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出納事跡材料范文第1篇

目的 通過對納米羥基磷灰石復合根充材料與傳統(tǒng)根管充填材料（充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑）進行細胞毒性、根管密合性及抑菌性的對比研究，評價納米羥基磷灰石復合材料的細胞毒性、根管壁密合度以及抑菌作用。材料與方法 細胞毒性實驗：體外培養(yǎng)成骨細胞，添加納米羥基磷灰石復合材料浸提液，并以培養(yǎng)液為陰性對照組，充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合糊劑為陽性對照組。根據(jù)ISO標準采用MTT法進行體外細胞毒實驗，測試不同浸提時間的材料浸提液與成骨細胞接觸1、3、5、7天的吸光度值，以評價其細胞毒性。根管密合性實驗：將10顆近期拔除的單根牙隨機分成2組，每組牙齒按常規(guī)方法進行根管預備。實驗組為40%納米羥基磷灰石復合糊劑充填，對照組為充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合糊劑充填。拍X線片以保證各組中實驗離體牙牙根均完善充填，充分硬固后，進行微滲漏試驗。改良葡萄糖檢測微滲漏分析裝置進行根管密合度實驗，30天后結(jié)果由葡萄糖定量分析儀測定。抑菌性實驗：將蘸有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液的棉拭子反復擦感染根管，進行細菌接種、分離、鑒別、培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果為變型鏈球菌、金黃色葡萄球菌二種可利用菌種，分別用血培養(yǎng)基、普通培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，對實驗組與對照組充填材料進行抑菌性實驗，觀察抑菌環(huán)大小，檢測出每組藥物的抑菌環(huán)直徑，取平均值計算。結(jié)果 細胞毒性實驗：實驗組與陰性對照組無顯著差異（P＞0.05），實驗組與陽性對照組有顯著差異（P＜0.05）。根管密合性試驗：對照組葡萄糖濃度明顯高于實驗組，有顯著性差異（P＜0.05）。抑菌性實驗：各組根充糊劑均有良好抑菌性，實驗組與對照組統(tǒng)計學差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)論 納米羥基磷灰石根充材料體外細胞毒性實驗陰性，有良好的生物相容性。納米羥基磷灰石復合根充材料其與根管壁密合度方面明顯優(yōu)于充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合糊劑，并具有良好的抑菌性。

【關(guān)鍵詞】 納米羥基磷灰石 根管充填 細胞毒性 微滲漏 抑菌性

根管治療術(shù)發(fā)展的總趨勢之一是研究無致癌傾向的、能夠嚴密堵塞根管的充填材料。本研究尋找一種新型的根管充填材料，有助于提高根管治療術(shù)的療效，更好地服務(wù)于口腔臨床。

1 材料和方法

1.1 實驗器材 納米羥基磷灰石，由南京愛普瑞納米材料有限公司；碘仿，哈爾濱市東北齒科材料加工廠；聚乙烯醇，國藥集團化學試劑有限公司；充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑，上海二醫(yī)張江生物材料有限公司；MTT，美國GIBCO公司；二甲基亞砜，美國GIBCO公司；胎小牛血清，美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液，美國Gibco公司；SD大鼠，浙江大學生物實驗中心。裂鉆、根管擴大針，登士柏牙科有限公司；肉湯培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基（GAM）、需氧培養(yǎng)基（BA）、厭養(yǎng)罐、微量生化管，明新生物技術(shù)研究所；BioRADModel-550酶聯(lián)免疫酶標儀，美國Sigma公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國熱電集團；Olympus IX-70倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS公司；超凈工作臺VS-1300-U，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；S2309A型牙科椅，西北醫(yī)療器械（集團）有限公司；ELITYS數(shù)字X光牙片機，上海復星醫(yī)療器械有限公司；廣口瓶、粘蠟、1mol/L無菌葡萄糖溶液、2ml／瓶無菌蒸餾水裝置、改良葡萄糖滴定微滲漏儀，佳木斯大學附屬口腔醫(yī)院。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞毒性實驗

1.2.1.1 材料浸漬液的制備 采用DMEM培養(yǎng)液配制納米羥基磷灰石根充糊劑浸提液。稱取20納米羥基磷灰石0.5g經(jīng)高壓滅菌后加入DMEM培養(yǎng)液10ml。振蕩混勻后在CO2細胞培養(yǎng)箱中37℃放置3d，3000r/min離心5min后取上清液，經(jīng)濾過除菌，放入4℃冰箱保存。實驗共分3組：實驗組為20納米羥基磷灰石浸提液，DMEM培養(yǎng)液為陰性對照組，0.05g/ml新調(diào)制的充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑浸提液為陽性對照組。觀察成骨細胞在不同培養(yǎng)液中的生長繁殖情況。

1.2.1.2 實驗動物與成骨細胞培養(yǎng) 新生3～5d SD大鼠，體重4～6g。在無菌條件下處死，75%乙醇中浸泡5min，無菌條件下取顱頂骨，放大鏡下徹底去凈附屬組織，剪成1mm3小片，D-Hank，s液洗滌3次， 用0.25%胰蛋白酶在37℃消化30min，然后移入0.1%膠原酶溶液中，37℃下震蕩消化60min，將含細胞的消化液在1500r/min下離心2次，每次5min沉淀物用DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸濁液，將細胞懸濁液按5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板加入DMEM培養(yǎng)液在37℃、飽和濕度，5%CO2和95%空氣孵箱內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入含有20%胎牛血清，待培養(yǎng)至70%～90%貼壁，細胞生長良好融合成單層后再傳代。

1.2.1.3 體外培養(yǎng)細胞懸液的配制 取生長良好的第四代成骨細胞，0.25%胰蛋白酶消化，毛細吸管吹打使貼壁細胞脫落，顯微鏡下記數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)為5×107個/L，接種入96孔板中，用加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基200μL培養(yǎng)6h，制成細胞懸液。

1.2.1.4 MTT比色法檢測 待細胞貼壁生長后舍棄原培養(yǎng)液， 分別加入含50g/L新調(diào)制的對照組制劑培養(yǎng)液，新鮮DMEM培養(yǎng)液，實驗組浸提液， 用96孔板每個實驗組6孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于3d、5d更換材料浸提液，于培養(yǎng)后1、3、5、7d 各取一塊培養(yǎng)板，然后每孔加入20μlMTT(5g/L) 溶液后37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸出每孔內(nèi)的浸提液，加入二甲基亞砜每孔150μl，室溫下16min后振蕩器振蕩培養(yǎng)板10min使結(jié)晶物充分溶解染色均勻，用酶聯(lián)免疫檢測儀在500nm波長測定各孔光吸收值，取6孔均值為樣本檢測值。

1.2.2 根管密合性檢測 收集近期拔除的單根離體牙10顆。標準：牙齒包括根尖孔，發(fā)育正常，無病變及折裂傷。刮凈結(jié)石及牙周膜纖維，放生理水中備用。10顆離體牙隨機分成實驗組及對照組。開髓，根管預備至40＃，紙尖吸干根管，室溫放置。將各組根充后的牙齒拍X光片證實所有牙根均完善充填。待材料充分硬固后，進行微滲漏試驗并檢測葡萄糖濃度。

1.2.3 根管充填材料的抑菌實驗 用瓊脂稀釋法，提取3～5個大小菌落入布氏培養(yǎng)液中作厭氧培養(yǎng)，24h后將二種菌按1:10稀釋并校正為1.5×108CFU/ml濃度待用，并將2種根充糊劑分別稀釋至0.9ug/ml待用。采用打孔瓊脂擴散法，將瓊脂均勻注入培養(yǎng)皿，待凝固后，用直徑為1cm的打孔器打孔，每個平板上均勻打孔2個，挑出孔中瓊脂，在孔中注入瓊脂1.0ml封孔底. 將校正后菌液涂布于均勻平皿表面，每種菌需涂布于3塊培養(yǎng)皿上，將稀釋的根充糊劑100mg加入后，將各培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。使用卡尺測量加藥孔周圍無菌生長區(qū)域的大小，即抑菌環(huán)直徑，測抑菌環(huán)的最大直徑和最小直徑取均值。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

實驗組和陰性對照組細胞毒性無顯著性差異（P＞0.05）；實驗組與陽性對照組有顯著差異（P＜0.05），見表1。實驗組與對照組根管密合度之間有顯著性差異（P＜0.05），見表2。實驗組與對照組抑菌試驗之間無顯著性差異（P＞0.05）見表3、表4。

表1 對照組及實驗組OD值（略）

表2 根充材料葡萄糖滲出量組別葡萄糖濃度 （略）

表3 金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)直徑（略）

表4 變形鏈球菌抑菌環(huán)直徑（略）

3 討論

3.1 細胞毒性研究 納米羥基磷灰石微結(jié)構(gòu)類似于天然骨基質(zhì)，可提高材料的生物活性、利用度和生物相容性，可提供適宜的環(huán)境促進膠原和礦物的沉積以及成骨細胞的黏附，納米羥基磷灰石提供了一個更適合骨形成細胞生長的界面從而促進與骨的結(jié)合［1］。充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑封閉劑導致根尖應急炎癥反應，這可能是從材料中游離出的酚、醛［2］與組織液接觸導致了持續(xù)的炎癥反應，會在短時間內(nèi)釋放大量的酚和醛:一方面酚通過抑制前列腺紊和白細胞介素的合成使尖周炎癥緩解另一方面酚可抑制尖周神經(jīng)的活性，影響細胞介導的免疫反應，低濃度的酚能激活抑制性T細胞，高濃度的油酚卻殺傷該細胞而對尖周組織產(chǎn)生細胞毒作用，但是硬固后毒性降低。

MTT比色法可以準確、快速、靈敏地反映細胞增殖程度和細胞毒性程度［3］，因此MTT比色法用于評價材料細胞毒性的常用實驗方法［4］。將細胞增殖度法與細胞的形態(tài)學觀察相結(jié)合，可以更加有效地評價材料的細胞毒性，細胞毒性與被測材料的量尤其是表面積有關(guān)［5］。每孔所選用的細胞數(shù)量原則上應以避免引起細胞融合為宜［6］。本實驗通過吸光度值檢測，反映材料對細胞的毒性作用，結(jié)果顯示，實驗組及陰性對照組細胞毒性無顯著性差異，實驗組與陽性對照有顯著差異，說明實驗組的細胞毒性小，生物相容性良好，表明實驗組符合生物體應用的基本要求，可以進行活體組織的后續(xù)實驗。

3.2 根管密合度研究 理想的根充材料應當具有優(yōu)良的封閉性性，能夠嚴密封閉根尖孔。如果封閉性能不良會引起根管充填不嚴密而造成微滲漏現(xiàn)象，導致根管內(nèi)的細菌再感染，最終可導致根管治療失敗。20nm羥基磷灰石顆粒，與牙齒硬組織相似，比一般的生物體內(nèi)的細胞都小，提高了韌性和力學性能，增強了流動性，采用的納米羥基磷灰石顆粒可以滲透至牙本質(zhì)深部，而形成較好的封閉性能。對照組可溶解性發(fā)生在根管內(nèi)，根尖充填中對照組的消失使根尖受腐蝕而密合度降低。

3.3 抑菌性研究 根管治療是當前國內(nèi)外治療感染根管的主要方法，遺留在根管系統(tǒng)中的細菌和殘余牙髓組織等可能成為根管治療失敗的主要原因。根充糊劑是否具有良好的抑菌作用成為重要因素，患牙根管內(nèi)以厭氧菌為主的混合菌感染［7］，本實驗結(jié)果表明，實驗組具有較強的抑菌性，碘仿起到了防腐殺菌的主要作用。碘仿是一種良好的消毒劑和防腐劑，具有很強的殺菌和局部抗感染能力，與組織親和力強，且對組織刺激性小。碘仿遇到組織液或細菌產(chǎn)物時可緩慢分解釋放游離碘，與菌體蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)合使其變性，使細菌產(chǎn)生氧化，起到殺菌作用，尤其對厭氧菌的殺滅作用更強，從而有效地消除再感染，碘仿還對吸收根管內(nèi)滲出物，促進根尖病灶的吸收，減少滲出也有一定的改善作用。納米材料具有較大的表面積，對細菌具有高吸附力，大量吸附與細菌代謝相關(guān)的酶，從而干擾細菌的代謝［8］。羥基磷灰石本身為堿性，不利于細菌生長。對照組發(fā)生在根管內(nèi)的溶解，單獨使用充填根管會使根尖再受污染。

4 結(jié)論

（1）納米羥基磷灰石復合根管充填劑有很好的安全性和良好的生物相容性，不會干擾生物細胞的正常功能。（2）納米羥基磷灰石根充糊劑的根管密合度優(yōu)于傳統(tǒng)的充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑。（3）納米羥基磷灰石根充糊劑具有良好的抑菌性。可作為根管充填材料，有良好的應用前景。

參考文獻

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出納事跡材料范文第2篇

1、股東加速出資的法律適用

依照現(xiàn)有的法律規(guī)范體系，《公司法》[1]未對此問題進行規(guī)定，《公司法司法解釋三》[2]構(gòu)造的補充賠償責任，能否進行擴張性的解釋，即債務(wù)清償責任擴展到出資未到期的股東，目前爭議較大，在公司非破產(chǎn)、解散的情況下，犧牲股東出資期限利益，履行到期債權(quán)，落實到具體執(zhí)行工作中存在較大難度。

2019年出臺的《九民紀要》[3]，以股東依法享有期限利益為由，明確提出原則上不支持加速到期，同時規(guī)定了兩種例外情形。《九民紀要》看似對于股東加速出資給出了權(quán)威的解答，但卻無法作為審判執(zhí)行的依據(jù)。例外規(guī)定1的實質(zhì)要件與破產(chǎn)[4]規(guī)定并無二致，即要求加速股東出資，償還到期債權(quán)，但在執(zhí)行效果上是完全不同的。若根據(jù)例外規(guī)定1做出執(zhí)行裁定，要求股東加速出資到期的財產(chǎn)，其結(jié)果是個別債權(quán)人受償。若依照破產(chǎn)程序，將未到期的股東出資歸入破產(chǎn)財產(chǎn)，其結(jié)果是由公司所有債權(quán)人公平受償。在執(zhí)行效果上，《九民紀要》的這一規(guī)定會導致偏頗性清償。

當前關(guān)于股東加速出資的法律規(guī)定，審判、執(zhí)行工作的標準無法統(tǒng)一，通過查找相關(guān)司法判例可知，對于是否引入股東加速出資，賦予了審判員較大的自由裁量權(quán)。

2、司法實務(wù)中對于加速出資的爭論焦點

（1）認繳出資的約定義務(wù)與補充賠償責任的法定義務(wù)

部分觀點認為，認繳出資在法律規(guī)定的框架內(nèi)，基于公司章程，約定股東認繳、實繳金額及時間，本質(zhì)上是公司內(nèi)部的約定，其不具備對抗債權(quán)人債權(quán)實現(xiàn)的效力。而股東的補充賠償責任，是法人在市場交易活動中，作為獨立的法人實體，應承擔的交易風險，應對其進行擴張性解釋。股東認繳制度不能成為股東逃避補充賠償責任的原因，補充賠償責任應股東認繳這一行為發(fā)生時就產(chǎn)生效力。約定義務(wù)不能對抗法定義務(wù)，在企業(yè)無可供執(zhí)行財產(chǎn)時，可以加速股東出資。

反對觀點認為，公司作為法人實體，在設(shè)立時會對外進行信用信息公示，股東出資情況會完整的體現(xiàn)，股東出資情況因公示行為而獲得公信力，股東基于公示行為享有出資的期限利益。第三人在與公司交易時，可以實時查詢到企業(yè)出資情況，如第三人自愿與企業(yè)進行商業(yè)貿(mào)易，客觀上即認可股東認繳期限，不能以債權(quán)到期為由，加速股東出資。

（2）股東加速出資清償單獨債務(wù)人與破產(chǎn)清算均償?shù)拿?/p>

根據(jù)《九民紀要》第6條規(guī)定兩種例外情況，情況1規(guī)定，當窮盡所有執(zhí)行手段后，仍無財產(chǎn)可供執(zhí)行，已具備破產(chǎn)原因，但不申請破產(chǎn)的。根據(jù)《九民紀要》，債權(quán)人申請執(zhí)行公司到期債權(quán)時，如符合第6條規(guī)定，法院可執(zhí)行未到期的認繳出資，實現(xiàn)債權(quán)人的到期債權(quán)。然而這一規(guī)定實施受到了批判，反對觀點認為，首先，當公司資產(chǎn)不足以清償?shù)狡趥鶆?wù)時，應依照破產(chǎn)法規(guī)定，進入破產(chǎn)清算程序，未到期認繳出資應由公司全部債權(quán)人共同均分，因執(zhí)行某一案件而加速股東出資，是對其他債權(quán)人利益的侵害。其次，即使在公司破產(chǎn)前，加速股東出資，清償了某一債權(quán)人的債權(quán)，在進入破產(chǎn)程序后，其他債權(quán)人仍可以行使撤銷權(quán)，撤銷已執(zhí)行債權(quán)，無疑會造成司法資源的浪費。

法官點評：

從執(zhí)行工作角度出發(fā)，如何確保公司獨立法人地位、促進股東出資自由、維護公司債權(quán)人利益是相關(guān)法律設(shè)計的出發(fā)點和落腳點，在討論股東加速出資這一問題時，應當著眼于保持公司、股東、債權(quán)人這三方利益的相對平衡，對股東出資義務(wù)的規(guī)則進行修補。

1、明確法律適用的選擇

之前已討論過當前法律構(gòu)建，根據(jù)現(xiàn)行法律規(guī)范體系，首先，應明確是否對公司法第3條進行文義解釋，即“股東”是否包含出資期限尚未屆滿的股東。對公司法司法解釋第13條是否進行擴張解釋，認為在公司到期債務(wù)無法清償?shù)那樾蜗拢拔绰男谢蛭慈媛男谐鲑Y義務(wù)的股東”應當包括出資期限尚未屆滿而未實際履行出資義務(wù)的股東。

2、完善《公司法》司法解釋

有觀點提出，應跳出現(xiàn)有法律體系對于股東加速出資規(guī)定模糊不清的情況，完善相關(guān)立法，才能根本解決當前法律漏洞。但修法的時間成本過高，牽涉的范圍太廣，修法并不是最佳選擇。建議在充分考量當前審判執(zhí)行工作的痛點，以相關(guān)判例為研究基礎(chǔ)，推動《公司法》司法解釋的完善，統(tǒng)一司法審判標準。

3、短期過渡方案：實施執(zhí)行轉(zhuǎn)破產(chǎn)程序

從執(zhí)行工作出發(fā)，通過參考部分執(zhí)行工作處理方法，執(zhí)行轉(zhuǎn)破產(chǎn)程序可作為短期過渡方案，當收到執(zhí)行申請人的執(zhí)行申請后，窮盡全部執(zhí)行手段，確認公司無財產(chǎn)可供執(zhí)行后，可終結(jié)執(zhí)行程序轉(zhuǎn)交破產(chǎn)清算。這一制度設(shè)計仍有相關(guān)細節(jié)需要把控，如：執(zhí)行與破產(chǎn)清算工作如何銜接；窮盡全部執(zhí)行手段、無財產(chǎn)可供執(zhí)行是否由相應標準，防止轉(zhuǎn)破產(chǎn)程序的隨意性等。

[1]《公司法》第3條，有限責任公司的股東以其認繳的出資額為限對公司承擔責任；股份有限公司的股東以其認購的股份為限對公司承擔責任

[2]《公司法司法解釋三》第13條第2款：債權(quán)人請求未履行或者未全面履行出資義務(wù)的股東在未出資本息范圍內(nèi)對公司債務(wù)不能清償?shù)牟糠殖袚a充賠償責任的，人民法院應予支持；未履行或者未全面履行出資義務(wù)的股東已經(jīng)承擔上述責任，其他債權(quán)人提出相同請求的，人民法院不予支持。