8周變化趨勢的檢測及對免疫組和對照組小鼠血清IgG的比較發現，小鼠血清中IgG的水平隨著免疫次數及時間的延長呈上升趨勢，免疫4周以后同一時期的免疫組小鼠血清中的IgG水平明顯高于對照組(P＜0.01)。表1 兩組小鼠免疫不同時間血清IgG水平變化

3 討論

本實驗將細粒棘球蚴鐵蛋白基因重新克隆到表達載體pET-28a上，主要考慮：① pET-28a表達載體具有高效表達的能力［7］；② pET28a質粒在插入目的DNA后表達的蛋白N 末端含6個組氨酸，它作為His標簽蛋白，可與Ni2+鰲合，使得重組融合蛋白在變性或非變性狀態下均可被含Ni2+的His-band 樹脂親合柱純化，即使被純化的重組蛋白含量很低也能被有效地純化出來?？朔吮局行囊呀洏嫿ǖ闹亟M表達質粒ferritin/pGEX-6p-1表達的重組蛋白ferritin/GST不能通過GSTTrapTMFF親和層析柱純化的弊端［3］；③重組蛋白是標簽蛋白His和目的蛋白共同組成的融合蛋白，為獲取目的蛋白，本應通過相應的剪切酶將標簽蛋白剪切下來，但由于N-末端組氨酸所表達的蛋白分子量很小，它的存在不改變目的蛋白的活性，所以無須去除。這不僅能減少實驗步驟，降低純化蛋白在酶切過程中的損失，同時還可節省用來購買剪刀酶的費用，為后續研究提供了較好的實驗材料?；诖宋覀兊玫搅艘粋€高效表達且易于純化重組蛋白的基因工程菌株，并得到了較純的重組蛋白，進行動物實驗。通過實驗說明Eg.ferritin作為抗原可誘導動物產生較強的的體液免疫應答，證明其有良好的抗原性；免疫血清與細粒棘球蚴天然抗原(囊液和原頭蚴)的Western blot實驗結果顯示，免疫血清能夠較好地識別天然抗原中位于19kD處的條帶，說明Eg.ferritin具有較好免疫原性，由此推測中國大陸株細粒棘球蚴鐵蛋白基因具有作為包蟲疫苗候選分子的潛能，為進行重組鐵蛋白對宿主的免疫保護性及保護性機制等方面研究的可能性提供了依據。

參考文獻

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音標學習計劃范文第3篇

【關鍵詞】癌；肝細胞；NF-κB；免疫組織化學；表達

文章編號：1009-5519（2008）12-1746-03 中圖分類號：R73 文獻標識碼：A

核轉錄因子（NF）-κB是與免疫球蛋白κ輕鏈增強子B區結合，具有和某些基因上啟動子區固定核苷酸序列結合而啟動該基因轉錄的蛋白質。NF-κB是具有多向性調節作用的核轉錄因子，可調控多種基因(免疫、炎癥反應、病毒和原癌基因)的轉錄表達[1]。激活的NF-κB參與癌癥的啟動、發生及發展過程，在炎癥性相關的肝癌（HCC）發生發展中呈高表達，在肝細胞炎癥與癌變間起橋梁作用，其中包括肝臟免疫炎癥反應相關基因、肝炎病毒相關基因和原癌基因的轉錄表達。在肝癌組織中異常激活，可抑制細胞凋亡，促進肝細胞存活，與肝癌的發生發展密切相關[2]。本文采用免疫組織化學方法，分析了按自身配對法留取的肝癌患者術后肝癌的癌灶組織和癌周組織標本中NF-κB表達、胞內分布及其臨床病理特征。

1 材料和方法

1.1 研究對象：于2005～2007年間，按自身配對法收取南通大學附屬醫院原發性肝癌患者35例(男29例，女6例)術后新鮮肝臟組織，分別留取肝癌切除后的癌灶組織、癌周組織(距癌灶邊緣5 cm)各35份(每份約200 mg)，除部分作組織病理學檢查外，其余置組織-85℃保存。35份標本中肝癌腫塊直徑≥5 cm 7例，

1.2 試劑與標本切片：兔抗人NF-κB多克隆抗體及S-P免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。新鮮肝組織標本經取材，以10％中爾馬林固定，石蠟包埋，制成厚度4 μm的組織切片。

1.3 免疫組織化學分析NF-κB（S-P法）：NF-κB在癌組織和癌周組織中的表達均采用免疫組織化學S-P法。4 μm厚的組織切片按常規脫蠟、水化；雙氧水阻斷內源性過氧化物酶；高壓加熱法修復抗原；正常動物血清封閉非特異性結合；滴加NF-κB抗體，4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗；滴加生物素標記的第二抗體，室溫孵育10 min，PBS漂洗；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育10 min，PBS沖洗；滴加新鮮配制的四鹽酸二氨基聯苯胺(DAB)溶液，室溫顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素復染。無水乙醇脫水透明、封片。OLYMPUS BX 50光學顯微鏡觀察、攝像。以0.01 mol/L PBS液(pH=7.5)分別替代一抗、二抗和SP試劑作陰性對照，已知表達NF-κB的肝癌組織作陽性對照。

1.4 NF-κB判斷標準：肝組織中NF-κB表達強度，以陽性細胞數≥10%作為陽性判斷標準，進而根據陽性細胞百分率分為NF-κB表達弱陽性(+)：陽性細胞數為10%～25%；NF-κB表達陽性(++)：陽性細胞數為26%～75%；NF-κB表達強陽性(+++)：陽性細胞數>75%。

1.5 統計學處理：以stata7.0統計軟件分析和處理數據。計數資料以卡方檢驗或Fisher確切概率法分析和處理，以P

2 結果

2.1 肝癌組織中NF-κB表達的胞內分布與定位：肝癌組織及其癌周組織中NF-κB陽性表達呈棕黃色。癌組織中NF-κB表達呈巢狀分布，深染，細胞胞漿和細胞胞核均呈陽性；而它對應的癌周組織NF-κB陽性表達，主要定位于胞漿，而細胞核無明顯的陽性著色。鏡下定性觀察肝癌組織中NF-κB表達強度明顯高于癌周組織。

2.2 肝癌與癌周組織中NF-κB表達差異：肝癌的癌灶組織與癌周組織中NF-κB表達差異見表1。

2.3 肝癌組織NF-κB表達的病理學特征分析：見表2。NF-κB在癌組織的陽性率為100%，其NF-κB表達強度與腫瘤的分化程度、腫瘤數目、HBsAg和腫瘤大小間的關系，經確切概率法分析，各組間均差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 癌旁組織NF-κB表達的病理學特征分析：癌旁組織中NF-κB表達與癌灶組織相比，表達強度低，有近1/3的癌旁組織中未見NF-κB的表達。NF-κB表達的病理學特征見表3，NF-κB在癌旁組織的陽性率為68.6%(24/35)，NF-κB表達強度與分化程度、腫瘤數目、HBsAg、腫瘤直徑間的關系，經確切概率法分析，各組差異無顯著性(P>0.05)。

3 討論

NF-κB是一個具有廣泛生物活性的轉錄因子，受多種信號途徑調控，同時也調控多種信號途徑，作為細胞內信號傳遞的一個樞紐參與多種生理過程的調控，其表達異常會導致機體的多種病理改變[3]。NF-κB主要存在于胞質中，與NF-κB抑制蛋白(IκB)家族成員結合，形成無活性的三聚體。當其受到細胞因子、有絲分裂原、病毒等刺激后，IκBα通過磷酸化、泛素化而降解，從而使NF-κB的核定位信號暴露，NF-κB進入到細胞核內，與靶基因的κB位點結合，從而發揮其轉錄調節作用[4]。NF-κB在炎癥與腫瘤的聯系中起作用，是調控癌細胞凋亡的主要因子，能調節腫瘤的血管生成與侵襲能力[5]。我們采用免疫組織化學方法，分析了人肝癌及癌周組織中NF-κB的組織分布及其臨床病理特征。在眾多被感染和炎癥所活化的信號途徑中，NF-κB也許是腫瘤促進機制中最重要的一環，因為NF-κB是抗凋亡基因表達的主要激活子。研究中發現NF-κB的表達陽性率在肝癌組織明顯高于癌周組織，且陽性強度亦明顯高于癌周組織，對照臨床資料分析發現在肝癌組織中NF-κB的陽性率及強度與分化程度、腫瘤數目、腫瘤直徑均未見統計學差異，是否與病例選擇有關，還有待探討。NF-κB表達的定位分析發現，在肝癌組織中有點灶狀的胞核陽性，而在癌周組織未發現有胞核陽性，提示NF-κB在激活后進入胞核發揮其轉錄活性，從而參與肝癌的發生發展[6]。

HCC是由病毒、化學致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相關基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新復活等諸多因素引起肝細胞生長失控而致癌變，經啟動、促進、演變多階段的發病過程，并與基因調控和表達等密切相關[7]。肝炎病毒(HBV和HCV)的慢性持續感染是肝癌發生的主要背景[8]。文獻報道HBV病毒感染誘導和激活NF-κB表達，但在本組資料中僅分析NF-κB表達與HBsAg之間的關系，結果顯示HBsAg陽性的病例癌組織與癌周組織NF-κB強度均有高于HBsAg陰性病例的趨勢，在統計學上未見有明顯差異。在肝癌組織中NF-κB表達與HBV復制的關系待進一步研究。

多基因、多階段癌基因或抑癌基因變異，構成肝癌發生、發展的分子基礎[9]。NF-κB表達，受多種信號途徑調控，同時也調控多種信號途徑，作為細胞內信號傳遞的一個樞紐參與多種生理過程的調控。肝癌發生過程中NF-κB過度表達，參與了肝癌的發生、發展[10]。NF-κB通過上調抗凋亡基因的表達等作用抑制細胞凋亡，從而參與腫瘤的發生發展，其在調控腫瘤的發生發展及凋亡的復雜信號網絡中處于中心環節，在肝細胞炎癥與癌變間起橋梁的關鍵作用，因此有望成為臨床上肝癌基因治療的理想靶點。

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音標學習計劃范文第4篇

【摘要】

目的探討川芎嗪對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導血管平滑肌細胞(VSMC)中血小板源生長因子（PDGF）表達的影響。方法培養大鼠主動脈VSMC，以 10-7mol/L AngⅡ刺激作為AngⅡ組 ，AngⅡ刺激前分別應用不同濃度川芎嗪預處理做為高、中、低劑量組，以正常的VSMC為對照組，測定VSMC增殖活度，免疫細胞化學法檢測培養24h時VSMC PDGF-B的表達。結果AngⅡ組VSMC增殖活度與 PDGF-B表達顯著高于對照組(P

【關鍵詞】 川芎嗪 血管緊張素Ⅱ 血管平滑肌細胞 血小板源生長因子

經皮冠狀動脈腔內成形術（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）后再狹窄一直是冠心病治療領域的一大難題，血管平滑肌細胞(vascular　smooth　muscle　cell，VSMC)異常增殖是PTCA術后再狹窄的一個重要病理改變［1］。有文獻報道，血管緊張素II(angiotensin II，AngⅡ)、血小板源生長因子（platelet-derived growth factor， PDGF）在VSMC增殖中作用明顯［2，3］。本研究以體外原代培養的大鼠主動脈平滑肌細胞為模型，觀察AngⅡ與PDGF-B表達的關系以及川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)對其影響，探討TMP對VSMC增殖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

體重120～150 g的健康雄性SD大鼠 （河南省實驗動物中心）。鹽酸川芎嗪注射液（無錫市第七制藥公司），DMEM培養基干粉（Sigma）、細胞培養器材、胎牛血清、胰蛋白酶購自華美生物工程公司；AngⅡ（Merck公司），PDGF-B抗體（博士德），sm-actin免疫試劑盒（Santa Cruz），其它試劑為分析純產品。

1.2 細胞培養與鑒定

將大鼠斷頭處死，無菌條件下迅速打開胸腔，取出胸主動脈，按組織貼塊法在細胞培養箱內以含20%胎牛血清的DMEM培養。光鏡下以及倒置相差顯微鏡下觀察細胞呈梭形，生長至融合狀態時呈現特有的峰與谷特點，同時經sm-actin免疫細胞化學染色鑒定，細胞純度達95%以上。選擇4-6代VSMC進行實驗。

1.3 實驗分組

①對照組(control)：不加特殊試劑，僅給予無血清DMEM培養；②AngII組：AngII 10-7mol/L培養；③TMP低劑量組：20 mg/L TMP預孵育30 min后，加AngⅡ培養；④TMP中劑量組：200 mg/LTMP預孵育30 min，加AngⅡ培養；⑤TMP高劑量組：2 000 mg/L TMP預孵育30 min，加AngⅡ培養。

1.4 檢測細胞增殖活度

采用MTT法。按上述方法接種于96孔培養板中培養48 h后終止，換無血清DMEM培養24 h，分組（同前）繼續培養24 h，每孔加入MTT溶液20 μl，吸去培養上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜振蕩；選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值（A值）。

1.5 免疫細胞化學法檢測

PDGF-B的表達0.25%胰蛋白酶消化制備細胞懸液，調整細胞密度為5×104/L，接種于內置有蓋玻片的6孔培養板中培養48 h，無血清DMEM培養24 h，分組（同前）繼續培養24 h。培養細胞爬片用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，0.3%過氧化氫中孵育10 min；滴加復合消化液后滴加封閉血清，37℃，30 min，滴加PDGF-B一抗（1∶200），4℃過夜，滴加二抗工作液，37℃孵育30 min；滴加SABC，37℃孵育30 min。DAB 顯色，中性樹膠封片。

1.6 計算機圖像分析

每一張涂片400倍顯微鏡下隨機選擇5個視野，計算其平均灰度值，數值越大表示抗原表達量越小。

1.7 統計學處理數據用±s表示

計算機統計軟件分析SPSS11.0，采用One-way ANOVA分析，兩兩比較LSD檢驗。

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2 結 果

2.1 TMP對AngⅡ刺激的VSMC增殖活度的影響

AngⅡ組細胞增殖活度明顯高于對照組（P

2.2 TMP對AngⅡ誘導的VSMC PDGF-B表達的影響

顯微鏡下觀察，PDGF-B陽性表達為VSMC胞漿與胞核呈棕黃色反應，主要為胞漿表達。與對照組相比，AngⅡ刺激24h后，VSMC表達PDGF-B顯著增強(P

3 討論

TMP是從中藥川芎中分離提純的有效成分，其化學結構為四甲基吡嗪。廣泛用于高血壓病、冠心病等的防治。研究表明TMP具有擴張冠狀動脈、抗凝、抗血小板聚集、抗心肌缺血/再灌注損傷降低血壓、降低肺動脈高壓以及抑制血管平滑肌細胞增殖等多種心血管藥理作用［4］。TMP可能通過抑制VSMC增殖發揮抗血管再狹窄作用，但其具體分子機制尚不清楚。

我們先前的研究表明［5］，血管損傷后再狹窄時血漿AngⅡ水平顯著升高，血管壁PDGF-B表達顯著增強。PDGF是由血小板、平滑肌細胞等分泌的一種糖蛋白，其家族目前至少有4個亞基，即PDGF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D。其中由PDGF-A，PDGF-B形成的同源二聚體具有強烈的促進有絲分裂及細胞趨化作用，在體外可刺激心肌細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞等多種類型細胞的肥大或增殖。PDGF與其膜表面受體結合，激活受體的內源性酪氨酸激酶活性，通過磷酸化胞漿中的信號分子，最終將信息傳遞到核內，導致VSMC增殖［6］。

本實驗結果顯示，AngⅡ誘導的VSMC PDGF-B表達水平顯著高于對照組，同時VSMC增殖活度增強。提示AngⅡ可以通過上調PDGF-B表達、增強PDGF-B介導的細胞信號通路進一步促進血管平滑肌細胞增殖；不同劑量的TMP作用后，AngⅡ誘導的VSMC PDGF-B表達水平顯著下調，VSMC增殖活度顯著減弱。說明TMP能抑制AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞增殖，該效應與抑制PDGF-B表達有關；在相同培養時間內，隨著TMP濃度增加，細胞增殖活度及PDGF-B表達水平逐漸降低，說明TMP的抑制作用具有量效關系。

綜上所述，川芎嗪對AngⅡ誘導的VSMC增殖有顯著抑制作用，其作用機制與抑制PDGF介導的信號轉導有關。

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音標學習計劃范文第5篇

【關鍵詞】 關節炎，類風關巴布劑；大鼠；核轉錄因子-κβ；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-1β

類風濕關節炎(RA)是慢性全身性自身免疫性疾病，其病理基礎為關節滑膜的過度增生，誘導異常增生的滑膜組織發生凋亡可能成為治療RA的有效途徑?；さ脑錾c凋亡之間的平衡受多種因素的制約，細胞因子是其因素之一。在眾多細胞因子中，腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β扮演著重要的角色。研究表明，TNF-α抑制細胞發生凋亡的機制受核轉錄因子-κβ(Nuclear factor-κβ，NF-κβ)的調控[1]， Yamasaki等[2]研究認為NF-κβ可能是治療RA的目標分子。本實驗通過對牛Ⅱ型膠原(BcⅡ)誘導關節炎(CIA)大鼠不同組合穴位貼敷類風關巴布劑，觀察其對大鼠滑膜細胞NF-κβ表達的影響，并初步探討經絡腧穴在其中的作用。

1 實驗材料

1.1 動物

Wistar大鼠，清潔級健康雄性，80只，體重(120±15)g，購

于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，正常飼養。

1.2 藥物與試劑

雷公藤、白花蛇舌草、乳香、沒藥；BcⅡ，Chondrex公司(美國)；完全弗氏佐劑，Sigma公司(美國)；IL-1βELISA kit購于Biosource公司(美國)；TNF-α ELISA kit購于Biosource公司(美國)；NF-κβ購于santa cruz Biotechnology，inc(美國)；多聚賴氨酸玻片100張，EiVision＋PolymerHRP(Ms/Rb) IHC Kit 6 mL。

1.3 儀器

顯微鏡OLYMPUS(日本)，低溫高速離心機BECKMEN(美國)，酶標儀Bio-rad680(美國)。

2 實驗方法

2.1 類風關巴布劑的組成及制作方法

雷公藤、白花蛇舌草、乳香、沒藥等，共12味，按固定劑量配伍(其中雷公藤占總藥量的28%)，曬干，研粉，過20目篩，用80%乙醇滲漉提取，然后過濾取液，經低溫低壓(50 ℃，-0.8個大氣壓)蒸餾去乙醇后得浸膏。將浸膏按一定比例加入事先配制的巴布劑基質(主要成分明膠、甘油、聚丙烯酸鈉等)中，并加入0.5%的促滲劑(氮酮)、一定比例的乳化劑及防腐劑等，充分溶合，均勻涂布于無紡布上，覆蓋聚乙烯薄膜，切成3 cm×3 cm的方塊(重量1 g)，密封包裝，陰涼處儲存備用。

2.2 造模和分組

隨機從100只大鼠中選出10只為正常對照，其余90只用于造模，參照文獻[3]方法配制成Ⅱ型膠原乳劑。具體方法為：在無菌條件下，用0.1 mol/L冰醋酸充分溶解BcⅡ，濃度為4 mg/mL，置4 ℃冰箱過夜后，與弗氏完全佐劑等體積混合、振蕩乳化，制成BcⅡ乳劑(即每0.5 mL含1 mg BcⅡ)。置4 ℃冰箱保存備用。注射方法：于大鼠背部及尾根分5點行皮內注射，每點0.1 mL，總量0.5 mL(含1 mg BcⅡ型膠原)。15 d后同法分2點皮內激發注射。正常對照組予以生理鹽水同法注射。初次免疫25 d后參照關節炎指數評分標準[1]對造模效果進行評估，評分達6分以上的大鼠被用于繼續實驗。將造模成功的大鼠隨機分為4組，即類風關巴布劑局部穴位貼敷組(局部組)、類風關巴布劑遠道穴位貼敷組(遠道組)、類風關巴布劑系統穴位貼敷組(系統組)和模型對照組(模型組)各10只。

2.3 給藥

根據臨床及有關動物實驗的取穴方案[4]取穴。系統組：大椎、雙側腎俞、雙側太溪，共5個穴點；遠道組：大椎、雙側腎俞，共3個穴點；局部組：雙側太溪，共2個穴點。根據貼敷總面積相同(劑量相等)的原則，系統組每穴貼敷面積為0.15 cm2的圓形巴布劑(半徑0.22 cm)；遠道組每穴貼敷面積為0.25 cm2(半徑0.28 cm)；局部組每穴貼敷面積為0.375 cm2 (半徑0.35 cm)。在穴位處脫毛后貼敷，每3 d貼敷1次，共5次，每次雷公藤甲素劑量約為3.8 μg[5]。正常組和模型組模仿局部組貼敷不含藥物的巴布劑基質。15 d后各組同時處死取標本。

2.4 取材

大鼠稱重，用2%戊巴比妥納腹腔麻醉，仰位固定，沿著左側后腿膝關節正中縱行切開皮膚直至暴露出膝關節位中心約3 cm×3 cm的區域。沿髕骨上緣約0.3～0.4 cm處向下切割至股骨，再分別沿髕骨兩側向下分離至脛骨，此時即打開了膝關節腔，可見由髕骨下極向下延續有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織。用眼科直鑷輕輕夾住其中央，用眼科剪完整剪下，置10%的中性甲醛中固定，用于檢測NF-κβ的免疫組織化學染色。同法取右側滑膜，滑膜取出之后，用生理鹽水1 mL沖洗關節腔，收集關節腔液和關節滑膜組織，用于IL-1β、TNF-α的檢測。

2.5 檢測指標

2.5.1 細胞因子的檢測

IL-1β、TNF-α活性測定采用ELISA法，按照所附說明書測定關節滑膜組織溶漿的活性。先加入標準品和待測樣品，設置陰性對照，加入生物素結合的一抗(IL-1β、TNF-α)，37 ℃溫箱孵育2 h，然后用洗滌液充分洗滌4次，向濾紙印干。加入辣根過氧化物酶標記的二抗工作液25 ℃孵育1 h，再用洗滌液充分洗滌4次，向濾紙印干。加入顯色液25 ℃孵育30 min后加入終止液。上機檢測吸光度值。

2.5.2 滑膜組織核轉錄因子-κβ的免疫組化ABC染色

準備組織切片(石蠟切片脫蠟至水，冰凍切片和細胞培養片用適當方法固定)；抗原修復(微波加熱法，適用石蠟切片)，將切片置于耐高溫容器中，注入抗原修復液，使切片位于液面以下。置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92～98 ℃之間并持續5 min，取出容器，室溫冷卻，30～50 min后降至室溫。用TBS 沖洗切片4～5次，甩干，擦凈，加20 μL 3% H2O2-甲醇溶液(Reagent F)，于室溫濕盒中封閉30 min。取出切片，用TBS沖洗4～5次，甩干，擦凈。用封閉液(Reagent B)20 μL覆蓋，室溫濕盒孵育30 min。用吸水紙將封閉液吸去，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗。37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜。TBS沖洗4～5次，甩干，擦凈。滴加生物素標記二抗(Reagent C)20 μL，室溫濕盒孵育1～2 h。TBS沖洗4～5次，甩干，擦凈。滴加酶標親和素(Reagent D)20 μL，室溫濕盒孵育30 min。TBS沖洗4～5次，滴加DAB工作液(Reagent E)約30 μL/片，著色后迅速(約1 min內)沖洗干凈。20 μL蘇木精(Reagent G)復染。沖洗干凈脫水封片，鏡檢。

2.5.3 核轉錄因子-κβ積分[6]

在滑膜組織中NF-κβ表達陽性的滑膜組織細胞核呈橘黃色或棕黃色，每張切片沿滑膜組織帶計算400倍視野中陽性細胞的占有率，計數3個視野，標出每個視野平均陽性細胞占有率，并按陽性細胞占有率分為5級：“0”為無陽性細胞，“+”為陽性細胞0～25%，“++”為陽性細胞25%～50%，“+++”為陽性細胞50%～75%，“++++”為陽性細胞75%～100%。0級積分為0，“+”積分為1，以此類推。

2.6 統計學方法

用SPSS11.0統計軟件，若數據為正態分布總體比較采用多組單因素方差分析，組間比較用q檢驗(Newman- Keuls法)，否則用秩和檢驗的Kruskal-Wallis法和Nemenyi法，P

3 結果

(見表1、表2)表1 各組大鼠滑膜細胞NF-κβ的表達(略)注：與模型組比較，P

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4 討論

NF-κβ是1986年由Sen和Baltimore首先報道[7]，并發現B細胞核提取物中有一種核蛋白能與免疫球蛋白K輕鏈基因增強子κβ序列特異結合，促進了K輕鏈的表達，被稱為NF-κβ。越來越多的證據表明，在RA發病的過程中，NF-κβ做為轉錄因子家族成員參與了滑膜組織的過度增生和炎癥過程[8]。NF-κβ在胞漿中與其抑制亞單位Ⅰ-κβ結合而處于未活化狀態，并可被TNF-α、IL-1β等不同的信號所激活，其活化則有賴于胞漿中Ⅰ-κβ的降解。在正?；?，NF-κβ的表達量很低[9]。在RA的滑膜中，免疫活性NF-κβ蛋白p50和p65大量表達于襯里層細胞和血管內皮細胞中[10]。NF-κβ的活化在RA早期滑膜炎癥和增生的過程中起中心罪犯作用[11]。

在正常細胞構成性表達活化的NF-κβ僅見于成熟B細胞、漿細胞和某些神經元中，而其他大多數細胞的NF-κβ需在外界的刺激誘導下發生激活。許多細胞外因素可誘導NF-κβ的活化，如炎性細胞因子TNF-α、IL-1β等，但最終都通過IKK使Ⅰ-κβ降解而與NF-κβ解離，暴露NF-κβ的NLS，使NF-κβ經核孔進入核內，與DNA靶序列結合，發揮轉錄調控效應；而NF-κβ的活化導致了許多基因的表達，以直接或間接的方式調節機體的生理和病理反應。在此過程中，TNF-α、IL-1β等前炎細胞因子在NF-κβ作用下生成增加，它們作為外界刺激因子進一步活化NF-κβ信號通路，產生正反饋放大作用，這是NF-κβ迅速動員、反應靈敏的重要條件。然而，由于NF-κβ活化導致大量細胞因子、酶等生物活性物質的產生，它的過度活化必然導致機體的病理反應和損傷，正常細胞內NF-κβ的活化是在細胞內外通路的正、負反饋的精細調節下，使NF-κβ的活化保持在適當的水平。正、負兩種反饋調節往往同時進行，NF-κβ是否處于活化狀態則取決于何種調節占優勢。

CIA的產生和發展與RA有著很多的相似性，二者都依賴于自身反應性T細胞和B細胞的激活，并能產生類似類風濕因子的抗體。Seetharaman等[12]在CIA大鼠的研究表明，對于Ⅰ型和Ⅱ型T細胞依賴的免疫應答而言，抗體誘導NF-κβ的活化主要導致T細胞依賴的免疫應答，抑制NF-κβ信號通路，使血清TNF-γ、IgG2a抗Ⅱ型膠原(CⅡ)抗體水平明顯下降而IgG1水平不變，CD8+T細胞減少，CIA發病率及嚴重性明顯減少和減輕。因此，本實驗選用CIA大鼠為模型。

RA屬于中醫學“痹證”范疇，近年來，大量研究認為雷公藤對CIA大鼠有效，并有采用含雷公藤的復方中藥穴位貼敷治療CIA大鼠的研究[13]。我們將以雷公藤為主藥的復方中藥制劑與針灸穴位有機結合，研制類風關巴布劑，并進行了毒理、制劑學及臨床的研究，在大鼠佐劑性關節炎穴位貼敷研究中，證明相同的給藥劑量(貼敷面積)不同的穴位組合作用有差異，以系統組(遠近配穴)最佳[14]。另據研究，雷公藤甲素可以下調CIA大鼠滑膜細胞TNF-α的表達，同時還可以有效抑制NF-κβ的表達與活性[15]。本實驗中，造模后NF-κβ積分水平明顯升高，治療后各組都有所下降，以系統組最接近正常，同時治療后各組滑膜浸液的TNF-α、IL-1β水平也有明顯下降。因此，類風關巴布劑穴位貼敷能夠有效打破NF-κβ與TNF-α、IL-1β之間的正反饋調節的惡性循環。

在本次實驗中，除了藥物的療效外，合理用穴也是關鍵要素，一方面，通過經絡腧穴給藥對藥效的放大作用來提高療效，另外，遠近配穴可能通過標本兼治，多靶點起效，使其整體療效優于單純遠道取穴或局部取穴。

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