前言：想要寫出一篇令人眼前一亮的文章嗎？我們特意為您整理了5篇表觀遺傳學研究方法范文，相信會為您的寫作帶來幫助，發現更多的寫作思路和靈感。

表觀遺傳學研究方法范文第1篇

表觀遺傳學研究發現，基因及其表達的遺傳性改變不僅僅是指基因突變或基因多樣性等DNA序列的變化。已知的三種可調節基因表達的表觀遺傳學改變主要是：基因組DNA的甲基化，組蛋白修飾，非編碼RNA的調節（如microRNA）。上述機制均涉及外在因素在蛋白質編碼序列不變的情況下仍可調節基因轉錄[4]。表觀遺傳學調節機制存在個體及組織差異性，并且可以隨年齡增長、環境及疾病狀態的改變而變化。表觀基因組在基因組表達過程中起關鍵作用，個體間基因表達的不同造成藥物不同的反應性，這可能是通過表觀遺傳學改變進行調節的。因此，目前認為表觀遺傳學改變可以幫助解釋基因突變在藥物反應中的作用，繼而在臨床醫學中發揮作用，這一迅速崛起的新學科稱為表觀遺傳藥理學。個體間藥物的反應性不同，該學科不僅研究表觀遺傳因子在這一過程中的作用，而且旨在開發新的藥物靶點[5]。筆者認為表觀遺傳藥理學與遺傳藥理學將共同在藥理學、臨床醫學中發揮重要作用。目前為止，表觀遺傳藥理學的大多數研究集中于腫瘤學領域，例如，研究細胞色素p450在個體間表達的差異。幸運的是，表觀遺傳學修飾的作用已被應用于解釋其他復雜并且多源的現象，應用的范圍越來越廣。在這里，筆者總結了表觀遺傳修飾在心衰及心血管疾病治療方面最新的研究。

1表觀遺傳修飾與心力衰竭

1.1組蛋白的修飾

龐大的真核生物基因組在高度保守的組蛋白的作用下得到了緊密的壓縮。在核小體中，基因組DNA圍繞核心組蛋白（核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4各兩組）折疊、壓縮，形成了染色體的基本單位。基因組DNA與染色體蛋白的相互作用有助于轉錄因子向靶基因片段聚集，從而調節轉錄活性[6]。通過這種機制，核小體利用其核心組蛋白的共價修飾傳遞表觀遺傳學信息。這些修飾包括組蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化及SUMO化修飾。核心組蛋白的氨基末端從染色質絲上伸出來，與DNA或其他組蛋白、蛋白質等相互作用。該末端上的賴氨酸、精氨酸殘基是組蛋白修飾的主要靶點。多數研究旨在了解賴氨酸乙酰化、甲基化的作用。事實證明，賴氨酸的乙酰化作用主要與染色質親和力及轉錄相關，而賴氨酸的甲基化作用取決于何種殘基被修飾。有趣的是，正如Mano所總結的那樣，組蛋白乙酰化的調控與心肌肥厚相關。去氧腎上腺素可誘導心肌細胞肥大，這一過程需要乙酰基轉移酶介導的組蛋白乙酰化。與此結果相一致的研究是針對Ⅱ類組蛋白去乙酰基酶（HDACs）5、9的研究，其通過抑制心肌細胞增強因子2（MEF2）的活性進一步阻礙致肥厚基因（pro-hypertrophicgenes）的表達來發揮抗肥厚的作用。與此相反，Ⅰ類HDACs具有相當強的致肥厚作用，其通過調節磷脂酰肌醇三磷酸酰胺磷酸酯酶的表達發揮作用。這意味著，HDACs在多水平上控制肌肉細胞的體積。

1.2DNA甲基化

在真核生物中，DNA甲基化是通過將甲基團轉移到核苷酸胞嘧啶環的5''''位碳原子上完成的。在哺乳動物體內，DNA甲基化主要發生在基因的5''''-CG-3''''序列，也指的是CpG雙核苷酸；人體內，大約70%的CpGs發生甲基化。另一方面，未甲基化的CpGs存在于許多基因的5''''端調控區域，以CpG島的形式出現。與其他DNA區域相比，CpG雙核苷酸在CpG島出現的概率較高。人體內CpG島甲基化的不同是表觀遺傳學改變的組成部分。DNA胞嘧啶甲基化有助于局部轉錄因子復合物的結合，其與組蛋白修飾共同在局部及整個基因組中影響染色體的結構。因此，DNA甲基化的一個重要作用是調控基因的表達。在這方面，CpG島超甲基化可以使基因沉默，而低甲基化使基因發生轉錄。有人認為，甲基化是一種穩定遺傳的修飾，但同時它也受到環境因素的影響。如小鼠野鼠色基因位點，可以受到其上游轉座子甲基化狀態的影響。從遺傳角度來講，完全相同的親代其野鼠色基因不同的甲基化狀態可使得后代出現不同的毛色[7]。最近，Kao等[8]的研究結果發現，DNA甲基化在心衰特定的基因轉錄調控中發揮作用。他們發現促炎癥基因TNF-α可下調肌漿網Ca2+-ATPase（SERCA2A）的表達，這是通過增強SERCA2A啟動子的甲基化狀態完成的。Movassagh等[9]發現，在心肌病及人類心肌組織形成時甲基化的狀態是不同的。而且，他們鑒別出三個基因位點（IECAM1、PECAM1、AMOTL2），在不同的心臟樣本中，位點甲基化狀態與基因表達的調控密切相關。

1.3MicroRNAs

MicroRNAs是短的雙鏈RNA分子，來源于細胞核及細胞質中較大的RNA前體，其可以在基因轉錄后對基因表達發揮調節作用。miRNAs可以對30%～50%的蛋白質編碼基因進行調控，這一過程主要是通過與mRNA3''''端未轉錄區域的堿基對進行互補結合，繼而干擾轉錄，靶mRNAs可降解或暫時沉默[10]。miRNAs調節蛋白的表達是非常復雜的，多種miR-NAs可以作用于同一基因，不同基因也可受到同一種miR-NAs的調節。miRNAs的表達具有組織、疾病特異性。近年來，多種病理狀態下的miRNA分子標記已被檢測出來，如各種類型的腫瘤以及多種心血管疾病[11]。越來越多的證據表明，miRNAs與基本的細胞功能密切相關。目前，miRNAs與心衰的關系已得到明確，在過去的幾年中，該領域的報道層出不窮。對心血管疾病的研究主要集中于兩種心臟組織特異表達的miRNA家族（miRNA-1/miR-NA-133、miRNA-208）。多項研究顯示，miRNA在健康、高血壓以及不同病因所導致的人、小鼠、大鼠衰竭的心臟中均有表達，Divakaran等[12]發現心臟特異性的miRNA-208不僅可調節心肌細胞肥大、纖維化同時可在應激、甲退時調節β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）的表達。這種miRNA由α-MHC基因的內含子編碼。該基因編碼α-MHC及一種主要的心肌收縮蛋白，使心臟變大，在應激以及激素信號作用下通過miR-NA-208及其作用位點發揮調節作用。再者，定向刪除心肌特異性的miRNA，miRNA-1-2，揭示了它們在心臟中的多種功能，包括調節心臟的形態發生、電信號傳導及細胞周期的調控。Thum等[13]發現，受損心肌中miRNA標記與胚胎心中miRNA表達的類型極為相似，這說明受損心肌中重啟了胚胎基因的表達程序。Thum等[13]另一個發現是miRNA-21可以調控ERK-MAP激酶途徑，這種調控在心臟成纖維細胞中尤為明顯，心肌細胞中卻沒有這種表現，這可以影響到心臟的結構及功能。在成纖維細胞中，miRNA-21水平的增高可通過抑制特定基因來激活ERK激酶，經由這種機制，miRNA-21調節了間質纖維化、心肌肥厚。上述研究揭示了在心臟成纖維細胞中，基因調節的另一種方式是在miRNA介導的旁分泌水平上進行的。miRNA在心臟肥厚反應中的意義得到了進一步的研究，miRNA成為基因調控的主要調節因子。到目前為止，miRNA已被證實不僅可以影響心肌，還可以影響心臟電信號轉導及調節血管再生[14]。

2表觀遺傳篩選方法

表觀基因組學示意圖不是固定的，它因細胞類型、時間的不同而不同，并且可在生理學、病理學、藥物作用情況下發生改變。因此，作為人類基因組計劃的后續工程，表觀基因組測序是一項艱巨的任務。雖然判斷基因組序列的表觀遺傳學狀態是比較容易完成的，描繪整個表觀基因組需要對數十個基因組進行測序，覆蓋一個有機體在生命不同階段的所有細胞類型。亞硫酸氫鹽測序法是標測DNA甲基化類型最為準確的方法。基因組DNA與亞硫酸氫鈉相作用，導致未甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。為觀察特定基因的甲基化狀態，用特異性引物對目的片段進行擴增，隨后對產物測序。在序列中，甲基化的胞嘧啶被標記為Cs，未甲基化的胞嘧啶為Ts。近來出現了多個對甲基化進行定位的全基因組研究方法，它們都是以甲基化和未甲基化的CpGs對限制性內切酶的敏感性不同為基本原理的。限制長度的基因組掃描利用兩種酶雙酶切DNA，一種是頻繁切割的甲基化非敏感性限制內切酶，另一種是罕見的甲基化敏感性的酶如Not1，這種酶只有在非甲基化狀態時才可以酶切所識別的位點。還有一種完全不同全基因組研究方法是利用DNA芯片技術，它可以一次性標測成千上萬的CpG島的甲基化狀態。這種方法可以用來識別CpG島，相對于正常的調控過程來說，CpG島在腫瘤組織中發生甲基化。亞硫酸鹽轉化的替代方法是ChIP-seq方法（一種與測序相結合的染色質免疫沉淀方法）。通過免疫共沉淀技術使得目的蛋白與DNA發生交聯，然后對DN段進行基因組測序。這一方法可以幫助識別任何DNA相關蛋白的DNA結合位點。該技術還可以提供組蛋白修飾的信息，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化修飾。對ChIP技術進行改進得到的DCS方法，是將ChIP與消減式PCR進行偶聯。該方法旨在避免基因組片段與芯片雜交后產生非特異性信號。以同樣的方式可以檢測人體病理狀態下miRNA的作用，大多數研究是利用高通量的方法分析臨床病例中總miRNA的表達情況。高通量技術是以miRNA基因芯片和real-timeRCP為代表的。盡管分子間的差別給這些技術帶來了巨大的挑戰，但miRNA芯片最大的優點是具有很高的特異性，而缺陷是其敏感性較低。

3藥物可以改變表觀遺傳狀態

表觀遺傳學改變正常及疾病狀態下的表型，這可能意味著充分理解和調控表觀基因組對于人類常見疾病的防治具有重要意義。表觀遺傳學為我們提供了一個重要的窗口，來認識環境與基因在疾病發生過程中的相互作用以如何調節這些作用達到改善人類健康的目的。miRNA派生的反義寡核苷酸是單鏈RNA分子，對其進行化學修飾可能是針對致病miRNA新的方法。但是這種方法困難重重，miRNA屬于密切相關的家族，且很難合成針對每一種miRNA的反義寡核苷酸。再者，一個單獨的miRNA可針對多種基因發揮作用，它們之中可能含有對心肌有益的分子。在這方面，寡核苷酸的化學修飾可能會特異性破壞miRNA與單個mRNA的作用，這可能是疾病治療良好的備選方案。每一種miRNA可以以不同的強度針對成百上千的基因發揮作用，所以在體內miRNA修飾的最終作用尚不明了。最終，將miRNA拮抗劑應用于臨床領域將面臨很多困難，這與我們在基因治療方面所遇到的極為相似，如導入方式、載體、特異性以及毒性等問題[15]。至少在理論上，針對特異性miRNA的方法將來可能是治療缺血性心臟病、心肌肥厚、心衰、血管再生、離子通道病的有效手段，可控制心衰的發展。另一種方法可能是將靶DNA甲基化。一些影響基因組DNA甲基化的化學合成劑已經應用于臨床，例如5-氮胞嘧啶、抑制甲基轉移酶的氮胞嘧啶可以使DN段脫氨基。其它藥物是通過阻礙甲基化酶的活性而發揮抑制甲基化作用。更多信息可參照Gomez等[16]的文章。除了要開發可以調節DNA甲基化的藥物外，還需要設計可以影響組蛋白修飾的藥物。在抗腫瘤藥物的發展過程中，組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑占據著重要地位，它可以通過逆轉與腫瘤相關的異常表觀遺傳改變，繼而發揮作用。已有證據表明，在心肌肥厚時，HDAC抑制劑可修復基因表達程序。Gallo等證明體外試驗中，曲古霉素A、丁酸鈉可延緩心臟肥厚。

4表觀遺傳學和環境

眾所周知，環境因素如毒素、飲食可以影響DNA甲基化和染色質修飾，并且可遺傳給下一代。雌激素、抗雄激素類物質可改變DNA甲基化狀態降低男性的生育能力，這也是可遺傳的。該假說認為，環境因素可以改變表觀遺傳學標記和基因表達形式，這可能在人類疾病研究中具有重要意義。常見疾病大多受到基因和環境因素的雙重影響，環境可誘導表觀遺傳結構發生改變，進而將基因和環境因素聯系起來[17]。年齡在基因與環境相互作用中發揮重要作用。常見病的發病率隨著年齡的增加不斷增高，這與在人的一生中表觀遺傳學改變不斷累積有關。有研究發現，相對于年輕者而言，年長的同卵雙胞胎體內總DNA甲基化及組蛋白H3K9乙酰化的水平較高，但該研究沒有檢測同一個體中表觀遺傳學改變隨時間變化的情況。

表觀遺傳學研究方法范文第2篇

【關鍵詞】 急性髓細胞白血病； 表觀遺傳學； 靶向治療

急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一組異質性疾病，以造血干細胞克隆紊亂為特征，是成年人急性白血病中最常見的類型。近20年來，人們對AML的發病機制和預后的研究有了長足的進展，患者的完全緩解率也有了明顯的提高，但仍有2/3成年AML患者未能達到治愈，復發、難治及老年AML仍是目前臨床治療的難題。為此，臨床工作者和科研人員不斷探索新途徑，積極尋求AML治療新方法。

近年來，表觀遺傳學的研究逐漸成為人們關注的熱點。隨著研究的深入，人們對AML的發病機制有了新的認識，隨之而來的靶向治療也給患者重新帶來希望。該研究主要包括三個方面的內容：DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼microRNA。研究表明，表觀遺傳學的調控機制參與調節許多重要的生理過程。在血液腫瘤的發生和轉化中，表觀遺傳學異常與遺傳學異常具有同樣重要的作用。表觀遺傳基因的修飾對于基因的差e表達有著至關重要的作用，它決定著細胞的類型及細胞從良性到惡性的轉變。尤為重要的一點，這種修飾是可遺傳的、動態的、可逆的，并且不影響下游的DNA序列。表觀遺傳的修飾基因，如DNMT3A，TET2，IDH1和IDH2，ASXL1和MLL1上的頻發突變，影響了造血細胞的自我更新和/或分化能力，促進髓系細胞的轉化，促進白血病的形成[1]。表觀基因組在AML的發生中有重要的靶標性作用，它具有內在可塑性，通過特異性的酶、轉錄因子、與表觀遺傳機制相關的其他蛋白重新編碼對表觀遺傳基因的修飾，為治療提供了新的可能。

本文將描述表觀遺傳基因的失調是如何在AML中發揮作用的，同時強調目前和未來的治療手段在發現新靶標上的多種嘗試。此外，還將涉及AML中個體化的靶向治療，包括術語的定義，適應證的相關描述以及臨床實施的具體措施。

1 表觀遺傳學的針對性治療

1.1 DNMT3A突變及DNMT抑制劑 DNA甲基化是表觀遺傳調控的重要組成部分，通常與轉錄沉默有關。在急性白血病中，已被確定多種腫瘤抑制基因的過甲基化與轉錄抑制通過增殖、分化和生存過程的失調導致白血病的發生[2]。來自MDS的DNA甲基化譜研究數據顯示，抑癌基因的異常甲基化可能是驅動MDS進展為AML的主要機制[3]。胞嘧啶甲基化是指C5位的胞嘧啶殘基被DNA甲基轉移酶（DNMTs）催化，并生成C5甲基胞嘧啶（5-MC）的過程。基因組DNA甲基化是由DNMT3通過半甲基化的模板（從頭甲基化）建立的，并由DNMT1全甲基化模式（維持甲基化）予以保持。這些過程使得不同的可遺傳的DNA甲基化模式可以用來區分AML亞型、預測預后，并有潛力作為生物標志物來預測患者對治療的反應[4]。AML要么普遍低甲基化，要么過甲基化，這提示表觀遺傳途徑的過度和不足可能對白血病的發生都很重要[5]。數據表明，在白血病干細胞中，DNMT1可維持其DNA甲基化模式，并參與其自我更新的過程[6]。研究表明，DNMT3A在造血干細胞自我更新和分化過程中起著關鍵的作用。重要的是，DNMT3A的功能缺失性突變發生在30%的細胞遺傳學正常的AML中，可能與臨床預后較差有關，但AML的這些突變對于DNA胞嘧啶甲基化和轉錄的影響尚不清楚，且DNMT3A的單獨缺失并不足以導致白血病形成[7]。大多數的突變涉及882位的精氨酸，在體外導致甲基轉移酶活性的降低[8]。到目前為止，尚無特異性針對DNMT3A的靶向治療。本節討論的“表觀遺傳修飾的靶向治療”指的是針對DNMT抑制劑的去甲基化治療。

美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的2種DNMT抑制劑為：阿扎胞苷及其脫氧衍生物地西他濱。這兩種藥物均用于MDS的治療，現在依據一些臨床試驗的結果，也普遍應用于AML的治療。

在一項多中心Ⅱ期研究中，有227位初治AML患者接受了地西他濱治療。每個療程中靜脈滴注地西他濱持續72 h，用量為135 mg/m2，間隔6周重復用藥，共4個療程[9]。該研究表明，總體有效率為26%，中位生存期為5.5個月，1年存活率為28%。在另一項多中心Ⅱ期臨床試驗中，給予55位60歲以上的AML患者靜滴地西他濱治療，每日用量為20 mg/m2，連續5 d給藥，每4周為一療程。結果，該試驗中AML的完全緩解率為24%，中位生存時期為7.7個月。

在一項針對高危MDS（包括骨髓中原始細胞比例為20%～30%、根據WHO標準應列為AML）的臨床試驗中，給予患者阿扎胞苷治療：每日用量為75 mg/m2，連續7 d皮下注射用藥，28 d為一個療程。與對照組（接受傳統治療方案）相比，阿扎胞苷組有明顯的生存獲益。而對于一些次要的評價指標而言，比如輸血需求、靜脈抗生素的使用和住院天數等，阿扎胞苷組有明顯優勢。與之類似的是，在法國的一項臨床研究中，149名初治老年AML患者接受了相同劑量和療程的氮雜胞苷治療，總體有效率為33%，完全緩解率為23%，總體生存期為9.4個月[10]。對于接受了大劑量誘導化療和異基因造血干細胞移植的AML患者，使用阿扎胞苷維持治療可能會減少或延遲白血病的復發。

1.2 IDH1/2突變及IDH1/2抑制劑 DNA甲基化與同型二聚體酶IDH1/2催化的檸檬酸代謝有關，二聚體酶可催化異檸檬酸氧化脫羧成α-酮戊二酸（α-KG）。研究發現，有10%～30%正常核型的AML患者發生了IDH1/2功能突變，引起酶功能異常，導致2-羥基戊二酸（2-HG）的產生和積累。由于TET2和包含jumonji-c結構域家族的組蛋白賴氨酸去甲基化酶均依賴于α-KG，當機體發生IDH1/2突變，并積累2-HG，可導致DNA和組蛋白甲基化的增加[11]。IDH1/2突變對預后的影響研究得到了自相矛盾的結果，可能是因為突變位置的差異和（或）伴隨其他基因的突變。例如，一項關于AML的隨機臨床試驗表明，IDH2的第140位的精氨酸殘基發生突變與良好的預后相關。不但如此，同時伴有NPM1和IDH1或IDH2突變的細胞遺傳學正常的AML患者也有良好的受益，3年總生存率（OS）可高達89%。然而，IDH1/2和TET2突變是相互排斥的，但具有這兩種不同的突變的AML患者具有相似的甲基化過程。

目前，一項早期臨床試驗正在進行，旨在研究IDH1/2抑制劑對發生了IDH1/2突變的AML患者的影響。這是一種針對IDH1/2突變酶的小分子靶向抑制劑，可減少2-HG的生成，誘導H3K9me3的脫甲基作用，并能增強相關分化基因的表達[12]。

1.3 MLL基因突變及DOT1L蛋白甲基轉移酶抑制劑 MLL基因位于染色體11q23，編碼H3K4甲基轉移酶（HMT），該酶參與組蛋白的重構，影響HOX基因和Wnt信號通路[13]。有5%～7%的初發AML病例發生MLL重排，與不良預后相關[14]。MLL區域是染色體易位和重排的高發區，能產生多種融合蛋白，其中一些有致癌性。研究顯示，MLL融合蛋白和DOT1L之g的作用導致了白血病的發生[15]。

已有研究表明，DOT1L HMT的酶活性誘導了存在MLL基因重排的AML的形成。DOT1L抑制劑可減少H3K79的甲基化和MLL融合基因的表達。目前，具有高度選擇性的DOT1L抑制劑的研究已進入臨床試驗階段，而選擇性抑制HMT EZH2的強效抑制劑也正在研究中。

1.4 組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑 單獨使用HDAC抑制劑治療AML，其臨床作用并不令人滿意。因而，能否與DNMT抑制劑聯合使用增強療效，則備受期待。目前，諸多相關的臨床試驗正在開展當中，而且對多種HDAC抑制劑，包括丙戊酸、mocetinostat、帕比司他、伏立諾他等，與阿扎胞苷或地西他濱聯合使用的療效進行了評價，但結果并不如人意。在一項二期臨床試驗中，恩替諾特聯合阿扎胞苷治療AML并未提高療效[16]。需要注意的是，與早期的體外試驗采用序貫用藥不同，此項試驗中這兩種藥物是同時應用的。恩替諾特是一種強效的細胞周期抑制劑，可能會抑制阿扎胞苷的整合，導致脫甲基作用減弱。

1.5 賴氨酸乙酰化抑制劑 具有布羅莫結構域的蛋白質可識別組蛋白末端的賴氨酸殘基，這種相互作用可被小分子抑制劑所抑制。當前，已開始對數種BET抑制劑進行臨床試驗。研究表明，BET抑制劑可抑制白血病干細胞和祖細胞增殖，并且可阻斷MLL介導的白血病轉化[17]。

1.6 賴氨酸去甲基化酶抑制劑 研究結果顯示，KDM1A/LSD1在體外可有效抑制AML細胞系和原代白血病細胞。在聯合使用HDAC抑制劑和全反式維甲酸時，這種抑制作用更顯著。研究表明，MLL白血病受其影響最大，AML的其他亞型和其他髓系腫瘤也對之敏感[18]。

2 表觀遺傳學發展在AML靶向治療方面的挑戰

2.1 靶向治療的治療靶點 AML在發生、發展過程中有一系列的異常表現，就疾病本身而言，有許多方面的異常可以進行針對性的治療，包括表觀遺傳途徑的調節、基因突變、細胞表型、信號轉導通路、白血病干細胞和骨髓微環境等。最近有關AML克隆構型的研究表明，AML克隆異質性始終伴隨著疾病的進展及復發[19]。因而，AML的治療靶點是不斷變化著的，在疾病的不同時期需用不同的藥物進行治療。有關初發AML克隆構型的研究顯示，在基因層面界定的白血病亞克隆和白血病干細胞之間具有明顯的功能異質性[20]。目前的挑戰是明確和清除所有的克隆，而非以往那樣狹隘地認為，靶向治療的關鍵就是應用某種方法，通過單向靶點來消除優勢克隆。

2.2 靶向治療的對象 如何選擇靶向治療的對象是一個比較重要的問題。根據不同的分類方法，AML患者可劃分為不同的亞群，但這樣的分類方法均有各自的優點和不足之處。

AML患者也可以根據預后進行分類。在過去，對新藥的早期試驗通常在復發和難治病例中進行，顯而易見，這是一種很令人困惑的試驗模式。由于復發或難治AML病例與初發病例在生物學上和臨床上是不同的，因而對初發病例作新藥研究十分重要。可以根據細胞遺傳學、分子遺傳學和表觀遺傳學數據，對初診患者進行風險評估并預先判斷其治療效果的優劣。例如，一項研究表明，在不同的甲基化區域，有高水平甲基化的7個基因其低表達具有更好的臨床結果[21]。目前認為，在臨床研究中，靶向治療的對象應該是那些預后可能不良的初發AML病例。

2.3 靶向治療的時機 臨床上通常將AML治療分為誘導、鞏固和緩解后治療。臨床研究表明，把針對表觀遺傳學調控的靶向藥物與其他藥物聯合使用，結果比單一用藥效果更好。因此，已考慮將試驗新藥添加到主流的誘導方案當中來。多年來有關AML治療的臨床實踐表明，尚無哪一種化療方案更優于阿糖胞苷聯合蒽環類藥物的“7+3”經典方案的，所以應把該方案作為主要的誘導方案，新藥可以添加于此或者作為單藥評估其療效。這樣，納入臨床試驗的初治患者將會接受其一進行治療。

各種證據表明，誘導后殘留的白血病細胞與治療前的腫瘤細胞在生物學上是有區別的。因此，臨床上重復應用同一治療方案并不合理。研究表明，表觀遺傳學靶向治療在AML完全緩解后或移植后，或可控制白血病克隆的演變。目前，多數靶向治療藥物是非細胞毒性的，對低負荷白血病而言，治療成功的可能性更大。當然，還需要更多的AML患者參與到臨床試驗中來，進行新型藥物的有效性驗證。

2.4 靶向治療的有效性評價 表觀遺傳學靶向治療一般需要長達幾周甚至幾月的時間方顯成效。此外，基于形態學和免疫表型的分析方法并不能有效評價靶向治療的療效。因而，可以憑借DNA甲基化特征、基因表達譜、高光譜測定法以及其他技術手段來做生物學標志的鑒定，通過生物學標志能充分預測療效，并提高疾病監控能力。然而，在當前臨床實踐中，尚未能常規使用此類表觀遺傳學的生物學標志。

3 展望

隨著對AML表觀遺傳修飾基因突變的認識的深入，人們發現表觀遺傳學在AML生物學發生中起著復雜而重要的作用。AML的表觀遺傳學靶向治療策略已經改變了臨床應用，AML患者的個體化靶向治療將成為現實。然而，現實中還面臨著諸多挑戰，其中最大的挑戰就是AML生物學和患者本身的高度異質性。只有通過創新性的臨床試驗、可靠的科學研究和醫患的共同參與等努力，才可能真正實現AML患者的個體化治療。

⒖嘉南

[1] Challen G A，Sun D，Jeong M，et al.Dnmt3a in essential for hematopoietic stem cell differentiation[J].Nat Genet，2011，44（1）：23-31.

[2] Baylin S B，Jones P A.A decade of exploring the cancer epigeomebiological and translational implications[J].Nat Rer Cancer，2011，11（10）：726-734.

[3] Jiang Y，Dunbar A，Gondek L P，et al.Aberrant DNA methylation is a dominant mechanism in MDS progression to AML[J].Blood，2009，113（6）：1315-1325.

[4] Figueroa M E，Lugthart S，Li yushan，et al.DNA methylation signatures identify biologically distinct subtypes in acute myeloid leukemia[J].Cancer Cell，2010，17（1）：13-27.

[5] Akalin A，Garrett-Bakelman F E，Kormaksson M，et al.Base-pair resolution DNA methylation sequencing reveals profoundly divergent epigenetic landscapes in acute myeloid leukemia[J].PLoS Genet，2012，8（6）：e1 002 781.

[6] Trowbridge J J，Sinha A U，Zhu N，et al.Haploinsuffiiency of Dnmt1 impairs leuemia stem cell function through derepression of bivalent chromatin domains[J].Genes Dev，2012，26（4）：344-349.

[7] Abdelwahab O，Levine R L.Mutations in epigenetic modifiers in the pathogenesis and therapy of acute myeloid leukemia[J].Blood，2013，121（18）：3563-3572.

[8] Yan X J，Xu J，Gu Z H，et al.Exome sequencing identifies somatic mutations of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute myeloid leukemia[J].Nat Genet，2011，43（4）：309-315.

[9] Lubbert M，Ruter B H，Claus R，et al.A multicenter phase Ⅱ trial of decitabine as first-line treatment for older patients with acute myeloid leukemia judged unfit for induction chemotherapy[J].Haematologica，2012，97（3）：393-401.

[10] Maukillo L，Venditti A，Spagnoli A，et al.Azacitidine for the treatment of patients with acute myeloid leukemia：report of 82 patients enrolled in an Italian Compassionate Program[J].Cancer，2012，118（4）：1014-1022.

[11] Xu W，Yang H，Liu Y，et al.Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitive inhibitor of a-ketoglutarate-dependent dioxygenases[J].Cancer Cell，2011，19（1）：17-30.

[12] Wang F，Travins J，Dela Barre B，et al.Targeted inhibition of mutant IDH2 in leukemia cells induces cellular differentiation[J].Science，2013，340（6132）：622-626.

[13] Milne T A，Briggs S D，Brock H W，et al.MLL target SET domain methyltransferase activity to Hox gene promoters[J].Mol Cell，2002，10（5）：1107-1117.

[14] Groschel S，Schlenk R F，Engelmann J，et al.Deregulated expression of EVI1 defines a poor prognostic subset of MLL-rearranged acute myeloid leukemia：a story of the German-Austrian AML Study Group and the Dutch-Belgian-Swiss HOVON/SAKK Cooperative Group[J].J Clin Oncol，2013，31（1）：95-103.

[15] Bernt K M，Zhu N，Sinha A U，et al.MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT11[J].Cancer Cell，2011，20（1）：66-78.

[16] Prebet T，Sun Z，Figueroa M E，et al.Prolonged administration of azacitidine with or without entinostat for myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes：results of the US leukemia Imtergroup trial E1905[J].J Clin Oncol，2014，32（12）：1242-1248.

[17] Zuber J，Shi J，Wang E，et al.RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukemia[J].Nature，2011，478（7370）：524-528.

[18] Harris W J，Huang X，Lynch J T，et al.The histone demethylase KDM1A sustains the oncogenic potential of MLL-AF9 leukemia stem cells[J].Cancer Cell，2012，21（4）：473-487.

[19] Ding L，Ley T J，Larson D E，et al.Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukemia revealed by whole-genome sequencing[J].Nature，2012，481（7382）：506-510.

[20] Klco J M，Spencer D H，Miller C A，et al.Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia[J].Cancer Cell，2014，25（3）：379-392.

表觀遺傳學研究方法范文第3篇

不受歡迎的禮物之一：心臟病

由馬薩諸塞州大學醫學院教授奧利弗?蘭杜主導完成的這項研究，是表觀遺傳學的又一新成果。表觀遺傳學又稱為實驗遺傳學、化學遺傳學或基因外調節系統，是遺傳學中的一個嶄新分支。表觀遺傳學是在不改變基因序列的前提下，基因功能可逆的、可遺傳的變化是如何表達的。這些變化包括DNA的甲基化修飾、組蛋白的各種修飾等。

該研究以兩組雄鼠為對象，其中一組剛斷奶就開始喂低蛋白食物，直至這些老鼠性發育成熟；另一組正常喂養的小鼠作為對照組。之后對這些雄鼠的下一代進行研究發現：在肝臟內與脂質和膽固醇的生物合成有關的基因表達增強，與膽固醇脂（抑制膽固醇在肝臟內的生物合成）有關的基因表達減弱。盡管小鼠的基因組序列并未發生實質性改變，但其新陳代謝功能已受到嚴重影響，罹患心臟病的幾率大增。

這里發揮關鍵作用的是DNA甲基化。DNA甲基化指的是在DNA堿基上加入甲基基團的化學修飾現象，這種變化雖然不如基因突變那樣“深入骨髓”，卻能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達。

研究人員在下一代小鼠DNA胞嘧啶（DNA的4種堿基之一）上觀察到了甲基化程度的適度改變（約20%）。這些相對顯著的DNA甲基化程度的改變是不良飲食長期作用的直接結果。因此，父母遺傳給我們的不僅是基因，父母“告訴”我們事情的方式還有許多。

不受歡迎的禮物之二：糖尿病

澳大利亞新南威爾士大學醫學院教授瑪格麗特?莫里斯等人的研究表明，雄性小鼠長期食用高脂肪食物，會使其雌性后代出現血糖代謝障礙，增加患糖尿病的風險，但這種效應對雄性后代并不明顯。

研究人員讓一組雄鼠攝入高脂肪的食物，而對照組的雄鼠則用正常的食物喂養。結果用高脂食物喂養的老鼠出現超重現象并表現出2型糖尿病的兩個主要癥狀：血糖代謝障礙以及胰島素抵抗的問題。令人吃驚的是，研究人員繼續對肥胖老鼠的雌性后代進行檢查時，發現它們也出現了胰島素和血糖調節障礙的問題。此外，健康的雄鼠其雌性后代也是健康的。

人體的血糖濃度由胰臟的胰島β細胞團分泌的胰島素控制。這些細胞成團形成一個個的“島”。研究人員注意到，和對照組的雌鼠相比，父親肥胖的雌鼠發生了胰島萎縮。肥胖雄鼠的雌性后代身上有600個以上的胰島出現了基因表達的改變，但由于基因序列本身并無變化，研究人員認為，DNA甲基化再次充當了重要角色。

研究人員發現最大的基因表達改變發生在一個名為Il13ra2的基因上，這種基因可以調節不同的胰腺癌細胞系的生長和入侵，其基因的表達可以通過DNA甲基化改變。實驗結果表明，實驗組后代Il13ra2基因的甲基化水平是8.9±2.2%，約為控制組的25%（33.6±4.0%）。這種基因甲基化可能是實驗組小鼠后代出現血糖代謝障礙的罪魁禍首。

基因并非一切

如果在人身上也有同樣的現象，就為心血管疾病多發與日漸增加的肥胖人口找到了一個新的解釋。這些研究也讓妻子更理直氣壯地告訴丈夫：“為了你自己，也為了孩子，請控制飲食。”

這兩項成果給人類對基因的認識帶來了同樣深刻的改變。以往的報道中，基因似乎無所不能：基因是萬病之源，人的生理特征如長相是由基因決定的，一個人的個性、將來也與基因扯上了關系。但這些報道有相當的夸大成分。中科院院士楊玉良一個題為“從肥皂泡到生命過程――關于基因后生物學的點滴思考”的演講中曾指出，在基因之外還有很多因素，包括物理的、化學的因素等，影響著生物學功能的表達。

表觀遺傳學研究方法范文第4篇

【摘要】

目的RAS相關結構域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動子區超甲基化介導的基因轉錄失活在卵巢癌中頻見，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學指標，RAS相關結構域蛋白2A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）與RASSF1A同源，其基因異常甲基化在多種腫瘤發生發展中發揮重要作用。本研究探討上皮性卵巢癌組織RASSF2A甲基化水平，并分析其臨床意義及高甲基化與mRNA表達情況的相關性。方法選擇2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫院手術治療的50例上皮性卵巢癌、27例交界性上皮性卵巢腫瘤和20例良性上皮性卵巢腫瘤患者，應用甲基化特異性PCR（MSP）檢測卵巢腫瘤組織中RASSF2A基因啟動子甲基化狀態，采用RT－PCR檢測其mRNA表達水平。采用5－氮雜2′－脫氧胞苷（5－aza－dC）對人卵巢癌細胞株SKOV3、3AO進行去甲基化干預實驗，并檢測藥物作用前后RASSF2A基因啟動子甲基化及其mRNA的表達情況。結果RASSF2A基因mRNA在良性上皮性卵巢腫瘤中的表達陽性率為95．00％（19／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為59．26％（16／27），上皮性卵巢癌組織為34．00％（17／50），表達強度依次下降，差異有統計學意義，χ2＝21．855，P＜0．001。RASSF2A基因啟動子在良性上皮性卵巢腫瘤組織中的甲基化率為0（0／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為22．22％（6／27），上皮性卵巢癌組織為46．00％（23／50），差異有統計學意義，χ2＝15．474，P＜0．001。RASSF2A甲基化水平與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、組織分化程度及淋巴結轉移無明顯相關性。RASSF2A基因甲基化與其mRNA的表達呈負相關，甲基化陽性組織的mRNA表達水平明顯低于甲基化陰性組織。5－aza－dC藥物作用后，卵巢癌細胞株中RASSF2A基因甲基化被逆轉，而其基因表達明顯升高。結論RASSF2A啟動子區高甲基化導致的基因表達沉默與上皮性卵巢癌的發生發展有關。

【關鍵詞】

上皮性卵巢癌；甲基化；RAS相關結構域蛋白2A基因；基因檢測

上皮性卵巢癌是女性生殖系統中惡性程度最高和預后最差的腫瘤，其病死率居婦科惡性腫瘤首位［1］。大量研究已證實，RAS相關結構域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動子區超甲基化介導的基因轉錄失活是卵巢癌中的頻發事件，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學指標［2－4］。與RASSF1A具有高度同源性的RAS相關結構域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）異常甲基化在多種腫瘤的發生和發展中發揮重要作用。本研究通過RT－PCR和MSP方法檢測良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織及卵巢癌細胞株中RASSF2AmRNA的表達及其啟動子甲基化狀態，分析RASSF2A啟動子甲基化與其mRNA的表達以及卵巢癌臨床病理特征的關系，探討RASSF2A啟動子區甲基化在卵巢癌發生發展中的作用。

1材料與方法

1．1標本來源收集2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫院婦產科收治的上皮性卵巢癌患者50例，交界性上皮性卵巢腫瘤27例，良性上皮性卵巢腫瘤20例。所有組織標本均經病理學確診，所有患者術前均未接受任何放化療或激素治療。標本采集在離體后10min內進行，并迅速放入液氮罐保存，后轉移至－80℃冰箱保存。上皮性卵巢癌病例中，依據2006年FIGO分期標準，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期31例；依據2003年WHO組織學分類標準，漿液性腺癌24例，黏液性腺癌16例，子宮內膜樣癌10例；高分化10例，中分化15例，低分化25例；有淋巴轉移27例，無淋巴轉移23例；年齡＜50歲者19例，≥50歲者31例。

1．2細胞株卵巢癌細胞株SKOV3和3AO由聊城市人民醫院中心實驗室提供。

1．3主要試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，DNA甲基化試劑盒購自德國Qiagen公司，引物均由上海生工設計合成。

1．4實驗方法

1．4．1細胞培養及藥物處理在37℃、5％CO2及飽和濕度的孵育箱中靜置培養卵巢癌細胞株，用含10％胎牛血清的RPMI1640細胞培養基及時換液。用終濃度為10μmol／L的5－aza－dC處理卵巢癌細胞株，常規換液，保持上述藥物濃度。于藥物連續作用72h后收集細胞。

1．4．2RT－PCR檢測參照Trizol試劑說明書提取組織及細胞總RNA。測得其濃度及純度符合實驗要求后，取2μL總RNA進行逆轉錄。所得cDNA經半定量PCR擴增。RASSF2A基因上游序列為5′－GCG－CCTAGAACGTGTTTTTC－3′，下游序列為5′－ACT－AGGCGTCCTCACATTGC－3′，擴增產物長度為563bp。以GAPDH作為內參基因，上游為5′－CAA－CGGATTTGGTCGTATT－3′，下游為5′－CACAGTC－TTCTGGGTGGC－3′，擴增片段長度為166bp。PCR反應條件為95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，30個循環，最后72℃延伸10min。擴增產物在2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察實驗結果。

1．4．3DNA的提取及亞硫酸鹽修飾采用酚氯仿法提取組織及細胞總DNA，并對基因組DNA進行亞硫酸鹽修飾，按照甲基化特異性PCR試劑盒說明書進行。所得產物直接用于PCR擴增或保持在－20℃冰箱保存備用。

1．4．4甲基化特異性PCR使用2對引物檢測RASSF2A基因啟動子甲基化狀態。甲基化引物正義鏈為5′－GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG－3′，反義鏈為5′－AAAAACCAACGACCCCCGCG－3′，非甲基化引物正義鏈為5′－AGTTTGTTGTTGTTTTTTA－GGTGG－3′，反義鏈為5′－AAAAAACCAACAACCC－CCACA－3′，擴增產物長度均為108bp。反應條件為95℃預變性10min，95℃變性30s，58℃復性30s（甲基化）；54℃復性30s（非甲基化），72℃延伸30s，35個循環，最后72℃延伸10min。所得產物電泳后攝像，分析結果。

1．4．5甲基化結果判定標準若僅甲基化引物擴增出陽性條帶，為完全甲基化；若僅非甲基化引物擴增出陽性條帶，為非甲基化；若兩者均擴增出陽性條帶，為部分甲基化。

1．5統計學方法采用SPSS13．0分析數據。RASSF2A甲基化、mRNA表達在卵巢腫瘤組織間的差異以及基因甲基化與臨床病理特征等計數資料采用χ2檢驗或Fishier確切概率法。RASSF2A甲基化及其表達之間的關系采用Spearman相關性分析法。卵巢癌細胞系中RASSF2AmRNA表達量比較采用t檢驗。檢驗水準α＝0．05。

2結果

2．1卵巢腫瘤組織RASSF2AmRNA的表達表1和圖1所示，卵巢良性腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中RASSF2AmRNA表達率依次降低，分別為95．00％（19／20）、59．26％（16／27）和34．00％（17／50），差異有統計學意義，χ2＝21．855，P＜0．001。兩兩比較結果顯示，卵巢癌組與交界性腫瘤組比較，χ2＝4．568，P＝0．033；卵巢癌組與良性腫瘤組比較，χ2＝21．280，P＜0．001；交界性腫瘤組與良性腫瘤組比較，χ2＝7．719，P＝0．005；差異均有統計學意義。

2．2卵巢腫瘤組織RASSF2A基因甲基化水平表1和圖2所示，97例卵巢組織標本均成功進行了MSP實驗。50例卵巢癌組織標本中有13例發生了部分甲基化，10例完全甲基化，甲基化頻率為46．00％（23／50）；27例交界性卵巢腫瘤中甲基化陽性率為22．22％（6／27），其中2例為完全甲基化。而20例良性卵巢腫瘤組織均未擴增出甲基化陽性條帶，甲基化頻率為0，差異有統計學意義，χ2＝15．474，P＜0．001。

2．3RASSF2A基因甲基化與其表達的相關性表2所示，RASSF2A基因甲基化狀態與其mR－NA表達水平呈負相關。在RASSF2A基因發生甲基化的組織中，RASSF2A基因表達明顯降低，提示RASSF2A基因高甲基化可能是該基因表達沉默的原因之一。

2．4甲基化狀態與卵巢癌臨床病理特征相關性表3所示，RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結轉移之間無明顯的相關性。

2．55－aza－dC作用結果圖3所示，卵巢癌細胞株SKOV3和3AO中均檢測到RASSF2A基因甲基化，經去甲基化藥物5－aza－dC作用后，SKOV3細胞由完全甲基化轉變為非甲基化，而3AO細胞甲基化狀態被部分逆轉。SKOV3和3AO中RASSF2AmRNA表達水平較低，經藥物干預后，SKOV3（t＝－5．258，P＝0．006）和3AO細胞株（t＝－3．060，P＝0．038）RASSF2AmRNA表達水平明顯升高，差異有統計學意義。

3討論

近年來，隨著腫瘤分子生物學及表觀遺傳學的發展，腫瘤抑制基因失活在癌癥發生發展中的作用越來越受到人們的重視。總的來說，其機制可概括為遺傳學機制及表觀遺傳學機制，換言之，腫瘤抑制基因功能的失活既可以是不可逆的，即遺傳學機制，如基因的突變或染色體的缺失，也可以是可逆的，即表觀遺傳學機制，如基因甲基化或組蛋白修飾。與遺傳學不同，表觀遺傳學主要研究內容不涉及DNA序列的改變，且在細胞分裂過程中具有可遺傳的、可逆性的基因組修飾作用［5］。DNA甲基化是哺乳動物基因組中最普遍的表觀遺傳學事件。相對于Knudson’s的二次打擊學說，基因甲基化僅靠一次打擊就可導致基因失活，腫瘤易感性增加［6］。RASSF2是新近發現的RASSF家族成員之一，生物信息學分析顯示，RASSF2與其他成員一樣，也含有RAS相關域［7］。RASSF2位于人類常染色體20p13，有329個氨基酸的開放閱讀框，11個外顯子。根據不同的啟動子和外顯子選擇剪接，可形成RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C3個不同的轉錄本，其中，RASSF2A是最長的轉錄本，也是唯一一個含有5′CpG島的轉錄本。RASSF2A在卵巢癌組織中發揮抑癌基因的作用，如抑制細胞生長，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡等，是一個腫瘤抑制基因。本研究分析了RASSF2A基因在上皮性卵巢癌組織中的轉錄表達及其甲基化水平。RT－PC檢測結果顯示，RASSF2A基因表達水平在良性卵巢腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中依次降低，提示RASSF2A的轉錄失活，可能參與了卵巢癌的惡性演進過程，RASSF2A在上皮性卵巢癌中也起到抑癌基因的作用。張嫻等［8］研究結果顯示，RASSF2A基因甲基化可能參與了宮頸癌的發生，與宮頸癌的惡性進展密切相關。本研究結果顯示，良性卵巢腫瘤組織中未發生RASSF2A啟動子區甲基化，而基因異常甲基化從交界性腫瘤到癌呈逐漸上升的趨勢，RASSF2A基因甲基化從無到有，從少到多的現象，說明了RASSF2A基因啟動子區甲基化從卵巢上皮增殖階段就開始起作用，與卵巢癌發生密切相關。多項研究表明，RASSF2A啟動子區高甲基化與基因表達沉默有關［9－11］。本研究結果表明，在發生RASSF2A甲基化的組織中，其基因表達水平明顯下降，兩者呈負相關。結果提示，在卵巢癌中RASSF2A啟動子甲基化是導致其低表達或者表達缺失的重要原因，這在細胞試驗中也得到驗證。應用甲基轉移酶抑制劑5－aza－dC對卵巢癌細胞株進行去甲基化處理后，卵巢癌細胞株的基因啟動子甲基化被逆轉，而其mR－NA的表達水平明顯升高，從而進一步證實了RASSF2A啟動子CpG島的異常甲基化在調節RASSF2A基因的表達中發揮重要作用。研究顯示，RASSF2A基因甲基化程度與宮頸癌、胃癌的淋巴結轉移有關［8，12］，而與胰腺癌和結直腸癌［9，13］患者臨床病理特征無關。另有研究表明，基因啟動子甲基化水平與癌癥患者年齡密切相關［14］。在子宮內膜癌的研究中顯示，＞45歲的患者更容易發生RASSF2A甲基化（P＝0．041）［15］。在結腸癌和口腔鱗癌中也發現，RASSF2A基因甲基化程度與年齡相關［13，16］。在生物個體發育過程中，伴隨著時間的進程，DNA甲基化異常會不斷呈現，由此認為，表觀遺傳學疾病是一種與年齡相關性疾病。這在某種程度上解釋了為什么腫瘤多發生在老年人。檢測DNA甲基化程度可作為細胞衰老的標志之一。本研究結果顯示，RASSF2A基因甲基化水平與卵巢癌患者的臨床病理參數之間無明顯的相關性，是上皮性卵巢癌中的早期頻發事件，隨著患者年齡的增加，RASSF2A基因甲基化有增高的趨勢，但差異無統計學意義，可能上皮性卵巢癌中RASSF2A基因甲基化不是年齡相關的表觀遺傳學改變。

綜上所述，RASSF2A啟動子區的高甲基化是卵巢癌發生和發展過程中的頻發事件，是導致卵巢癌中RASSF2A低表達或表達缺失的重要原因，其參與了卵巢癌的發病過程，并在卵巢癌的發生和發展中發揮著重要作用。監測RASSF2A基因啟動子CpG島甲基化水平可作為表觀遺傳學的分子靶標，指導卵巢癌的診斷及其預后判定。

參考文獻

［1］SiegelR，NaishadhamD，JemalA．Cancerstatistics［J］．CACancerJClin，2012，62（1）：10－29．

［2］ShiH，LiY，WangX，etal．AssociationbetweenRASSF1Apro－motermethylationandovariancancer：ameta－analysis［J］．PLoSOne，2013，8（10）：e76787．

［3］李其榮，劉培淑，馮進波．卵巢腫瘤組織和血清中RASSF1A基因甲基化檢測及臨床意義的研究［J］．中華腫瘤防治雜志，2008，15（5）：374－377．

［4］FuLJ，ZhangSL．ExpressionofRASSF1Ainepithelialovariancancers［J］．EurRevMedPharmacolSci，2015，19（5）：813－817．

［5］MannJR．Epigeneticsandmemigenetics［J］．CellMolLifeSci，2014，71（7）：1117－1122．

［6］JoungJG，KimD，KimKH，etal．Extractingcoordinatedpat－terntsofdnamethylationandgeneexpressioninovariancancer［J］．JAmMedInformAssoc，2013，20（4）：637－642．

［7］AkinoK，ToyotaM，SuzukiH，etal．TheRaseffectorRASSF2isanoveltumor－suppressorgeneinhumancolorectalcancer［J］．Gastroenterology，2005，129（1）：156－169．

［8］張嫻，張友忠．宮頸癌RASSF2A基因啟動子甲基化與其臨床病理特征的關系［J］．現代婦產科進展，2014，23（7）：524－526．

［9］ZhaoL，CuiQ，LuZ，etal．AberrantmethylationofRASSF2Ainhumanpancreaticductaladenocarcinomaanditsrelationtoclini－copathologicfeatures［J］．Pancreas，2012，41（2）：206－211．

［10］Guerrero－SetasD，Perez－JanicesN，Blanco－FernandezL，etal．RASSF2Ahypermethylationispresentandrelatedtoshortersurvivalinsquamouscervicalancer［J］．ModPathol，2013，26（8）：1111－1122．

［11］任芳，波．RASSF2基因甲基化與卵巢透明細胞癌的相關性［J］．中國醫科大學學報，2014，43（11）：969－972．

［12］MaruyumaR，AkinoK，toyataM，etal．CytopalsmicRASSF2Aisaproapoptoticmediatorwhoseexpressionisepigeneticallysi－lencedingastriccancer［J］．Carcinogenesis，2008，29（7）：1312－1318．

［13］ParkHW，KangHC，KimIJ，etal．Correlationbetweenhyperm－ethylationoftheRASSF2ApromoterandK－ras／BRAFmuta－tionsinmicrosatellite－stablecolorectalcancers［J］．IntJCancer，2007，120（1）：7－12．

［14］HorvathS．DNAmethylationageofhumantissuesandcelltypes［J］．GenomeBiol，2013，14（10）：R115．

［15］LiaoX，SiuMK，ChanKY，etal．HypermethylationofRASef－fectorrelatedgenesandDNAmethyltransferase1expressioninendometrialcarciongenesis［J］．IntJCancer，2008，123（2）：296－302．

表觀遺傳學研究方法范文第5篇

[關鍵詞] 宮頸癌；DKK-3基因啟動子；甲基化；臨床意義

[中圖分類號] R711.74 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）12（b）-0087-03

宮頸癌的發病機制與基因啟動子甲基化等表觀遺傳學改變密切相關，目前發現越來越多的基因參與了宮頸癌的發病，可作為宮頸癌病情及預后評估的標志物[1-2]。Dickkopf相關蛋白3（Dickkopf-related protein 3，DKK-3）基因具有抑制細胞增殖作用，與腫瘤的發生、發展、轉移及預后緊密相關，其基因啟動子甲基化在多種腫瘤中可反映病情及預后，成為腫瘤基因水平的標志物[3-4]。本研究比較了宮頸癌患者和健康女性的DKK-3基因啟動子甲基化狀態，研究DKK-3基因啟動子甲基化在宮頸癌中的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年1月～2012年12月確診的80例宮頸癌患者為研究對象，均經臨床表現、體格檢查、影像學檢查、細胞學和病理組織學檢查確診，年齡31～80歲，平均（50.9±12.7）歲；病理類型：鱗癌53例，腺癌16例，腺鱗癌11例；根據FIGO 2009分期標準，Ⅰ期16例，Ⅱ期33例，Ⅲ期21例，Ⅳ期10例。另以同期參加健康體檢的80例健康女性作為比較對象，年齡30～80歲，平均（51.1±14.6歲）。兩組研究對象在年齡等一般資料方面比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 DKK-3基因啟動子甲基化檢測方法

對所有研究對象宮頸取活檢組織或術后病理標本后立即提取基因組DNA，采用甲基化特異性PCR檢測DKK-3基因啟動子甲基化。將提取的基因組DNA行重硫酸鹽轉化，轉化后的樣本進行PCR擴增。引物采用Methprimer設計，序列見表1，反應體系為25 μl，反應條件為95℃預變性12 min，95℃變性1 min，64℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環，最后一輪72℃延伸10 min。擴增后的產物經瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.5統計學軟件對相關數據進行分析，計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法計算，以P

2 結果

2.1 宮頸癌患者和健康女性DKK-3基因啟動子甲基化的比較

宮頸癌患者中有49例宮頸活檢組織檢測到DKK-3基因啟動子甲基化，甲基化率為61.3%；健康女性中有2例檢測到DKK-3基因啟動子甲基化，甲基化率為2.5%，宮頸癌患者DKK-3基因啟動子甲基化率顯著高于健康女性（P

2.2 不同臨床病理因素中DKK-3基因啟動子甲基化差異的比較

宮頸癌患者宮頸活檢組織DKK-3基因啟動子甲基化率在年齡、吸煙史、酗酒史和病理類型中差異均無統計學意義（P>0.05），在HPV感染、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結轉移、遠處轉移和FIGO分期中的差異均有統計學意義（P

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學最主要的調控基因表達方式，是一種非DNA序列改變的轉錄前基因調控，甲基化CG位點導致DNA序列致密化，結合甲基結合蛋白后可阻遏轉錄因子形成轉錄復合物從而抑制基因表達，目前研究發現DNA甲基化調控主要集中在富含CG位點的基因啟動子區域[5]。大量的體內外實驗表明基因啟動子甲基化導致基因處于表達抑制狀態，抑癌基因的表達下降導致正常細胞失去調控而癌變，在眾多腫瘤中可檢測到抑癌基因啟動子的甲基化狀態[6-7]。DKK-3屬于DKK基因家族成員之一，經典的DKK家族被認為是Wnt信號傳導通路的調控因子，但目前對DKK-3的功能尚未完全清楚，大多數研究表明其具有促進細胞凋亡和腫瘤血管產生的作用，在多種腫瘤細胞中表現為低表達狀態[8]。目前研究發現，DKK-3基因啟動子在消化道腫瘤、呼吸系統腫瘤等眾多腫瘤中處于高甲基化狀態，且其甲基化與病情及預后緊密相關，可作為這些腫瘤的生物標志物，較傳統的蛋白質水平分子標志物具有更高的靈敏度及特異性[9]。本研究提示，宮頸癌患者DKK-3基因啟動子甲基化率顯著高于健康女性，表明與其他腫瘤基本相似，宮頸癌患者DKK-3基因啟動子處于高甲基化抑制狀態。

本研究比較了不同臨床病理因素下DKK-3基因啟動子甲基化率的差異，發現分化程度越低、腫瘤直徑越大、有淋巴結轉移、遠處轉移及FIGO分期晚的宮頸癌患者DKK-3基因啟動子甲基化率高于分化程度越高、腫瘤直徑越小、無淋巴結轉移、無遠處轉移及FIGO分期早的患者，這些證據表明DKK-3基因啟動子甲基化與宮頸癌的病情及預后密切相關。因為腫瘤的分化程度和臨床分期是目前公認的與宮頸癌病情及預后的指標，DKK-3基因啟動子甲基化可作為宮頸癌的生物標志物，可為宮頸癌的診斷、病情與預后評估提供證據，值得一提的是本研究樣本數較少，且缺乏遠期隨訪證據，該結論有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 崔華英，周栩茹，韓慶，等.宮頸癌RAS相關區域家族1A基因啟動子甲基化檢測及臨床意義研究[J].中國全科醫學，2011，14（14）：1529-1531，1534.

[2] 巫劍紅，田玉翠，萬治安，等.宮頸癌性別決定基因9基因啟動子區甲基化水平檢測對宮頸癌的價值研究[J].中國全科醫學，2013，16（6）：618-620.

[3] 陶累累.Wnt信號通路拮抗因子DKK-3在腫瘤中的研究進展[J].臨床腫瘤學雜志，2012，17（8）：752-755.

[4] 柯楊.DKK-3基因啟動子甲基化在非小細胞肺癌中的臨床研究[D].武漢：華中科技大學，2012.

[5] 王先火，趙秀娟，邱立華，等.腫瘤發生的表觀遺傳學：進展與臨床意義[J].北京大學學報·醫學版，2012，44（5）：701-707.

[6] 康靜婷，梁前進，梁辰，等.表觀遺傳學研究進展[J].科技導報，2013，31（19）：66-74.

[7] 李穎，唐世倩，翟瑞芳，等.S100A4及其甲基化與早期宮頸癌淋巴轉移的相關性研究[J].山西醫科大學學報，2013，44（8）：641-644，

[8] 吳建軍，叢顧俊，劉繼斌，等.肝癌中拮抗Wnt信號通路的CpG島甲基化表型與臨床病理特征之間的關系[J].現代檢驗醫學雜志，2012， 27（6）：34-36.