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分子生物學進展范文第1篇

關鍵詞:禽類防御素;分子生物學;進化;活性

中圖分類號:S83 文獻標志碼:A 文章編號:0529－5130(2016)01－0136－04

禽類防御素是一類內源性陽離子抗菌肽，在禽類先天性免疫系統中發揮著重要作用。禽類防御素具有廣譜抗細菌、真菌和某些病毒的活性，是禽類抵抗外來致病性微生物侵襲的重要武器。據推測，由于禽類的異嗜性白細胞缺乏氧化機制，禽類可能更多依賴于防御素等抗菌肽類物質來抵御感染［1］。目前，科研工作者們已從多種家禽和野禽體內發現了數十種防御素或其基因，并對部分禽類防御素的分子結構、抗菌活性、抗病毒活性和組織表達特性等進行了研究［2］。體外研究發現，除了抗微生物活性，某些禽類防御素還參與免疫調節和生殖活動。近些年，國內外對禽類防御素的研究報道不斷增多，下面對其分子生物學方面的研究進展做一綜述。

1禽類防御素的分子結構

從分子結構劃分，目前已發現的所有禽類防御素均屬于β－防御素。因此，禽類防御素又被稱為禽β－防御素(avianbetadefensins，AvBDs)。AvBDs的前體由一個分泌型的信號肽和成熟肽構成，許多AvBDs前體還有一個短的前片段(propiece)。前片段連接信號肽和成熟肽，通常被認為起到抑制防御素的活性，防止其傷害宿主細胞的作用。少數AvBDs，例如雞AvBD3和AvBD11，在成熟肽的C末端還有一個后片段(post－piece)。后片段的作用尚不十分清楚。通過分析雞AvBD11的后片段發現其有3對二硫鍵結構，因此人們推測雞AvBD11的后片段可能是基因復制過程中出現的多拷貝［3］。AvBDs的成熟肽部分是最終發揮生物學功能的成熟分子，通常由38～46個氨基酸構成，大小為3～4ku。成熟肽具有β－折疊和α－螺旋結構，分子內有6對半胱氨酸形成的3對二硫鍵。二硫鍵對保證AvBDs的正確折疊和維持空間構象具有重要作用。

2禽類防御素的基因進化

研究發現，哺乳動物的α－防御素基因簇位于β－防御素基因簇中，而少數靈長類特有的θ－防御素基因位于α－防御素基因中［4］。這暗示α－防御素基因由β－防御素基因進化而來，而θ－防御素基因又由α－防御素基因進化而來。3種動物防御素中，只有β－防御素是所有脊椎動物所共有的，從低等的魚類到高等的哺乳類動物都發現有β－防御素，而且β－防御素的氨基酸序列和結構更接近于昆蟲等低等生物的防御素。進化樹分析也發現，禽類防御素與哺乳動物β－防御素的進化關系近。這些研究表明，禽類和哺乳類動物的防御素基因可能源自于它們共同的遠古基因。禽類的基因組中有多個AvBD基因。根據雞的基因組測序結果，人們發現雞有14種防御素(Gal－1～Gal－14)，并通過生物信息學技術確定了這些防御素的基因序列。這14種防御素基因均位于3號染色體的末端，且成簇存在［5］。在其他禽類體內也發現了多種AvBD基因。進化樹分析表明，AvBD基因在鳥類分化前就已經在進化。禽類有許多同源AvBD基因，但有些AvBD基因也顯示出了一定的物種特異性，例如AvBD14目前只發現于雞。基于進化樹的分析顯示AvBD14可能由AvBD13的一個重復拷貝進化而來。隨著斑胸草雀(zebrafinch)基因組測序的完成，人們對比分析了雞和斑胸草雀的β－防御素基因。基因組測序顯示斑胸草雀有22個β－防御素基因，其中的10個能在雞的基因組中找到同源基因，另外的12個基因可能由AvBD1或AvBD3演變而來，例如AvBD123和AvBD118［2］。多個防御素基因的存在可能對提高禽類的免疫防御能力具有幫助。對其他已發現的禽類(例如鴨、鵝、鵪鶉、鴿等)的防御素基因進行分析也發現，同類禽防御素基因的同源性較高，但不同物種間仍有明顯差異，特別是防御素的成熟肽部分變化較大。和哺乳動物的防御素一樣，禽類防御素的成熟肽很可能在正向選擇(positiveselec-tion)壓力下發生進化［6］。在正向選擇壓力下，成熟肽的某些氨基酸變位點發生改變，生物學活性也隨之變化。

3禽類防御素的組織分布與表達調控

和動物防御素一樣，禽類防御素主要來自骨髓源細胞或上皮細胞。例如雞AvBD1，2和4－7在骨髓源細胞中表達，而AvBD8－14主要由各種上皮細胞表達，當然其他一些組織細胞也具有表達防御素的能力［7］。AvBDs在不同組織中的表達量不同。AvBD1，2，6和7在骨髓中表達量較高;AvBD1，2，6在法氏囊中表達量較高;AvBD13在脾臟中表達量較高。AvBD2在異嗜細胞中高表達;AvBD1，2，6，10在呼吸道中表達量較高;AvBD9－12在腎臟中大量表達［3，8］。在禽類的生殖器官中也有防御素的大量表達，例如雞AvBD1，2，4，6在組織中高表達，可能暗示這些防御素與生殖活動有關。某些人類β－防御素(例如DEFB126)被證實與生成有關［9］，是否禽類防御素也具有類似的功能還有待進一步研究。除了組織差異外，禽類防御素的表達量也有種屬差異。例如有研究表明，AvBD10在鵪鶉骨髓中高表達，而在雞骨髓中沒有發現高表達［10］。目前的研究表明，禽類防御素的表達受動物生長、感染、日糧成分和炎癥反應等多種因素的調控。AvBD7在母雞的生長過程中表達量逐漸增加直至性成熟，而AvBD14的表達則恰恰相反［11］。在雞性成熟后，多數AvBDs在附睪、陰道等處表達量升高［12］。蛋雞生殖道中防御素的表達受LPS和白介素的影響［13］。鴨感染鴨肝炎病毒后，肝臟中AvBD7的表達量上調，而AvBD12在多個器官中的表達量則下調［14］。日糧中維生素D3的含量能影響雞AvBD1的表達［2］;飼料中添加丁酸鹽能提高多數雞AvBDs的表達水平［15］。

4禽類防御素的生物學活性

4.1抗微生物活性

研究表明，大多數AvBDs顯示出良好的抗微生物活性。企鵝AvBD103b對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、星形奴卡菌等多種革蘭陽性菌均具有殺滅作用［16］。雞AvBD9在2～4μmol/L濃度下即對多數革蘭陽性菌和革蘭陰性菌具有抑制效果［8］。許多其他禽類防御素也具有廣譜抗菌活性(表1)。目前，關于AvBDs抗微生物機理研究較少。據推測，AvBDs可能與其他動物的防御素一樣，能通過擾亂脂質雙分子層等方式發揮抗病原微生物的作用。帶正電荷的AvBDs能與富含負電荷的細胞膜結合，然后將疏水性的肽段插入到脂質雙分子層中，導致細胞膜通透性增加，最終達到殺菌目的。帶正電荷低的AvBDs通常抗菌效果也較差，這說明AvBDs所帶電荷對其抗菌非常重要。研究還發現，AvBDs的二級結構對殺菌同樣重要。缺少二硫鍵的線性AvBD2分子殺菌效果降低，無法有效殺滅金黃色葡萄球菌，但對大腸桿菌仍具有殺菌效果［17］。許多AvBDs的抗菌活性受鹽離子濃度、pH值等理化因素的影響［8，14］。高鹽條件下(例如氯化鈉濃度達到150mmol/L)，AvBDs的抗菌活性往往會受到抑制。

4.2抗病毒活性

已報道，某些AvBDs對病毒具有抑制作用。鴨AvBD1、AvBD3、AvBD6等能抑制鴨肝炎病毒(DHV)的增殖，延長鴨胚接毒后的存活時間［21］。雞胚成纖維細胞感染流感血凝素重組痘病毒后，AvBD4、AvBD6的表達量會升高［25］。體外試驗表明，雞AvBD2、AvBD6和AvBD12具有抑制傳染性支氣管炎病毒的作用［26］。

4.3免疫調節作用

除了抗微生物活性外，AvBDs在禽類體內還發揮著多種免疫調節作用，例如趨化作用和細胞分化。有研究表明，雞AvBD13對LPS處理的脾臟淋巴細胞的增殖分化具有促進作用［27］。鴨AvBD2能趨化DT40B淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞等［19］。

4.4在禽類生殖中的作用

近些年的研究表明，某些AvBDs在生殖器官中大量表達，可能與禽類的生殖有密切關系。從現有的研究結果來看，AvBDs在生殖器管中的表達可能有兩方面的作用:一方面，參與生殖系統的抗感染，構成生殖系統抗感染的重要防線;另一方面，可能參與了禽類的生殖細胞分化，并維持生殖細胞的正常活力。雞AvBD1、AvBD2等9種防御素在組織中有表達，其中一些防御素在公雞性成熟過程中表達量上升［28］。母雞感染沙門菌后，AvBD5、AvBD7等防御素在陰道中的表達量上調［29］。公雞感染沙門菌后，AvBD10、AvBD12、AvBD14在中的表達量上調［30］。

5展望

分子生物學進展范文第2篇

【關鍵詞】HIV病毒；分子生物學檢測；進展

艾滋病病毒（HIV）主要侵襲人體免疫系統，導致人體免疫缺陷發生多種感染疾病或腫瘤。艾滋病的不可治愈及其快速傳播使患者不斷增多，2012年全球感染總人數已達3900萬人，中國近半艾滋病病毒感染者尚未發現，為了防止艾滋病的大規模流行，艾滋病的檢測工作越發重要。目前篩查的免疫學方法，由于靈敏度低，漏檢窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸檢測為代表的分子生物學技術，靈敏度和特異性均顯著提高，明顯縮短檢出病原體的窗口期，是HIV診斷方法和診斷試劑持續發展的主要方向，對遏制艾滋病的傳播蔓延有重要意義。

1 HIV生物學特性

HIV呈圓形或橢圓形，直徑900～140nm，外層為類脂包膜，成分是外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心由RNA逆轉錄酶、DNA多聚酶和結構蛋白等組成，基因組除了具有逆轉錄病毒的基本結構——基因長末端重復序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（po1）、包膜蛋白（env）gF，還有非常復雜的調控機制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等調節基因，其作用是在轉錄、翻譯、裝配等各個環節對病毒的生長和繁殖起調節作用。HIV基因組中存在3個gag-pol- env.Gag基因編碼的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白體上，P17位于白與殼層之間的基質上，包被于包膜蛋白的內部。核衣殼包被于內部核酸的，由主要的P24和P40及P55組成，其結構比較穩定，是HIV-1型的特異性蛋白。Env編碼包膜蛋白即gp120和gp41，起協助HIV進入宿主細胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核區內，并與病毒核酸緊密相關[1]。

根據env基因V3段堿基排列的不同，HIV-1分為11個亞型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亞型，HIV-2分為6個亞型[2]，不同國家和地區有相對優勢亞型，HIV亞型在流行病學、診斷、臨床、試劑選擇、藥物篩選和疫苗研制上有著重要意義。

2 HIV-1的感染機制及感染標志

病毒侵入人體后，通過病毒表面gpl20在化學因子CCR5或CXCR4幫助下與細胞表面受體CD4分子結合，然后在gp41的協助下HIV的膜與CD4+細胞的細胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA進入胞漿。兩條RNA+在逆轉錄酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下復制DNA，此DNA部分存留在胞漿內產生系列變化，然后在細胞膜上裝配成新病毒，再感染其它細胞。HIV感染后，首先能夠監測到病毒RNA，其次是p24抗原，最后是抗體[3]。

3 分子生物學檢測技術

隨著分子生物學檢測技術快速發展，HIV RNA或DNA檢測得到應用，核酸檢測已是艾滋病實驗室診斷的主要發展方向[4]，在HIV感染的監測、診斷、研究、療效觀察及預后判斷等方面均發揮著越來越大的作用，主要有定性和定量兩類。

3.2 定性檢測

3.2.1 原位雜交（insite hydzmion）

應用特定的標記探針以分子雜交法直接檢測標本中的HIV病毒靶核酸，起初標記探針是放射性標記，后來逐漸發展為酶標記或化學發光標記等等。原位雜交的陽性率比聚合酶鏈反應（PCR）略低，隨著核酸擴增技術的出現并廣泛使用，基因探針技術也就逐漸失去應用意義。

3.2.2 聚合酶鏈反應技術（PCR）

PCR是一種以核酸生物學為基礎的分子生物學診斷技術。基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成。患者感染HIV 1～14d后血漿中能檢測出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗體檢測不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查，尤其在HIV陽性母親產下的嬰兒是否感染HIV的診斷中有著非常重要的意義，前病毒DNA PCR檢測法對出生48h內的嬰兒檢測敏感性為38%，出生14d的嬰兒檢測敏感性達93%[5]。

3.2.3 逆轉錄多聚酶鏈反應技術（RT-PCR）

RT-PCR技術通過對RNA逆轉錄酶的應用實現，即將病毒RNA逆轉錄DNA，接著進行PCR，指數擴增DN段，將放大產物變性并與多孔板結合，利用酶聯系統進行檢測。RT-PCR技術可在2h內擴增產物達到凝膠電泳或實時熒光法可檢測的水平，準確定量的RT-PCR方法已被許多商業實驗室證實，目前多種改良的快速RT-PCR檢測方法應用于HIV的快速臨床診斷[6，7]。

PCR靈敏度高、特異性強、操作簡便，但易污染出現假陽性結果；此外，HIV基因的多樣性，尚無一套引物能夠覆蓋所有的HIV序列，限制了檢測敏感性，因此，陽性結果還須核酸序列測定加以確認。HIV核酸定性檢測陽性結果可作為HIV 抗體窗口期的早期診斷的輔助指標，但不能單獨用于HIV感染的確診，成為限制PCR對于HIV感染診斷的臨床應用。

3.3 定量檢測

HIV核酸定量檢測即病毒載量測定，感染HIV后病情發展速度直接與血漿中病毒載量呈正比。在其他血清學和病毒學標志出現前檢出病毒核酸，使窗口期縮短6～11.5d，且慢性潛伏期也能檢出，便于早期輔助診斷；HIV病毒載量常用于用于評估疾病病程、監測抗病毒治療成效、選擇抗病毒治療方案；還可用于鑒定出生后18個月內的嬰兒血液中的HIV-IgG抗體是否來自于母體，嬰兒是否感染HIV（母嬰診斷）。當前，常用的定量檢測方法有較高的敏感性、特異性和可重復性。

3.3.1 分支DNA信號擴大系統（bDNA）

bDNA是指人工合成帶有側鏈的DN段標記被激發的標記物，利用發光強度與樣品中HIV RNA含量成比例，可通過發光強度來定量檢測血漿中HIV-1型RNA的一種方法。bDNA作為一種定量核酸檢測方法具有對檢測靶序列變異的更強識別能力，目前發展到靈敏度更好的、具有靶序列放大系統的第三代bDNA有數十個覆蓋整個基因組的探針，不僅可用于檢測HIV感染，可以方便地檢測HIV的部分變異株，且可用于療效觀察，文獻報道其為一種高靈敏度及特異性的方法[8，9]。與PCR相比bDNA不存在擴增物的交叉污染，但靈敏度不如PCR，提高bDNA的靈敏度仍是難點[10]。

3.3.2 核酸序列依賴的擴增系統（NASBA）

NASBA是以RT-PCR為基礎，由一對引物介導的、連續均一的、體外特異性核苷酸序列等溫擴增RNA的新技術，原理是提取病毒RNA，加入AMV逆轉錄酶、核酸酶H（Rnase H）、T7RNA聚合酶和引物進行擴增。NASBA無需熱循環裝置，只在一個溫度下進行（42℃），即可擴增大量拷貝的RN段。對不同條件的實驗室可以一次擴增足量的RNA用于多次研究和直接使用肝素抗凝的血漿樣品，適合凍存血漿的回顧性分析。其高效擴增的特性，能與多孔板酶介導的顯像技術及實時熒光檢測結合。因擴增產物的不穩定性特征，對傳染病病原的定性、定量檢測，減少了分子診斷實驗室擴增產物的交叉污染。但操作較繁瑣，不便于大批量處理，且擴增時退火溫度較低，容易引起污染，當前，NASBA已應用于HIV-1的分子診斷[10]。

3.3.3 轉錄介導的擴增系統（TMA）

TMA技術原理與NASBA大致相同，差別是TMA利用MMLV逆轉錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性，反應溫度為41.5℃，1h內RNA模板擴增約109倍。相比p24抗原檢測，TMA技術可縮短窗口期6 d，比HIV抗體檢測縮短14 d [11]。

3.3.4 連接酶酶促鏈式反應 （LCR）

LCR法是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴增技術，原理是由兩段數l0個核苷酸組成的單鏈DNA探針與目標序列雜交，將被檢測物中的特異性片段進行擴增，檢測擴增產物。LCR既可擴增，又可檢測DNA突變，對已知突變類型的基因診斷是一個切實有效可行的方法，是隨PCR后一種較有發展前景的體外擴增新技術。

3.3.5 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術的應用使HIV核酸檢測技術又進入到一個新境界。原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。一般使用TaqMan探針或Sybr Green熒光染料。但Sybr Green染料不能區別目的產物和非目的產物，使結果有偏差，目前廣泛使用的是TaqMan探針技術。熒光實時PCR則可以進行實時檢測，改變了傳統的電泳終點檢測，得到相應的S型擴增曲線，其不但可以進行定性檢測，更重要的是可以進行定量檢測。與常規相比，具有特異性強、自動化程度高、有效解決污染問題等特點，能夠檢測血漿中的病毒載量及血液中單個核細胞的前病毒載量。美國PE公司1996年發明TaqMan技術[12]，已廣泛應用于基因檢測， 國內2002年4月深圳匹基公司獲批準第一個生產HIV熒光PCR檢測試劑盒，并應用于臨床診斷，國產實時熒光RT-PCR試劑檢測HIV-1血漿病毒載量與進口試劑相比具有較好的相關性[13]，并具有價格低廉的優勢，已在臨床逐步推廣應用。

3.3.6 PCR-ELISA

PCR-ELISA技術是PCR擴增以后，在微孔板上借用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的原理，使用酶標抗體，進行固相雜交來實現定量。該技術是一種具有很高靈敏度和特異性的方法[14]，但ELISA是一個開放性的反應，擴增后進行ELISA反應，容易產生污染引起假陽性，同時操作過程較繁瑣，臨床上難以廣泛應用。

3.3.7 基因芯片技術

是PCR技術與核酸分子雜交相結合，通過對HIV基因組分析，將該病毒的高度保守序列作為鑒定指標，可直接對病毒病原體進行檢測，顯著提高了診斷的準確性。1996年，Kozal等[15]研制出一種DNA芯片，對HIV-1逆轉錄酶及蛋白酶的基因突變進行篩選，并跟蹤監測HIV拮抗藥物的產生和突變、疾病相關基因型以及患者在治療中的反應。1998年，Hauser等[16]應用DNA芯片技術在艾滋病患者出現抗體反應前檢測HIV，對艾滋病的早期診斷有十分重要的意義。Affy-nletrix公司和Roche Mo1ecular公司合作生產的新一代診斷試劑盒，利用RMS實驗室的PCR擴增技術和DNA芯片技術結合檢測艾滋病患者的HIV耐藥反應。HIV PRT440也已廣泛用于HIV-l病毒的測序、分型及多態性分析[17] 。基因表達譜研究可以高通量在檢測基因表達信息[18]。國內也有文獻報道采用基因芯片檢測HIV[19，20] 。由此可見，基因芯片在鑒定HIV感染中具有其他方法無可比擬的優越性。

盡管基因芯片技術需要進一步的不斷完善，但完全可以預計在不久的將來其應用前景會錦上添花。不單限于HIV的耐藥性檢測和基因診斷，可以讓許多感染性疾病病原體的基因集中在一張芯片上，同時對其進行感染診斷。

總之，分子生物學檢測技術有助于HIV感染者的早發現、早診斷、早治療，也有助于對治療艾滋病藥物的療效評價、預測和監測疾病進程，減少艾滋病對個人、家庭及社會的危害。隨著HIV分子生物學技術在高特異性、高敏感性、快速、自動化等方面的不斷進步，HIV分子診斷可望成為艾滋病診斷標準之一，并通過對HIV突變及個體遺傳差異的檢測指導抗病毒治療，為人類遏止艾滋病的流行發揮重要的作用。

參考文獻：

[1] 楊紹基，任紅.傳染病學[M].第7版.北京：人民衛生出版社，2008：113.

[2] 倪語星，尚紅.臨床微生物學檢驗[M].第5版.北京：人民衛生出版社，2012：112-116.

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艾滋病病毒（HIV）主要侵襲人體免疫系統，導致人體免疫缺陷發生多種感染疾病或腫瘤。艾滋病的不可治愈及其快速傳播使患者不斷增多，2012年全球感染總人數已達3900萬人，中國近半艾滋病病毒感染者尚未發現，為了防止艾滋病的大規模流行，艾滋病的檢測工作越發重要。目前篩查的免疫學方法，由于靈敏度低，漏檢窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸檢測為代表的分子生物學技術，靈敏度和特異性均顯著提高，明顯縮短檢出病原體的窗口期，是HIV診斷方法和診斷試劑持續發展的主要方向，對遏制艾滋病的傳播蔓延有重要意義。

1 HIV生物學特性

HIV呈圓形或橢圓形，直徑900～140nm，外層為類脂包膜，成分是外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心由RNA逆轉錄酶、DNA多聚酶和結構蛋白等組成，基因組除了具有逆轉錄病毒的基本結構——基因長末端重復序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（po1）、包膜蛋白（env）gF，還有非常復雜的調控機制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等調節基因，其作用是在轉錄、翻譯、裝配等各個環節對病毒的生長和繁殖起調節作用。HIV基因組中存在3個gag-pol- env.Gag基因編碼的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白體上，P17位于白與殼層之間的基質上，包被于包膜蛋白的內部。核衣殼包被于內部核酸的，由主要的P24和P40及P55組成，其結構比較穩定，是HIV-1型的特異性蛋白。Env編碼包膜蛋白即gp120和gp41，起協助HIV進入宿主細胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核區內，并與病毒核酸緊密相關[1]。

根據env基因V3段堿基排列的不同，HIV-1分為11個亞型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亞型，HIV-2分為6個亞型[2]，不同國家和地區有相對優勢亞型，HIV亞型在流行病學、診斷、臨床、試劑選擇、藥物篩選和疫苗研制上有著重要意義。

2 HIV-1的感染機制及感染標志

病毒侵入人體后，通過病毒表面gpl20在化學因子CCR5或CXCR4幫助下與細胞表面受體CD4分子結合，然后在gp41的協助下HIV的膜與CD4+細胞的細胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA進入胞漿。兩條RNA+在逆轉錄酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下復制DNA，此DNA部分存留在胞漿內產生系列變化，然后在細胞膜上裝配成新病毒，再感染其它細胞。HIV感染后，首先能夠監測到病毒RNA，其次是p24抗原，最后是抗體[3]。

3 分子生物學檢測技術

隨著分子生物學檢測技術快速發展，HIV RNA或DNA檢測得到應用，核酸檢測已是艾滋病實驗室診斷的主要發展方向[4]，在HIV感染的監測、診斷、研究、療效觀察及預后判斷等方面均發揮著越來越大的作用，主要有定性和定量兩類。

3.2 定性檢測

3.2.1 原位雜交（insite hydzmion）

應用特定的標記探針以分子雜交法直接檢測標本中的HIV病毒靶核酸，起初標記探針是放射性標記，后來逐漸發展為酶標記或化學發光標記等等。原位雜交的陽性率比聚合酶鏈反應（PCR）略低，隨著核酸擴增技術的出現并廣泛使用，基因探針技術也就逐漸失去應用意義。

3.2.2 聚合酶鏈反應技術（PCR）

PCR是一種以核酸生物學為基礎的分子生物學診斷技術。基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成。患者感染HIV 1～14d后血漿中能檢測出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗體檢測不確定等情況的輔助診斷或用于血液篩查，尤其在HIV陽性母親產下的嬰兒是否感染HIV的診斷中有著非常重要的意義，前病毒DNA PCR檢測法對出生48h內的嬰兒檢測敏感性為38%，出生14d的嬰兒檢測敏感性達93%[5]。

3.2.3 逆轉錄多聚酶鏈反應技術（RT-PCR）

RT-PCR技術通過對RNA逆轉錄酶的應用實現，即將病毒RNA逆轉錄DNA，接著進行PCR，指數擴增DN段，將放大產物變性并與多孔板結合，利用酶聯系統進行檢測。RT-PCR技術可在2h內擴增產物達到凝膠電泳或實時熒光法可檢測的水平，準確定量的RT-PCR方法已被許多商業實驗室證實，目前多種改良的快速RT-PCR檢測方法應用于HIV的快速臨床診斷[6，7]。

PCR靈敏度高、特異性強、操作簡便，但易污染出現假陽性結果；此外，HIV基因的多樣性，尚無一套引物能夠覆蓋所有的HIV序列，限制了檢測敏感性，因此，陽性結果還須核酸序列測定加以確認。HIV核酸定性檢測陽性結果可作為HIV 抗體窗口期的早期診斷的輔助指標，但不能單獨用于HIV感染的確診，成為限制PCR對于HIV感染診斷的臨床應用。

3.3 定量檢測

HIV核酸定量檢測即病毒載量測定，感染HIV后病情發展速度直接與血漿中病毒載量呈正比。在其他血清學和病毒學標志出現前檢出病毒核酸，使窗口期縮短6～11.5d，且慢性潛伏期也能檢出，便于早期輔助診斷；HIV病毒載量常用于用于評估疾病病程、監測抗病毒治療成效、選擇抗病毒治療方案；還可用于鑒定出生后18個月內的嬰兒血液中的HIV-IgG抗體是否來自于母體，嬰兒是否感染HIV（母嬰診斷）。當前，常用的定量檢測方法有較高的敏感性、特異性和可重復性。

3.3.1 分支DNA信號擴大系統（bDNA）

bDNA是指人工合成帶有側鏈的DN段標記被激發的標記物，利用發光強度與樣品中HIV RNA含量成比例，可通過發光強度來定量檢測血漿中HIV-1型RNA的一種方法。bDNA作為一種定量核酸檢測方法具有對檢測靶序列變異的更強識別能力，目前發展到靈敏度更好的、具有靶序列放大系統的第三代bDNA有數十個覆蓋整個基因組的探針，不僅可用于檢測HIV感染，可以方便地檢測HIV的部分變異株，且可用于療效觀察，文獻報道其為一種高靈敏度及特異性的方法[8，9]。與PCR相比bDNA不存在擴增物的交叉污染，但靈敏度不如PCR，提高bDNA的靈敏度仍是難點[10]。

3.3.2 核酸序列依賴的擴增系統（NASBA）

NASBA是以RT-PCR為基礎，由一對引物介導的、連續均一的、體外特異性核苷酸序列等溫擴增RNA的新技術，原理是提取病毒RNA，加入AMV逆轉錄酶、核酸酶H（Rnase H）、T7RNA聚合酶和引物進行擴增。NASBA無需熱循環裝置，只在一個溫度下進行（42℃），即可擴增大量拷貝的RN段。對不同條件的實驗室可以一次擴增足量的RNA用于多次研究和直接使用肝素抗凝的血漿樣品，適合凍存血漿的回顧性分析。其高效擴增的特性，能與多孔板酶介導的顯像技術及實時熒光檢測結合。因擴增產物的不穩定性特征，對傳染病病原的定性、定量檢測，減少了分子診斷實驗室擴增產物的交叉污染。但操作較繁瑣，不便于大批量處理，且擴增時退火溫度較低，容易引起污染，當前，NASBA已應用于HIV-1的分子診斷[10]。

3.3.3 轉錄介導的擴增系統（TMA）

TMA技術原理與NASBA大致相同，差別是TMA利用MMLV逆轉錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性，反應溫度為41.5℃，1h內RNA模板擴增約109倍。相比p24抗原檢測，TMA技術可縮短窗口期6 d，比HIV抗體檢測縮短14 d [11]。

3.3.4 連接酶酶促鏈式反應 （LCR）

LCR法是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴增技術，原理是由兩段數l0個核苷酸組成的單鏈DNA探針與目標序列雜交，將被檢測物中的特異性片段進行擴增，檢測擴增產物。LCR既可擴增，又可檢測DNA突變，對已知突變類型的基因診斷是一個切實有效可行的方法，是隨PCR后一種較有發展前景的體外擴增新技術。

3.3.5 實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術的應用使HIV核酸檢測技術又進入到一個新境界。原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。一般使用TaqMan探針或Sybr Green熒光染料。但Sybr Green染料不能區別目的產物和非目的產物，使結果有偏差，目前廣泛使用的是TaqMan探針技術。熒光實時PCR則可以進行實時檢測，改變了傳統的電泳終點檢測，得到相應的S型擴增曲線，其不但可以進行定性檢測，更重要的是可以進行定量檢測。與常規相比，具有特異性強、自動化程度高、有效解決污染問題等特點，能夠檢測血漿中的病毒載量及血液中單個核細胞的前病毒載量。美國PE公司1996年發明TaqMan技術[12]，已廣泛應用于基因檢測， 國內2002年4月深圳匹基公司獲批準第一個生產HIV熒光PCR檢測試劑盒，并應用于臨床診斷，國產實時熒光RT-PCR試劑檢測HIV-1血漿病毒載量與進口試劑相比具有較好的相關性[13]，并具有價格低廉的優勢，已在臨床逐步推廣應用。

3.3.6 PCR-ELISA

PCR-ELISA技術是PCR擴增以后，在微孔板上借用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的原理，使用酶標抗體，進行固相雜交來實現定量。該技術是一種具有很高靈敏度和特異性的方法[14]，但ELISA是一個開放性的反應，擴增后進行ELISA反應，容易產生污染引起假陽性，同時操作過程較繁瑣，臨床上難以廣泛應用。

3.3.7 基因芯片技術

是PCR技術與核酸分子雜交相結合，通過對HIV基因組分析，將該病毒的高度保守序列作為鑒定指標，可直接對病毒病原體進行檢測，顯著提高了診斷的準確性。1996年，Kozal等[15]研制出一種DNA芯片，對HIV-1逆轉錄酶及蛋白酶的基因突變進行篩選，并跟蹤監測HIV拮抗藥物的產生和突變、疾病相關基因型以及患者在治療中的反應。1998年，Hauser等[16]應用DNA芯片技術在艾滋病患者出現抗體反應前檢測HIV，對艾滋病的早期診斷有十分重要的意義。Affy-nletrix公司和Roche Mo1ecular公司合作生產的新一代診斷試劑盒，利用RMS實驗室的PCR擴增技術和DNA芯片技術結合檢測艾滋病患者的HIV耐藥反應。HIV PRT440也已廣泛用于HIV-l病毒的測序、分型及多態性分析[17] 。基因表達譜研究可以高通量在檢測基因表達信息[18]。國內也有文獻報道采用基因芯片檢測HIV[19，20] 。由此可見，基因芯片在鑒定HIV感染中具有其他方法無可比擬的優越性。

盡管基因芯片技術需要進一步的不斷完善，但完全可以預計在不久的將來其應用前景會錦上添花。不單限于HIV的耐藥性檢測和基因診斷，可以讓許多感染性疾病病原體的基因集中在一張芯片上，同時對其進行感染診斷。

總之，分子生物學檢測技術有助于HIV感染者的早發現、早診斷、早治療，也有助于對治療艾滋病藥物的療效評價、預測和監測疾病進程，減少艾滋病對個人、家庭及社會的危害。隨著HIV分子生物學技術在高特異性、高敏感性、快速、自動化等方面的不斷進步，HIV分子診斷可望成為艾滋病診斷標準之一，并通過對HIV突變及個體遺傳差異的檢測指導抗病毒治療，為人類遏止艾滋病的流行發揮重要的作用。

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分子生物學進展范文第3篇

摘要 瑞氏木霉是自然界中普遍存在并有重要經濟意義的一種絲狀真菌，作為工業生產菌株生產多種水解酶類已有多年歷史。本文報道了用基因工程手段對瑞氏木霉進行遺傳改造，構造具新性狀的重組菌株，用以過量產生同源和異源蛋白類物質的分子生物學研究進展。包括利用CBHI基因的強啟動子在瑞氏木霉中過量表達瑞氏木霉內切葡聚糖酶、小牛凝乳蛋白酶、人抗體片段、哈茨木霉幾丁質酶、Hormoconis葡萄糖淀粉酶等同源和異源蛋白以及利用在葡萄糖上強表達的啟動子生產纖維素酶等遺傳工程進行情況。

關鍵詞瑞氏木霉；遺傳改造；基因定位置換整合；重組蛋白

1 前言

多年以來，絲狀真菌及其產生的酶類已廣泛用于食品和食品加工業。由于其在工業上的巨大應用潛力，促進了大規模發酵工程、下游加工工程和對菌株的遺傳改造的發展，其結果有助于將絲狀真菌進一步應用于當今的工業生產。大多數情況下，自然發生的菌株產生我們所需蛋白的水平很低，以至不能在商業上加以利用。因此，為了得到所需的目的蛋白，需對自發菌株進行遺傳改造。隨著分子遺傳技術和真菌基因轉移系統的發展，利用基因工程方法對絲狀真菌進行有目的的遺傳改造，已以成為可能。

絲狀真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是多細胞的真核微生物，其作為工業菌株用于生產分解不同植物材料的酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等，已有多年歷史。瑞氏木霉所產生的一種主要的纖維酶一纖維二糖水解酶I（cellobiohydrolase1），由單拷貝基因編碼，其產量可達瑞氏木霉胞外分泌性蛋白總量的50%[1]。由此可見，cbh1啟動子是很強的啟動子。因此在對瑞氏木霉的遺傳改造中，常利用cbh1的啟動子與終止子序列構建載體，并利用cbh1的前導肽序列引導重組蛋白進行分泌性表達。瑞氏木霉具有極好的合成蛋白和分泌蛋白的能力；并具有真核的分泌機制，很可能還具有與哺乳動物系統相似的蛋白修飾性能，如：高甘露糖型和N-糖基化[2]等。由于瑞氏木霉具有以上優良性能，再加之其工業化規模發酵條件已比較成熟，這些都促進了對瑞氏木霉的遺傳改造，為同源或異源分泌性蛋白的產生提供了一條行之有效的途徑。

瑞氏木霉不僅具有適于蛋白生產的諸多優點，且對人沒有毒性，在產酶條件下也不產生真菌毒素和抗生素。近年來的實踐表明，經過基因工程手術改造的瑞氏木霉重組菌株是安全無害的[3]。

2 過量生產同源蛋白一纖維素酶與木聚糖酶的生產

纖維素酶廣泛用于淀粉加工、谷物酒精發酵、麥芽制備和釀造、動物飼養以及青貯飲料加工、果汁和蔬菜汁的提取等諸多方面，近年來被應用于紡織、造紙、制漿等工業。由于纖維素酶應用范圍極其廣泛，使得開發和改造纖維素酶生產菌株具有極強的現實意義。瑞氏木霉具有降解纖維素的完全酶系，所分泌的纖維素酶混合物通常包括內切葡聚糖酶等多種酶活力。

1990年，Harkki等報道，通過基因定位置換整合使編碼CBHI的基因失活，結果EGI的產量提高，不再產生CBHI[4]（見圖1）。1993年，Karhunen等報道，將編碼EGI的基因置于強啟動子cbh1的控制之下，用此表達盒替換染色體的cbh1位點之后，EGI的產量是通常強纖維素分解菌所得CBHI量的2倍或者與其一樣多[5]。其他人也曾報道過類似的情況。瑞氏木霉的一個或幾個纖維素酶基因經基因位定位置換整合而失活[6，7]。這些菌株提供了一系列令人感興趣的新酶混合物，即可用于工業生產，又可用于研究不同酶組分對各種纖維底物的分解作用。

但是，基因失活和基因置換的方法，可能不適用于需極高特異和必須去除非必需酶活力的酶制劑。這是因為用于酶生產的培養基，可能會誘導產生大量其它水解酶類。而要使編碼這些酶的基因都失活，在實際當中幾乎是不可能的。為了防止這類問題的產生，Goldman(1992)、Schindler（1993）Nakari(1995)等人先后報道從瑞氏木霉中分離了非纖維素酶基因的啟動子，包括pgk啟動子、pkiA啟動子、tefl啟動子和一個在葡萄糖培養基上強表達但未知的cDNA1的啟動子，這些啟動子可以在葡萄糖培養基上啟動合成所需要的纖維素酶，產生的酶制劑基本上沒有其它纖維素酶活力。在cDNA1啟動子控制下所合成的纖維二糖水解酶和內切葡聚酶產量最高可達50-100mg/L，占分泌蛋白總量50%以上[8]。1996年，Kurzatkowski等構建了能在葡萄糖培養基上生長的瑞氏木霉的重組菌株，其攜帶的木霉糖酶Ⅰ或木霉糖酶Ⅱ結構基因是在內源丙酮酸激酶基因（pkil）表達信號的控制之下表達。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫染色，發現這兩種類型的轉化體在葡萄糖培養基上生長時，能分別分泌出木霉糖酶Ⅰ和木霉糖酶Ⅱ。對于木霉糖酶來說，最好的轉化體產生的特異性酶活力為76U/mg；而對于木霉糖酶Ⅱ來說，則為145U/mg；都大大高出于自發菌株所產生的26U/mg[9]。

3 異源蛋白的生產

3.1真菌酶蛋白類

將Trichoderma harzianum P1染色體上的內切幾丁質酶基因分離，導入絲狀真菌瑞氏木霉，并在cbh1啟動子過量表達。出發菌株瑞氏木霉RutC-30不具有任何內切幾丁質酶活力。T·harzianum內切幾丁質酶基因編碼區前的區段的瑞氏木霉中能正確發揮功能。搖瓶培養產生130mg/L有活力的幾丁質酶，比T·harzianum產生的內切幾丁質酶活力提高大約20倍。瑞氏木霉RutC-30似乎能忍受內切幾丁質酶具有抗植物病原真菌的活力[10]，已被用于植物病源真菌的生物防治。另據B.Cubero等（1997）報道，在瑞氏木霉組成型啟動子ki和cbh2終止子的控制之下構建了兩種載體，分別含有T·harzianum的基因chit33和bgn16.2的開放閱讀框（chit33編碼一種內切幾丁質酶，bgn16.2編碼一種外切葡萄糖淀粉酶），并獲得了穩定的拷貝轉化體。對轉化體bng16.2來說，整合到基因組中的基因拷貝數與mRNA和蛋白質的積累量和在葡萄糖阻遏或幾丁質酶誘導條件下的胞外牧特性酶活力之間均呈正相關。該菌株比野生型菌株能更迅速地抑制病原真菌的生長。對轉化體chit33來說，在葡萄糖阻遏的條件下。對轉化體chit33來說，在葡萄糖阻遏的條件下，其產生的胞外幾丁質酶活力是野生菌株的10倍[11]。

Joutsjoki VV(1994)報道，構建了兩種一步基因置換載體。一種載體含有Hormoconis resinae葡萄糖淀粉酶P的基因組基因（gamP），另一種含有相應的cDNA，都在瑞氏木霉cbh1啟動子控制下表達。這些載體經轉化后置換瑞氏木霉的cbh1基因。在這兩種載體中，cbh1啟動子都能精確地連接到gamP蛋白質編碼區上游，指導瑞氏木霉分泌出有活力的葡萄糖淀粉酶P（GAMP）。這表明gamP基因中內含子序列在瑞氏木霉中得到了正確的加工。研究結果表明，含有gamP cDNA的最優轉化體能分泌大約700mg/L有活力的GAMP，是在H.resinae中產量的20倍[12]，但chb1基因被gamP基因組基因置換的瑞氏木霉轉化體，所分泌的有活性的GAMP要多于含有3拷貝cDNA的轉化體。對瑞氏木霉分泌H.nisresinae葡萄糖淀粉酶P的研究結果表明，自然狀態未成熟GAMP的N端延伸部分可以在瑞氏木霉中作為一種有效的分泌信號，所產生的胞外葡萄糖淀粉酶活力高于以CBHI信號肽作為分泌信號時的情況[13]。

酵母基因在瑞氏木霉中表達的一例是：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DPM1基因（編碼甘露糖基磷酸多萜醇合成酶）的編碼區插入到pLMRS3質粒中，在瑞氏木霉pki啟動子和cbh2終止子控制下表達。在pFG1質粒（含有瑞氏木霉pyr4基因）存在下，與pLMRS3質粒一起對瑞氏木霉的一種pyr4陰性突變株TU-6進行共轉化。然后篩選pyr4陽性轉化子，得到4株多拷貝DPM1基因串聯整合的穩定轉化子。與受體菌株TU-6相比，轉化子的甘露糖基磷酸多萜醇合成酶活力提高了15-19倍，分泌的蛋白總量也提高了4倍[14]。

除以上蛋白外，被表達的真菌蛋白還包括肌醇六磷酸酶等。這些酶都是在cbh1啟動子下表達，搖瓶培養產量達100mg/L水平。發酵培養中，產量為每升幾克。在cbh1啟動子的控制之下，來自擔子菌綱的真菌Phlebia radiate的氧化還原酶（如：漆酶）的產量也達到中等水平

3.2哺乳動物蛋白

瑞氏木霉已被用于牛凝乳蛋白酶的生產。利用cbh1啟動子和終止子，通過共轉化外源基因與來自構巢曲霉（Asp.nidulans）的amdS基因一起引入乙酰胺非利用型菌株。測量到的凝乳酶mRNA和分泌出的凝乳酶的量要比相應的cbh1 mRNA和CBHI的量低1-2個數量級。這表明牛凝乳蛋白酶在瑞氏木霉中的表達受到了轉錄限制。但是，所獲得的40mg/L的水平，與典型的在構巢曲霉素中的2-10mg/L的最初水平相比，還是一個可喜的進步[15，16]。

另外，據文獻報道，利用其它絲狀真菌生產的幾種人體蛋白是：表皮生長因子（hEGF），生產激素（hGH），白細胞介素6，組織血纖維蛋白溶酶原激活因子（htPA）等。

Fab分子是由抗體完整的輕鏈和重鏈的Fd部分，由鏈間二硫鏈連接在一起。這種分子曾由木霉成功地生產出來，并用于研究其分泌過程。利用cbh1啟動子和信號序列，分別構建了表達輕鏈和重鏈的表達盒。首先構建的是只產生輕鏈的菌株，然后用2種不同的重鏈表達載體進行再轉化。這兩種載體分別指導Fd鏈或者與CBHI核心-連接區融合在Fd鏈的表達。只產生輕鏈的菌株分泌的輕鏈水平很低（0.2mg/L）。對前一種重鏈載體的轉化體來說，在搖瓶培養中，分泌的有可能的Fab分子為1mg/L。在具有cbh1-Fd融合結構的轉化體菌株中，觀察到產量有顯著增長。最優菌株能分泌40mg/L具有免疫活力的CHBI-Fab融合蛋白。在發酵培養中，水平增長到150mg/L.然而，沒有融合到CBHI上的Fab分子，水平仍為1mg/L。有趣的是，一種未知的木霉蛋白酶在CBHI-Fab融合蛋白的N-端特異去除2個氨基酸，能產生少量的Fab分子。釋放的Fab分子表現出免疫活性和對抗原的親和性，而CBHI-Fab分子的免疫活性要低5-12倍。對分離到的抗體鏈進行定量測定表明，分泌出的所有輕鏈都和重鏈組裝在一起。CBHI-Fab產物的上清液中，含有顯著數量（800mg/L）的CBHI核心-連接區肽，它們來自CBHI-Fd融合分子。這樣，CBHI-Fd的產生是非常有效的（大于800mg/L），但其中只有少量（40mg/L）裝配成有功能的CBHI-Fab分子（或者，釋放的Fab分子）。這表明輕鏈的產生可能是限制性因素[17，18]。

4 總結

絲狀真菌瑞氏木霉已被成功地用于生產同源和異源蛋白。利用基因工程構建具新生狀的菌株，在蛋白類物質的生產方面已取得重要進展。其中，在提高絲狀真菌異原蛋白產量的過程中，基因融合的方法特別值得注意。典型作法是，將編碼有目的蛋白的基因融合到自然情況下分泌性良好的內源蛋白基因如葡萄糖淀粉酶、纖維二糖水解酶基因的下游。這種方法已在由Asp.awamori分泌牛凝乳蛋白酶（Ward等，1990），Asp.nidulans分泌白細胞介素6的過程中，被證明有效的（Contreras等，1991）。有趣的是，當外源蛋白整合到CBHI核心-連接區上時，產量能夠提高。在牛凝乳蛋白酶的例子中，產量提高3-5倍；就抗體片段而言，產量提高50多倍（Nyysonen等地993）。

由上可見，在瑞氏木霉中已發現出多種分子系統，采用不同的策略用于同源和異源蛋白的生產。為了提高產量，使用強表達和有效分泌纖維素酶CBHI基因的不同部分，已被證明是一種有效的方法。雖然在基因組的分區段也可獲得外源基因的有效表達，但cbh1啟動子很強，而且cbh1位點對于表達似乎也有益。將外源蛋白融合到CBHI的核心-連接區，能夠恢復對高水平表達起重要作用的區段，如：翻譯起始位點、信號肽序列及其作用位點。通過基因工程和發醇培養生產同源和異源蛋白，需要進一步地改進。對于不同的培養條件，包括含葡萄糖的培養基，應該發展出不同的生產策略，策略和技術的發展將會拓寬瑞氏木霉生產重組蛋白的范圍。由于瑞氏木霉在大規模生產條件中（高達360m2發酵液）的良好表現，所以它特別適于所需大量蛋白的生產[19]。遺憾的是，目前國內在這方面的研究尚未見報導。山東大學微生物技術國家重點實驗室正在開展對于瑞氏木霉的分子生物學研究，已克隆到瑞氏木霉進行菌株改造，通過基因定位置換整合，破壞其木糖醇脫氫酶基因，從而構建木糖醇生產菌。

隨著瑞氏木霉分子生物學研究的開展及基因工程的瑞氏木霉的應用，使我們構建多種具有良好商業潛力的菌株成為可能。我們相信利用木霉大量生產多種酶和藥用產品，將不斷被證明是行之有效的。

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分子生物學進展范文第4篇

關鍵詞：土壤微生物生態學；核酸探針雜交；梯度凝膠電泳；PCR

土壤中存在著極其豐富的微生物種類，它們在土壤生態系統中各自行使著獨特的功能。自1953年以來，分子生物學理論和技術取得了驚人的成就，許多分子生物學研究方法和理念被應用到微生物生態學研究中，為微生物生態學研究領域注入了新的活力，極大地推動了微生物分子生態學的發展。下面介紹近年主要的幾種研究方法：

一、標記核酸探針雜交技術

1.基本原理

以核酸分子雜交技術為核心，利用探針分析DNA序列及片段長度多態性。探針是能與特定核苷酸序列發生特異性互補的已知核酸片段，它可以是長探針（100～l000bp），可以是短核苷酸片段（10～50bp），也可以是從RNA制備DNA探針，斑點印跡和狹線印跡雜交等不同的方法。

2.應用

科學家應用核酸雜交方法研究了被燃油污染及不污染的土壤提取的細菌DNA，結果表明：被污染的土壤提取的細菌DNA中各種烴的降解基因的檢出率顯著高于不污染的樣品，且定量分析結果表明污染越嚴重，這種降解基因的含量越高，因而可以用該方法作為對土壤中燃油污染程度的評價。

3.原位熒光雜交技術

（1）基本原理。FISH是以熒光標記取代同位素標記的一種新的原位雜交方法。它檢測核苷酸序列是利用熒光標記的探針在細胞內與特異的互補核苷酸序列雜交，通過激發雜交探針的熒光來檢測信號。

（2）應用及其優缺點。可以進行樣品的原位雜交，應用于環境定微生物種群鑒定、種群數量分析及其特異微生物跟蹤檢測，現已成為微生物分子生態學研究中的熱點技術，在土壤微生物分子生態學領域應用廣泛。FISH技術的應用受到環境樣品微生物的生理狀態的影響，芽孢、放線菌及休眠時期的細胞的細胞膜的通透性低，影響群落中部分種屬豐度的錯誤估計。

二、基于PCR技術的研究方法

PCR是一種聚合酶鏈式反應技術，主要特點是短時間內在實驗室條件下人為地控制并特異擴增目的基因或DN段，使研究的目的基因及其環境樣品中的微量微生物基因得到無限的擴增，為這些基因和微量微生物種群的研究提供了保證。

1.PCR-RFLP方法

（1）原理。PCR-RFLP法是將PCR引物中的一條加以熒光標記，其基本原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。

（2）應用。現在很多研究人員利用16SrRNA來研究土壤微生物的多樣性。該技術還可以用來監測因環境改變而引起的微生物種群的變化。

2.PCR-SSCP方法

（1）原理。日本Orita等研究發現，單鏈DN段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要是由其內部堿基配對等分子內相互作用力來維持的。當有一個堿基發生改變時，會或多或少地影響其空間構象，使構象發生改變。空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子分離開。

（2）應用。Sabine Peters等人用該法研究群落的演替和菌種的多樣性，并同傳統的培養方法比較指出PCR-SSCP方法避免了傳統培養的費時費力以及誤差大的干擾，適合對微生物群落結構和演替的分析。

三、DNA擴增片段梯度電泳檢測技術

1.變性梯度凝膠電泳

（1）基本原理。雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。DGGE技術在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DN段區分開來。

（2）應用。DGGE方法是應用最早也是最常用的單堿基突變篩查方法之一，自從1993年DGGE被引入微生物學以來，該技術被廣泛地用作分子工具比較微生物群落的多樣性以及監視種群動態。PCR-DGGE用于分析華盛頓州東部4種土壤細菌群落結構和多樣性，結果表明：管理和農學實踐對細菌群落結構的影響比年降水量更大。

2.溫度梯度凝膠電泳

（1）基本原理。溫度梯度凝膠電泳技術則是利用溫度梯度變性的原理，利用了不同分子在溫度改變下構象的差別進行分離。

分子生物學進展范文第5篇

關鍵詞：藥學分子生物學；生物學技術；課堂教學；教學方法

藥學分子生物學是在藥學、遺傳學和生物化學等學科的基礎上發展融合形成的新學科；它是將分子生物學的新理論、新技術滲入藥學研究領域，從而使藥物學研究由化學、藥學的培養模式轉化成為生命科學、藥學和化學相結合的新藥模式；同時它還是當代生物科學發展的引擎，是現代生物技術的基石。[1]近年來隨著分子生物技術的發展，它的應用領域也在不斷拓寬，它與醫學和藥學方面的交叉也越來越多，因此，分子生物學在今后已經不再只是生物技術專業的必修課，它也成為藥學院學生的重要必修的基礎課之一。

分子生物學主要是從分子水平上闡述生命現象和本質的科學，是現代生命科學的“共同語言”。分子生物學技術把研究技術提高到了基因分子水平，可應用于遺傳性疾病的研究和病原體的檢測及腫瘤的病因學、發病學、診斷和治療，新藥開發等方面的研究。所以，常用分子生物學技術是現代分子生物學研究的重要核心內容之一。掌握了常用分子生物學技術，并能將理論和實際操作結合，也就相當于掌握了一把從微觀世界揭示生物學奧秘的鑰匙。經過多年教學，筆者將對此章節的教學體會總結如下。

一、介紹本學科最新前沿動態，提高學生興趣

分子生物學是一門發展快速的前沿學科，由其發展帶來的成果和研究進展日新月異。由于教材跟不上分子生物學發展速度，在授課時我們及時將最新的分子生物學進展補充到教學內容之中。以基因敲除技術為例，教材主要介紹傳統第一代同源重組方法，這種方法是經典基因敲除方法，但效率低（1 per 106 cells），實驗周期長，可以說基本被淘汰的方法。隨后又出現了鋅指核酸酶（ZFN）[2]、TALEN、CRISPR/Cas9等方法。尤其是2012年出現最新CRISPR/Cas9方法，以能夠實現任意敲除、成功率高、打靶效率很高、脫靶率高、周期非常快等優點著稱。這種方法構建的基因突變動物具有顯著高于傳統方法的生殖系轉移能力，是一種高效、快速、可靠的構建敲除動物模型的新方法，所以在動物模型構建的應用前景將非常廣闊。

將這些最新的分子生物學科學進展補充到教學內容之中，一方面可以提高學生學習興趣，另一方面使學生了解本學科最近發展動態，從動態中學習，而非死記硬背書本內容，有助于大學生的能力和素質培養。

二、注重融會貫通，重點突出，便于學生掌握重難點

以分子雜交技術為例，該技術可分為核酸分子雜交、蛋白質分子雜交、原位雜交、生物芯片等，所涉及的概念、原理、方法操作較多。如何將這些紛繁復雜的內容在一次理論教學中完成，我們進行了深入的思考和探索，在授課時注意淡化概念，注重聯系實際和實驗操作，使學生對整體分子雜交技術有感性的、總體上的認識，然后記憶各個方法概念、知識點，這樣使各個知識點不是孤立存在，而是統一形成網絡，使學生學到的不是一個個孤立的知識點。將分子雜交技術與前面學到的基因、復制、轉錄、翻譯銜接緊密，介紹每種方法應用及其臨床意義，在教學中注意融會貫通和啟發式教學。以核酸分子雜交為例，核酸分子雜交又可分為Southern印跡和Northern 印跡，通過啟發式教學方法，學生通過短暫的回憶和思考，使思維進入到“基因復制和轉錄”的空間中，再介紹兩種方法的原理和應用范圍，從而學生能很好理解Southern印跡主要應用于DNA檢測，而Northern 印跡用于分析mRNA的轉錄或mRNA分子大小，此時再進行講授每種方法的操作流程，突出重點，便于學生掌握重難點，會取得更好的效果。

三、應用多媒體教學，對學生進行啟發式教學

多媒體資源已經廣泛應用于教學中，它可以使課堂教學內容生動活潑、豐富多彩，并徹底改變傳統的教學模式和學生的認知過程。俗話說好鋼要用在刀刃上。多媒體在教學中的應用也是同樣需要用在“刀刃上”，這樣才能發揮其關鍵的作用。教學的“刀刃上”是指教學中的重難點以及銜接點、導入點、啟發點、思維盲點等，所以只有處理好這些關鍵點，才能上好這門課程。筆者通過網上查閱資料、Flash 動畫和自制彩色圖片等方式，使復雜的分子生物學操作流程變得形象直觀、易記憶和理解，初步取得了較好的教學效果。每節課程結束前還進行小結，將重難點內容和圖片回放，并提出思考題讓學生思考，這樣既有助于理解和掌握本節課的內容，又可排除學生對新知識的畏難和對學習的抵觸情緒，逐步養成起學生對分子生物學學習的興趣和信心。另外，每節課程結束后還進行習題講解和課后答疑，利用QQ或郵件等手段與學生交流和互動解答問題，這樣可及時鞏固課堂知識和建立師生之間互信。因此，將多媒體應用于教學中，可以使授課過程更加豐富多彩和靈活多樣，同時可使課堂教學更具有創新性。

四、將自身科研經驗運用到教學中，讓教學內容更豐富多彩

作為高校教師，我們在承擔教學任務的同時還從事一些科研工作，科研工作是將自己所學理論知識運用于實踐。在教學過程中，為了豐富教學內容，筆者將自己的科研成果和經驗穿插于教學中，這樣從實際出發可以使授課效果更生動、具體和形象，讓學生更容易理解并加深印象。這種教學方式既可幫助學生更容易理解本課程內容，并且還可將抽象的書本知識具體形象化，還開拓了學生的視野，激發學生學習興趣和動力，使其不再認為科學遙不可及。另外，利用課堂時間向學生介紹常用的科學文獻檢索方法和常用網址，讓學生在課余時間可以通過這些方式攝取相關知識，了解本學科最新研究動態，擴展視野，逐步培養學生自發地閱讀國內外文獻，增強對科學研究的興趣，為以后研究生的學習打下基礎。

總之，針對常用分子生物學技術這章內容在藥學分子生物學的重要性，以及其內容的抽象性和復雜性的特點，我們通過不斷地實踐和探索，建立了高效的教學方法，并得到學生廣泛的好評。

參考文獻：

[1]蘇 嬌.藥學分子生物學教學語言藝術的探索[J].吉林醫學，2010，31（21）.