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上皮細胞范文第1篇

放射性口干癥是頭頸癌放療的常見并發癥，可導致唾液腺分泌功能的減弱或喪失，引起口干、繼發齲、長期慢性黏膜炎癥、吞咽困難以及營養不良等癥狀［1］。本課題采用雙室共培養系統，將人羊膜上皮細胞(humanamnioticepithelialcells，hAECs)與SD大鼠下頜下腺腺泡細胞(submandibularglandacinarcells，SMGCs)進行體外共培養，研究hAECs的誘導分化，為唾液腺功能障礙性疾病的干細胞治療尋找細胞來源。

1材料和方法

1．1材料無菌采集經產婦本人知情同意的健康足月剖宮產胎盤;8d齡SD大鼠;DMEM/F12培養基、LG-DMEM培養基、胎牛血清(FBS)(Gibco，美國)，表皮生長因子(EGF)，Transwell(CorningInc，catNO．3450)，小鼠抗大鼠角蛋白單克隆抗體(keratin19Ab-1)(NeoMark-ers)，小鼠抗人CK19單克隆抗體(GeneTech，China)，小鼠抗人淀粉酶單克隆抗體(Amylase-G10)(SantaCruz，USA)，兩步法抗小鼠或兔通用型免疫組化試劑盒(DakoCytomation)，TotalRNA提取試劑盒、SYBRPrimesciptRT-PCRKit(寶生物工程有限公司)。

1．2SD大鼠下頜下腺細胞的分離、培養［2－4］、鑒定取8d齡SD大鼠原代培養SMGCs，常規傳代、鑒定。取第2代生長狀態良好的SMGCs用于下一步共培養實驗。

1．3人羊膜上皮細胞的分離、培養［5－6］、鑒定機械法剝離胎盤上的羊膜組織，清除表面的血跡，0．05%的胰蛋白酶－0．02%EDTA-2Na37℃消化3次，每次30min。加血清終止胰酶反應，合并3次收集的細胞懸液篩網(200目)過濾后低速離心，棄上清，收獲細胞沉淀即為hAECs。上述分離的hAECs加入培養基(LG-DMEM，10%FBS，2mmol/LL-谷氨酰胺，10ng/mlEGF，100U/ml青霉素，0．1mg/ml鏈霉素)，按5×105/cm2的細胞密度接種，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，及時傳代。免疫熒光法檢測后取第2代狀態良好的hAECs用于下一步共培養實驗。

1．4人羊膜上皮細胞與大鼠下頜下腺細胞的共培養選用微孔膜孔徑為0．4μm的6孔Transwell培養板(圖1)，每板4孔為實驗組，其余2孔為對照組。首先將第2代的hAECs以2×104/孔接種于Transwell下層，貼壁24h后，將SMGCs以8×104/孔接種于Tran-swell上層的生物膜上，共培養采用腺細胞專用培養基(DMEM/F12，10%FBS，2mmol/L-谷氨酰胺，10ng/mlEGF，100U/ml青霉素，0．1mg/ml鏈霉素)。對照組上下2層均為hAECs。上下2種細胞間不能接觸，但共用培養基，分泌的細胞因子可相互影響。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，每隔3d換液1次。

1．5共培養系統的評價

1．5．1共培養前后的形態學觀察共培養開始后，于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化。

1．5．2免疫細胞化學檢測分別于共培養后1、2周，按照試劑盒說明書進行各組細胞的抗淀粉酶免疫細胞化學檢測。

1．5．3實時熒光定量RT-PCR檢測按試劑盒說明書提取共培養1、2周的人羊膜上皮細胞總RNA。按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。α-淀粉酶引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成，上游引物:5＇-CATAAGGATGAGCAAGCATAAATC-3＇，下游引物:5＇-TCGCAAGTGGAATGGAGAG-3＇，擴增產物大小203bp;內參GAPDH的引物序列由TaKaRa生物公司設計合成，上游引物:5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇，下游引物:5＇-TGGTGAAGACGCCAGTGG-3＇，擴增產物大小138bp。反應體系如下:SYBRPremixExTaqTM(2×)10μl，上游引物F(10μmol/L)1μl，下游引物R(10μmol/L)1μl，cDNA2μl，ddH2O6μl。反應條件為:95℃10s預變性，然后95℃5s，60．2℃20s重復40個循環，55℃10s84個循環。反應結束儀器自動生成CT值及熔解曲線圖。每個樣本設4個重復管。將PCR產物作熔解曲線分析，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定產物特異性。

1．6統計學處理使用SPSS13．0軟件，采用單因素方差分析，數據用x珋±s表示，P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1SD大鼠下頜下腺細胞的鑒定

2．1．1SD大鼠下頜下腺細胞形態學特征原代培養第5天可見組織塊周圍有典型的上皮細胞游出，第8天細胞較多，顯微鏡下觀察呈圓形或橢圓形，鵝卵石樣排列(圖2A)。

2．1．2SD大鼠下頜下腺細胞免疫學表型免疫細胞化學結果顯示，第2代SD大鼠SMGCs表達CK19(圖2B)、α-淀粉酶(圖2C)，不表達波形蛋白。

2．2人羊膜上皮細胞的鑒定

2．2．1人羊膜上皮細胞形態學特征hAECs原代培養48h后，有少量細胞貼壁，第3天以后貼壁細胞數量迅速增多，形態多為卵圓形和三角形，傳代培養的hAECs形態變化不大，呈鋪路石樣排列(圖3A)。

2．2．2人羊膜上皮細胞免疫學表型免疫熒光染色結果顯示，第2代的hAECs表達CK19(圖3B)，不表達波形蛋白(圖3C)，對照組結果陰性。

2．3共培養系統的評價

2．3．1共培養后的人羊膜上皮細胞形態學特征共培養后顯微鏡下觀察顯示hAECs胞質中分泌顆粒逐漸增多，而對照組未見明顯變化(圖4)。

2．3．2共培養前后人羊膜上皮細胞α-淀粉酶表達免疫細胞化學結果顯示，共培養前后hAECs均表達α-淀粉酶，共培養后胞質中α-淀粉酶陽性信號表達增強(圖5A、B)，對照組未見明顯變化，用PBS替代一抗的對照組未見陽性信號(圖5C)。2．3．3共培養前后hAECs中α-淀粉酶mRNA表達量共培養前后hAECs中α-淀粉酶基因和內參基因GAPDH的mRNA表達均以CT值表示，各組α-淀粉酶基因的mRNA相對表達量為2^-CT。單因素方差分析結果顯示:共培養1、2周后hAECs中α-淀粉酶mRNA相對表達量均高于共培養前，其表達量分別增加至共培養前的3．38倍、6．60倍(P＜0．05)(圖6)。

上皮細胞范文第2篇

近年來研究發現，晶狀體上皮細胞（LEC）凋亡在白內障的發生中具有重要的作用，并發現多種基因參與調控LEC凋亡。本文總結了該方面的研究進展，希望為研究白內障形成機制和防治方法提供新的依據和參考。

1 LEC凋亡的形態學特點

細胞凋亡（apotosis）或稱程序性細胞死亡（pragrammed cell death，PCD），是受基因控制的一種主動性細胞自殺過程，是生物體中一種普遍存在的現象。Li[1，2]等用透射電鏡觀察正常及白內障患者晶狀體上皮細胞超微結構時發現：正常晶狀體上皮細胞形態規則，細胞膜結構清晰，相鄰細胞及晶狀體囊皮細胞結合緊密，細胞質及染色質均勻無凝縮。白內障患者晶狀體上皮細胞可見凋亡細胞。這些凋亡細胞與相鄰細胞及晶狀體囊膜疏松結合，細胞外形不規則、扭曲，進而微絨毛消失，以出芽的方式形成有膜包被的凋亡小體。從而提出了LEC凋亡是除先天性白內障以外的所有類型白內障形成的細胞學基礎。Michael等[3]用紫外線照射活體鼠24 h后用透射電鏡觀察鼠LEC，發現部分上皮細胞形成特征性膜胞質小體即凋亡小體。說明LEC的凋亡參與了輻射性白內障的形成。

2 LEC凋亡的生物化學特征

1980年，Wyllie首次報道小鼠胸腺細胞發生凋亡時其DNA瓊脂糖凝膠電泳呈現特征性“梯狀”條帶(ladder)，這一現象成為PCD的典型特征。Takamura等[4]用DN段分析的方法對白內障LEC凋亡進行研究中亦發現了“梯狀”條帶。Marian等[5]通過實驗證實晶狀體上皮細胞的凋亡在白內障的形成之中是通過Ca2+途徑激活的。Malina等[6]用黃尿酸誘導體外培養的人LEC發生凋亡時，發現凋亡細胞離Ca2+濃度升高，并隨著黃尿酸濃度的升高，細胞內游離Ca2+的濃度也升高。Ghafourifar等[7]研究表明，線粒體內部存在依賴Ca2+的NO合酶(NOS)，線粒體吸收Ca2+后激活NOS，線粒體膜發生脂質過氧化(LOP)，細胞色素C釋放，誘導細胞凋亡。

3 LEC凋亡的基因調控

研究發現目前有20余種基因與PCD有關，按基因表達產物對凋亡過程的作用分為2類：（1）促進凋亡的基因，如c-myc、p53、c-Jun、c-fos和Bcl-xs等；（2）抑制細胞凋亡的基因，如bcl-2、bc1-xl、Mc1和MyD16等。但關于PCD的確切機制尚不十分清楚。

3.1 bcl-2：bcl-2是一個家族基因，bcl-2、bcl-xl和bax是該家族的重要成員，它們主要通過線粒體途徑參與凋亡調控，當細胞受到死亡信號刺激，與Bcl-2或Bcl-xl蛋白相結合的Bax蛋白就會被置換出來，線粒體膜通透性增加，釋放出一系列物質，最終導致細胞死亡。Bcl-2在正常晶狀體上皮細胞和老年白內障晶狀體上皮細胞均不表達。Tsujimoto等[8]研究發現轉染bcl-2基因可抑制化療藥物、加熱、放射性c-myc或p53基因等多種因素誘導的多種細胞的凋亡延長細胞生存的時間。Schwartz 等[9]認為bcl-2是一種抗氧化劑，能抑制過氧化物誘導的凋亡。Mao YW[10]等實驗結果顯示：bcl-2能調節兔晶狀體上皮細胞表達，通過下調β晶狀體蛋白基因bcl-2，減弱由H2O2誘導的兔晶狀體上皮細胞對凋亡的抵抗力。

3.2 Bax：為編碼bcl-2相關蛋白x的基因，其與bcl-2功能剛好相反，促進細胞凋亡。bax與bcl-2在同一細胞共同表達時，bax可拮抗bcl-2的凋亡作用。Li等[11]在研究多聚醚脂肪酸誘導兔LEC凋亡時，發現多聚醚脂肪酸通過抑制蛋白磷酸酶-1使兔LEC快速凋亡，同時bax的mRNA和蛋白水平升高，表明bax表達水平的升高在凋亡過程中發揮了重要的作用。

3.3 P53：P53是一種典型的抑癌基因，是目前發現的與人類腫瘤相關性最高的基因，編碼的蛋白位于細胞核內，對細胞生長起負調節作用，能促進PCD。p53分為野生型和突變型2種，野生型p53對PCD具有激發作用，而突變型p53則有抑制PCD的作用。李桂榮等[12]發現在老年白內障組LEC中p53基因和蛋白表達均高于正常組，說明p53基因促進了LEC的凋亡，導致了晶狀體混濁。

3.4 c-myc基因：c-myc基因是一種癌基因，具有潛在的抑制PCD的作用。它主要參與轉錄，而在轉錄過程中可以是激活啟動而誘導細胞周期進程和分化，也可以是抑制啟動而導致阻止細胞分化或程序死亡，因此它既是激活子又是抑制子。這種取決于在有足夠的促進增殖因子存在時，c-myc促進癌細胞增殖，當某些生長因子缺乏和有抑癌因子存在時，則可誘導細胞凋亡[13]。Hann SR等[14]發現半乳糖白內障早期有c-myc基因的高表達，說明在白內障發生過程中也存在有“快速早期反應”核因子的變化，白內障后期c-myc基因的蛋白表達水平可恢復正常。林宏華等[15]的研究發現，LEC中c-myc水平在半乳糖誘導第七天和十四天均高于對照組，盡管第二十四天接近正常水平，但LEC凋亡率卻很高。可見c-myc基因參與了LEC的凋亡過程，導致晶狀體混濁的發生。

3.5 Fas/FasL：屬于TNF受體，神經生長因子受體及其配體超家族中的成員，Fas是I型膜蛋白，胞漿區一段約80個氨基酸序列與TNF-R1同源，介導細胞死亡，稱為死亡區。FasL為Ⅱ型膜蛋白，它是Fas的天然配體。Fas通過和FasL結合而介導表達Fas的細胞發生凋亡，Fas/FasL系統所誘導的細胞凋亡機制在機體與腫瘤細胞對抗中具有重要的生物學意義[16]。Okamura等[17]比較了年齡相關性白內障和糖尿病性白內障LEC的免疫組化及RT-PCR表明有增殖性視網膜病變的白內障組Fas及其mRNA的表達明顯增高。認為PCD在合并有增殖性視網膜病變的白內障組可能是通過Fas途徑介導的。

3.6 c-fos及c-jun基因：c-fos在人類染色體上定位于14q。c-fos和jun蛋白系列形成一聚體構成轉錄因子復合物AP-1。c-fos作為AP-1的成分，是參與細胞分裂、分化以及轉化的一種重要分子。Wenzel A等[18]研究認為，在細胞內外環境的改變或某些誘導劑的作用下，某些細胞發生凋亡的同時存在c-fos表達的增加或過度表達。即c-fos基因可啟動PCD。目前認為c-jun基因主要通過蛋白激酶C傳導通路對PCD進行調控與白內障的發生有密切的關系。Li等發現在H2O2誘導的大鼠白內障中，c-fos及c-jun都有mRNA水平的表達增強。Tempestini A等[19]發現由于氧化損傷、紫外線照射、鈣離子等作用，觸發了c-fos及c-jun細胞凋亡機制，使LECs的結構和功能通過凋亡受損。引起成纖維細胞中鈣離子聚集，并隨之發生一系列生化改變。如激活蛋白水解酶Calpainl和CalpainII，細胞骨架和晶狀體蛋白變性，大分子聚集，形成白內障。國內亦有報道[20]c-fos、c-jun與LECs凋亡之間呈一定相關性，尤以c-fos表達與凋亡細胞的相關性最強。

白內障發病機制十分復雜，目前臨床上尚無切實有效的預防藥物。從PCD角度進一步研究白內障的發病機制，進而通過藥物抑制LECs凋亡以防治白內障是眼科工作者面臨的新課題。隨著細胞生物學和分子生物學的發展，凋亡的基因調控機制將會得到進一步揭示，有望通過促進凋亡抑制基因的表達、抑制激活基因的表達，或通過抑制凋亡誘導物和阻抑其活性物的形式而達到治療目的，同時對于后發白內障的研究方面亦具有重要的參考價值。

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上皮細胞范文第3篇

食管疾病的發生已成為危害人類健康的重要因素，每年有大量的患者需進行手術治療。而手術治療的主要方式多是切除食管或用自身的其他組織器官進行重建。其缺點是手術創傷大，操作復雜，術后并發癥多。因此組織工程食管日益顯現出其存在的必要性。組織工程食管的基本原理是將體外培養和擴增所得的自體細胞，種植在組織相容性好的可降解支架上，進行共同培養，再植入體內相應位置，逐步形成在結構功能上與自體組織相似的人工食管，但干細胞必須分化為上皮細胞才有價值。細胞的分化方向與微環境“壁龕”密切相關［1］。微環境包括細胞因子、細胞外基質、生理激素、離子濃度、O2濃度等。本文就微環境對組織工程中食管上皮細胞增殖分化的影響作一簡要綜述。

1 細胞因子的影響

1.1 血管內皮細胞生長因子 血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）是一種分子量為40～45 kD的分泌性糖蛋白，編碼人類VEGF的基因位于染色體6p21.3上，該基因全長24 kb。體外實驗發現其對血管內皮的增殖，血管構建的作用較強，且特異性高，VEGF還可以增加血管內皮細胞的通透性［2］。VEGF發揮作用主要依賴其受體的存在。其中VEGFR1和VEGFR2是血管內皮細胞的特異性酪氨酸激酶蛋白受體，而VEGFR3主要在淋巴管內皮細胞中表達［3］。由此可見，VEGF在干細胞向食管上皮誘導分化過程中有一定的意義。首先，VEGF可以促進組織工程食管中微血管的生成，并增加其通透性；其次，促進淋巴管的形成。以上兩者的作用，創造出更接近于人體食管的微環境，有利于食管上皮細胞的增殖分化。

1.2 表皮生長因子 表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）是一種廣泛存在于各種組織體液中的53個氨基酸組成的促有絲分裂的多肽，可促進多種細胞增殖，包括上皮細胞、間質細胞及神經干細胞等［4］。EGF在體外可刺激角化細胞分裂，在體內可促進上皮的再生［5］。許多文獻報道，干細胞向食管上皮分化中出現分化消失現象，原因可能與培養基血清中的轉移生長因子β（TGF-β）等因子抑制上皮細胞生長，但刺激成纖維細胞生長有關［6］。成纖維細胞的大量產生有有利的一面，也可以消耗培養基中大量營養物質，從而抑制上皮細胞生長。劉洪清等［7］采用添加EGF等細胞因子的方法，有效地促進食管上皮細胞增殖和傳代，有效抑制成纖維細胞生長。EGF與靶細胞表面的EGF受體結合后，能刺激受體自身磷酸化及細胞內其它蛋白質的酪氨酸磷酸化，進而激活蛋白激酶C和磷脂酶C，通過第二信使CAMP、Ca2+激活CAMP依賴的蛋白酶，使細胞核內組蛋白對DNA的阻遏作用解除，促使有絲分裂信號向細胞內傳遞，從而引起DNA合成細胞增殖［8］。但不同濃度的EGF對BMSC促分化和促增殖的影響作用不同，其機理有待進一步研究。

1.3 轉移生長因子β 轉移生長因子β（ transforming growth factor-β，TGF-β）是一類多功能的細胞因子，參與多種細胞功能的調節，包括細胞增殖、分化、遷移，細胞外基質生成等。在干細胞向食管上皮分的過程中，TGF-β1的突出作用是促使各種細胞外基質（extra cellular matrixc，ECM），如膠原蛋白、連接蛋白（fibronectin，FN）、層黏蛋白（laminin，LN）和蛋白多糖的合成，抑制這些蛋白的降解，從而增加ECM的沉積［9］。TGF-β通過與細胞跨膜蛋白受體結合發揮其生物作用，其跨膜蛋白受體有三種亞型TGF-β RAⅠ、RⅡ、RⅢ。RI、RII有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性，RⅢ可促進TGF-β與RI、RII結合［10］。TGF-β1另一重要作用是刺激成纖維上皮細胞的生長，但其機制說法尚不統一。被TGF-β1刺激增生的成纖維細胞能促進食管上皮細胞增殖分化，有報道證實食管上皮細胞分層程度與加入成纖維細胞密度成正比［11］。

1.4 胰島素樣生長因子-1 胰島素樣生長因子-1 （Insulin-like growth factor1，IGF-1）是一個重要的細胞增殖因子。在細胞周期中，一旦細胞進入G1期，在其他生長因子缺乏的情況下，IGF-1可促進C增殖周期的完成［12］。IGF-1的活性主要是由胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）介導的，即IGF-1R很大程度上與細胞增殖狀況有關［13］。它的這種作用，在組織工程食管上皮細胞分化增殖中十分重要。組織工程食管上皮在體外培養時，必然存在與體內微環境的不同之處，缺乏某些細胞因子，IGF-1上述特點正好彌補了此種不足，值得關注的是IGF-1刺激細胞增生抑制凋亡，又是致食管癌的發生的重要因素。IGF-1活性主要由胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBPs）來調控，故對IGFBPs的研究也值得進一步深入研究。

1.5 堿性成纖維細胞生長因子 堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，BFGF）,有研究表明,體積大于1 mm3的組織就需要血液供應。組織工程中食管上皮細胞體積巨大，需要充足的血供，BFGF表達與食管中微血管密度有關。BFGF是一種堿性多肽，在體內廣泛分布，是血管內皮細胞的有絲分裂素，它在體內可趨化血管內膜的各類細胞，并誘導這些細胞表達組織重建所需的血漿酶原激活劑等，通過刺激內膜各類細胞的增殖和遷移，誘導血管內皮細胞長入膠原基質中形成管腔，并促進神經元與新生血管的生長［14］。BFGF在促進神經元生成的作用，為研究組織工程食管神經的重建提供了新的思路與著手點。

2 細胞外基質的影響

在組織工程食管中，高分了聚合材料結構和成分單一，不能同時提供食管上皮細胞生長的ECM。而種子細胞與ECM的黏附及相互作用是細胞分化增殖的基礎。故對ECM的研究，對組織工程食管上皮細胞分化增殖有重要意義。

2.1 膠原蛋白 研究發現Ⅰ型膠原主要存在于食管的黏膜下層及肌層內，Ⅲ型膠原主要存在于食管的外膜彈力纖維層和黏膜下［15］。具有良好的生物相容性，極低的免疫原性，極強的促組織再生性［16］。鮑春榮等［10］用Ⅳ型膠原預涂材料表面，可有效地促進食管上皮細胞與支架的吸附和均勻分布。但在食管中各型膠原蛋白的比例關系及各型膠原如何特異性作用于食管的特定部位，還有待研究。

2.2 纖維連接蛋白 纖維連接蛋白（FN）是一組結構上類似、免疫源性相同的高分子糖蛋白，是體內重要的細胞外基質成份。它具有維持細胞正常形態參與細胞與細胞，細胞與基質間的粘連，促細胞生長，分化和增殖，調節細胞運動等功能，在正常食管上皮有表達［17］。在組織上工程食管上皮細胞誘導過程中，利用其具有細胞間或細胞與其他細胞外基質間的橋蛋白作用，促進食管上皮細胞的粘附，構成其它增殖，分化的基礎。梁志剛等成功應用轉染Ad.FnCBD64的食管上皮細胞體外構建組織工程食管。證明了FN具有增強種子細胞黏附力的效果。但FN分子量大，在實際的使用中存在轉染種子細胞的困難，有待于尋找促進FN表達的實用性方法。

2.3 縫隙連接蛋白（Cx43） 縫隙連接蛋白（Connexins，Cx）的縫隙連接普遍存在于上皮細胞間，縫隙連接蛋白CX43表達與胚胎發育，細胞誘導，分化，生長調控有關［18］。劉學紅等［19］通過實驗證實，2～4個月CX43蛋白呈陽性或強陽性表達，4個月后呈弱陽性表達，推測在食管神經系統及微循環系統未完善時期，Cx43通過參與細胞間縫隙連接調控信息轉導及細胞的分化、增殖。在組織工程食管上皮細胞的培養中，誘導種子細胞向食管上皮細胞分化，利用Cx43特性促進分化增殖國內外尚無報道。筆者認為有待從實驗中得到求證。

3 性激素

從食管癌發生的性別差異，不難發現性激素可能參與了上皮細胞的增殖分化，但不論雌雄激素，發揮生理作用均與其受體密切相關，雌激素（ER）在胎兒食管正常食管上皮兩者間出現到消失的規律。有學者認為最好的解釋是ER參與了食管上皮細胞的增殖分化。ER的作用機制為雌激素彌漫入細胞后，先與靶細胞漿異性受體結合，形成激素受體復合物，復合物進入細胞核內，加上共激活因子的作用與核內受體形成單二聚體，影響DNA轉錄生成新的mRNA，從而生成新的蛋白質，影響細胞生理功能，雄激素（AR）作用機制與ER相似。但在性激素影響下產生了何種蛋白質影響了生物學功能尚不清楚，且人體內雌雄激素間存在復雜的相互影響，不同性別個體間雌、雄激素迥然不同，所以性激素對組織工程食管上細胞的分化影響還有待進一步研究。

4 Ca2+濃度及O2濃度的影響

4.1 Ca2+濃度與食管上皮細胞的增殖、分化密切相關 Ca2+濃度低于0.05 mmol/L時食管上皮細胞缺少橋粒，當Ca2+濃度大于等于0.05 mmol/L時角蛋白絲增加，橋粒出現。其機制可能為Ca2+充當第二信使激活CAMP依賴的蛋白激酶使細胞核內組蛋白對DNA的組合解除，促使有絲分裂信號向細胞內傳遞引起DNA合成，細胞增殖，并且整合素等粘附分子發揮作用也需要Ca2+的存在。

4.2 O2濃度的影響 O2濃度為微環境對組織工程食管上皮細胞分化的影響報道不一，有學者用CoCl2誘導缺氧條件，發現隨缺氧時間延長，處于G0/G1期的細胞明顯增加，S期減少，由此認為，缺氧對細胞周期進行負調控［20］。另一部分學者認為供氧不足，缺氧信號迅速傳至細胞核內啟動相關基因表達，以維持細胞和機體氧平衡，在這一過程中引起細胞的增殖分化，其中缺氧誘導因子-1（HIF-1）是影響調控的最主要因子。組織工程食管種子細胞在體外誘導分化過程中，O2濃度必然高于正常處于體內的細胞，高O2濃度的影響是有利于細胞增殖分化，還是不利于細胞增殖分化，有待于進一步研究。

今后，組織工程食管的研究，應深入研究微環境如何影響種子細胞向食管上皮細胞增生、分化，如何在體外模擬體內的微環境。在不久的未來，組織工程食管必將應用于臨床，給更多的患者減少病痛。

參 考 文 獻

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上皮細胞范文第4篇

【摘要】 目的 模擬缺血/再灌注誘導人離體的胃黏膜上皮細胞損傷模型，觀察再灌注不同時間點胃黏膜上皮細胞凋亡情況并分析其規律。方法 采用人胃黏膜上皮細胞株進行體外培養并傳代，細胞以缺氧(5% CO2、1% O2、94% N2)+無糖KR液模擬缺血、缺氧，復氧、復糖模擬再灌注誘導胃黏膜上皮細胞凋亡，用流式細胞儀、Hoechst33258染色法觀察正常對照組及模擬損傷組于模擬缺血1 h，再灌注3、6、12 h細胞凋亡的情況及變化規律。結果 ①胃黏膜上皮細胞12～24 h貼壁，24 h后有少量上皮樣細胞從周邊爬出，48 h后細胞呈指數樣生長，72 h后細胞已基本能達到融合。②模擬胃缺血/再灌注后細胞凋亡率于缺血1 h、再灌注6 h時出現高峰，且與正常對照組相比差異有統計學意義(P

【關鍵詞】 胃缺血/再灌注;胃黏膜上皮細胞;細胞凋亡;細胞培養

Abstract: Objective To simulate the ischemia/reperfusion-induced injury to the epithelial cells of gastric mucosa and to investigate the cellular apoptosis at different time points in order to explore its regularity.Methods Human gastric epithelial cell line was cultured and subculture in vitro. The cells were subjected to hypoxia (5% CO2， 1% O2 and 94% N2) + glucose-free KR bicarbonate buffer and succedent reperfusion (5%CO2 and 95% air) in DMEM/F12 to simulate conditions of ischemia and hypoxia， reoxygenation and glucose reintroduction. The morphological changes and the percentage of apoptotic cells were evaluated by Hoechast33258 staining， flow cytometry (FCM) at reperfusive 3， 6 and 12 h secondary to 1 h simulated ischemia culture.Results ①Observation under the inverted microscope revealed the gastric mucosa epithelial cell adherence after 12 to 24 h; and at 24th h， there was outgrowth of epithelial cells; at 48th h the cells were in exponential growth; and at 72nd h the cultured cells reached nearly confluence， displaying the typical cobblestone appearance. ②FCM analysis revealed that the percentage of cell apoptosis peaked at simulated ischemic 1 h and reperfusive 6 h， with significant difference (P

Key words：gastric ischemia-reperfusion; gastric mucosa epithelial cell; cell apoptosis; cell culture

胃缺血/再灌注(gastric ischemia-reperfusion， GI/R)損傷是一種常見的臨床病理生理過程，臨床發生多器官障礙綜合征時，由于血液的重分布造成的胃腸黏膜缺血出現的最早最明顯，遠比其他臟器更易發生缺血-再灌注損傷，因此，胃被認為是機體內最早受累的器官[1-2]。胃黏膜雖易損傷，但其修復快，它是機體內自身代謝最快的組織之一，這表明胃黏膜細胞可能具有較強的抗凋亡調控機制和增殖修復能力。深入研究GI-R的胃黏膜上皮細胞凋亡、增殖及其分子機制不僅有利于GI-R的防治，而且對于器官缺血/再灌注損傷理論的深入具有重要意義。

以往研究多是采用夾閉腹腔動脈導致胃缺血/再灌注損傷的在體模型[3-4]，但由于體內環境的復雜性，在體研究受到諸多因素的干擾，也難以特異性地針對胃黏膜某一細胞進行研究。故對于離體胃黏膜上皮細胞缺血-再灌注后損傷的研究具有十分重要的意義。本研究采用人胃黏膜上皮細胞株經體外培養及傳代后建立模擬缺血/再灌注細胞損傷模型，觀察在缺血-再灌注不同時間點胃黏膜上皮細胞凋亡的情況及其規律。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及細胞株 DMEM/F12(1∶1)培養基購自美國Hyclone公司;Hoechst33258、碘化吡啶(PI)染液購自美國Sigma公司;人胃黏膜上皮細胞株由北京腫瘤研究所提供。

1.2 實驗分組

1.2.1 正常對照(control)組 正常環境下培養人胃黏膜上皮細胞。

1.2.2 模擬缺血/再灌注損傷(I-R)組 更換模擬缺血液，于缺氧箱中缺氧、缺糖孵育1 h，更換模擬再灌注液，正常環境下分別進行再灌注孵育3、6、12 h。

1.3 模擬缺血-再灌注誘導胃黏膜上皮細胞凋亡模型的建立 采用缺氧、缺糖、復氧、復糖的方法模擬在體的缺血/再灌注過程。參照文獻的方法[5-6]，取胃黏膜上皮細胞接種在培養瓶中，待細胞生長至2～3天接近融合狀態時，將上述培養基置換為無糖的模擬缺血液，在模擬缺血條件下(5% CO2、1% O2、94% N2、37℃的缺氧箱中缺氧、缺糖)培養1 h，之后將模擬缺血液吸盡并加入正常DMEM/F12(含10%的胎牛血清)培養基，放至普通培養箱中(5% CO2、37℃)繼續培養不同時間。

1.4 流式細胞儀分析細胞凋亡率 分別收集各組培養的胃黏膜上皮細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用0.25%胰酶消化液制備單細胞懸液，以75%冷乙醇固定，置4℃ 保存。向固定的細胞懸液中加入PBS，輕輕混勻，1 000 r/min離心5 min，去除固定液。再以PBS洗一次。加入RNase A和PI染色液4℃避光染色30 min后，用流式細胞儀檢測分析細胞DNA含量，計算凋亡細胞百分率和凋亡峰，此峰的大小即代表凋亡細胞的多少。

1.5 胃黏膜上皮細胞形態學觀察 Hoechst33258染色法：吸盡培養液，加入0.5 ml 4%多聚甲醛固定細胞10 min;去除固定液，用MPBS洗2次;加入0.5 ml Hoechst33258染色液(10 mg/L) 37℃染色15 min;去染色液，用MPBS洗2次，去除過多的染色背景;熒光顯微鏡下觀察(激發波長為350 nm，發射波長為460 nm)，細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染為凋亡陽性細胞。

1.6 統計學處理 數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P

2 結 果

2.1 胃黏膜上皮細胞的培養及傳代 倒置顯微鏡下觀察，胃黏膜上皮細胞12～24 h貼壁，24 h后可見少量上皮樣細胞從周邊爬出，48 h后見細胞呈指數樣生長，72 h后細胞已基本融合，鏡下觀察可見細胞體積較大，細胞間緊密相連融合成片，核橢圓形，呈多邊鵝卵石鋪路樣(圖1)。傳代后的細胞生長迅速，48～72 h后可傳代。表明本研究中胃黏膜上皮細胞的體外培養及傳代成功可行。圖1 倒置顯微鏡下觀察正常對照組細胞

A.Bar=40 μm; B.Bar=20 μm2.2 模擬缺血-再灌注損傷對胃黏膜上皮細胞凋亡的影響

2.2.1 流式細胞儀檢測模擬缺血/再灌注后不同時間點細胞凋亡率變化 經流式細胞儀分析細胞的DNA含量。正常對照組胃黏膜上皮細胞凋亡百分率為(1.65±0.37)%，缺血/再灌注損傷組的胃黏膜上皮細胞經模擬缺血1 h，再灌注3、6、12 h均可誘導出凋亡峰(圖2)，細胞凋亡百分率分別為 (2.34±0.27)%、(6.68±0.56)%、(2.84±0.68)%，其中再灌注6 h時細胞凋亡出現高峰，且凋亡率與正常對照組相比差異有統計學意義(P

A.正常對照組;B、C、D.缺血1 h再灌注3、6、12 h組

圖3 模擬缺血/再灌注不同時間點細胞凋亡率的比較

與正常對照組比較：# # P

A、B.正常對照組(A：Bar=40 μm;B： Bar=20 μm);C、D.模擬缺血1 h、再灌注6 h組(C：Bar=40 μm; D：Bar=20 μm)圖5 熒光顯微鏡下胃黏膜上皮細胞的形態學變化(Hoechst33258染色)

A.正常對照組;B.模擬缺血1 h、再灌注6 h組(Bar=20 μm)

3 討 論

本實驗從形態學方面觀察到了模擬缺血/再灌注損傷后胃黏膜上皮細胞凋亡的變化：出現典型凋亡特征。同時，采用流式細胞儀檢測細胞內DNA含量，觀察模擬缺血/再灌注后不同時間點細胞凋亡率的變化。細胞發生凋亡時，由于核酸內切酶的激活，細胞內的DNA發生了斷裂， DNA含量減少，與熒光染料PI的結合減少，細胞的DNA熒光強度會降低，分析圖上在G0/G1峰前出現DNA含量減少的亞G0/G1峰，即典型的凋亡峰[7]。實驗結果表明：在缺血1 h、再灌注6 h后細胞凋亡出現明顯的高峰，細胞損傷加重。我們推測胃黏膜上皮細胞于缺血1 h、再灌注6 h后明顯凋亡可能與其具有較強的凋亡調控機制和增殖修復能力有關。

缺血/再灌注損傷導致的胃黏膜上皮細胞損傷實際上是一種氧化應激反應，在缺血-缺氧、氧自由基(OFR)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等胞外刺激信號的作用下，可激活核因子-κB(NF-κB)信號蛋白通路。然而NF-κB 在各類細胞中所導致的生物學反應是不同的，在一些細胞內它可以引起細胞的增殖， 相反則促進了細胞的凋亡[8]。我們前期的研究表明：氧自由基和 NF-B的活化均參與 GI-R損傷過程[9-10]，因此，進一步研究缺血-再灌注損傷導致的胃黏膜上皮細胞凋亡機制，NF-κB在離體胃黏膜上皮細胞的缺血-再灌注損傷中將起什么作用是我們今后研究的重點，這對于防治器官缺血/再灌注損傷也有著重要的意義。

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上皮細胞范文第5篇

[摘要] 目的:研究血管緊張素Ⅱ誘導腎小管上皮細胞損傷的機制。 方法:血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l）加入腎小管上皮細胞為對照組；體外培養的腎小管上皮細胞作為空白對照；不同濃度纈沙坦（10-6 μmol/l、10-7 μmol/l、10-8 μmol/l、10-9 μmol/l）先與腎小管上皮細胞共同培養半小時后再加入血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l）為干預組；EMSA、RT-PCR分別檢測不同時限NF-κB活性、骨橋蛋白mRNA表達。 結果:血管緊張素Ⅱ可誘導腎小管上皮細胞內NF-κB活性增加，骨橋蛋白mRNA表達上調；而不同濃度纈沙坦干預組檢測結果顯示NF-κB活性、骨橋蛋白mRNA表達明顯下調。 結論:血管緊張素Ⅱ誘導腎小管上皮細胞損傷與導致腎小管上皮細胞內NF-κB活性增加、骨橋蛋白mRNA轉錄上調有關。這一過程可能依賴血管緊張素ⅡⅠ型受體。

[關鍵詞] 血管緊張素Ⅱ;腎小管上皮細胞;核轉錄因子-κB;骨橋蛋白

Abstract： Objective To explore the mechanism of angiotensinⅡinducing the injury of proximal tubular cells. Methods Cultured cells were incubated with AngiotensinⅡ（10-7 μmol/l）as the control; cultured cells were incubated with different concentration Xiesartan for half an hour and then with angiotensinⅡ（10-7μmol/l） as the intervention group; proximal tubular cells without stimulation as blank control; EMSA， RT-PCR were used to observe NF-κB activity and OPN mRNA expression in different periods，respectively. Results AngiotensinⅡcould increase NF-κB activity and upregulate OPN mRNA expression in proximal tubular cells.While Xiesartan could decrease NF-κB activity and downregulate OPN mRNA expression in angiotensinⅡ stimulated proximal tubular cells. Conclusion The mechanism of angiotensinⅡ inducing the injury of proximal tubular cells is related to increase NF-κB activity and upregulate OPN mRNA expression，and this process is angiotensinⅡ receptorⅠ dependent.

Key words: AngiotensinⅡ; Proximal tubular cell; NF-κB; OPN

近年來，腎臟局部腎素―血管緊張素―醛固酮系統（RAS）在慢性腎臟病的發生、發展中的重要作用越來越受到人們的關注。RAS的主要效應因子血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ）已發現與許多腎臟疾病的發生、發展過程密切相關。但血管緊張素Ⅱ能否誘導小管上皮細胞損傷及其具體機制不明。本課題通過體外實驗用一定濃度血管緊張素Ⅱ刺激腎小管上皮細胞，觀察核轉錄因子、細胞因子的變化，探討血管緊張素Ⅱ誘導腎小管上皮細胞損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器測定NF-κB活性的EMSA試劑盒（promega公司）；血管緊張素 Ⅱ（sigma公司）；RT-PCR試劑盒（BD Bioscience公司）；TRIZOL（GiBco公司）；RNaseA抑制劑（Novagen 公司）；引物（上海生工生物工程技術公司）；大鼠的腎小管上皮細胞株(NRK細胞)購至中科院上海細胞庫；冷凍離心機（Biofuge公司），二氧化碳溫箱（Forma scientific公司）。纈沙坦由北京諾華公司提供。

1.2 細胞培養無菌條件下大鼠腎小管上皮細胞株，0.25%胰酶消化2 min，觀察細胞分散成拉網狀，終止消化，加入RPMI 1640培養液（含20%胎牛血清，300 mg/l谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素）反復吹打，并分裝至培養皿，置于37 ℃二氧化碳溫箱中孵育；反復傳代，取第七代細胞實驗用。

1.3 實驗分組當傳代細胞長至90%融合時換無血清培養液繼續培養12 h。試驗分組如下：①空白對照:未加刺激物的培養細胞。②對照組:血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l）加入培養細胞，分別于12、24 h檢測NF-κB活性； 12、24 h檢測骨橋蛋白 mRNA表達水平；每個檢測指標均設五個重復組。③干預組:不同濃度纈沙坦（10-6 μmol/l、10-7 μmol/l、10-8 μmol/l、10-9 μmol/l）加入培養細胞，半小時后再加入血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l），分別于12 h檢測NF-κB活性；12 h檢測骨橋蛋白 mRNA表達水平；每個檢測指標均設五個重復組。

1.4 EMSA的操作步驟①核蛋白的提取Bradford法定量。②EMSA 的操作依試劑盒說明書（Cat#3050）進行NF-κB寡核苷酸探針[r-32p]ATP標記及EMSA法測定NF-κB活性。NF-κB同序寡核苷酸探針序列為3′-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G5′；5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′。反應結束后，在4%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳2 h（電壓150 V，電泳緩沖液為0.5×TBE）。電泳完畢后干膠， -70 ℃放射自顯影。電泳結果經密度掃描儀進行半定量分析。

1.5 骨橋蛋白的RT-PCR操作步驟培養細胞接種至12孔培養板，當細胞長至80%～90%融合時換無血清培養液，12 h后按試驗分組加藥物干預，每組細胞均設五個復孔。①TRIZOL提取總RNA，并測定濃度及260/280 nm的吸光度（A）值。②按T1TANIUMTM one-step RT-PCR試劑盒說明進行操作。反應條件：50 ℃ 1 h，90 ℃ 5 min； 94 ℃ 30′，65 ℃ 30′， 68 ℃ 1 min 30個循環；68 ℃延伸2 min，4 ℃保存。骨橋蛋白上游引物序列：5′AAGCCTGACCCATCTCAGAA 3′； 骨橋蛋白下游引物序列為： 5′GCAACTGGGATGACCTTGAT 3′，產物長度446 bp；設β-actin為內參照，其上流引物序列為5′-TCGTACCACTGGCATTGTGA-3′，下游引物序列為5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′，產物長度545 bp。Mark片段選用2 000 bp。③電泳分析:取8 μl PCR擴增產物于質量濃度為1.5 g/l的瓊脂糖凝膠上電泳，采用kodak scieuce凝膠圖像分析系統掃描，并分析電泳條帶，以OPN與β-actin的電泳條帶光密度比值來作為OPN mRNA的相對表達量。

1.6 統計學處理全部實驗數據采用均數±標準差（x±s）表示，差異的顯著性采用單因素方差分析及q檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 EMSA法測定結果(見圖1)圖1中1~7泳道的密度掃描值依次為：36.30±8.73，194.50±10.45，186.30±12.30，76.34±4.57，90.34±5.86，114.60±7.67，138.41±6.53；n=5（每組細胞均設五個重復組）。未加刺激的腎小管上皮細胞內NF-κB表達較弱；血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l）刺激腎小管上皮細胞后NF-κB活性明顯增高，以12 h最明顯，為空白對照的5.47倍（P10-8 μmol/l>10-9 μmol/l（P

圖1 各組NF-κB活性的變化（略）

注: 1.空白對照；2.血管緊張素Ⅱ10-7 μmol/l 12 h；3.血管緊張素Ⅱ10-7 μmol/l 24 h；4、5、6、7泳道分別為10-6 μmol/l 12 h、10-7 μmol/l 12 h、10-8 μmol/l 12 h、10-9 μmol/l 12 h；

2.2 骨橋蛋白RT-PCR檢測結果(見圖2)1~7泳道OPN與β-actin的電泳條帶的光密度比值依次為：1~7泳道依次為0.20±0.05，0.97±0.049，0.85±0.014，0.17±0.032，0.37±0.017，0.60±0.031，0.28±0.012；n=5；經過統計學分析，各組及組間相比均有顯著差異，P＜0.05。從結果分析：未加刺激的腎小管上皮細胞內骨橋蛋白轉錄較弱，而血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l）誘導腎小管上皮細胞內骨橋蛋白轉錄增加，12 h達高峰，并持續至24 h；不同濃度纈沙坦可抑制血管緊張素Ⅱ刺激的腎小管上皮細胞骨橋蛋白的轉錄水平，抑制作用依次為10-6 μmol/l>10-7 μmol/l>10-9 μmol/l>10-8 μmol/l（P

圖2 各組OPN mRNA水平的變化（略）

注：M:DNA Mark； 1、空白對照; 2、血管緊張素Ⅱ10-7 μmol/l 12 h； 3、血管緊張素Ⅱ10-7 μmol/l 24 h； 4、 5、6、7泳道分別為纈沙坦10-6 μmol/l 12 h、10-7 μmol/l 12 h、10-8 μmol/l 12 h、10-9 μmol/l 12 h。

3 討論

腎臟局部腎素―血管緊張素―醛固酮系統（RAS）在慢性腎臟病進展中的作用已倍受重視， 血管緊張素轉化酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑應用臨床及動物實驗研究證實，血管緊張素Ⅱ在小管間質病變中發揮重要作用[1]。近年來，大量研究結果表明[2]，腎小管間質病變較腎小球病變更密切相關于腎功能的損傷和預后。小管間質病變在進行性腎小球損傷中的重要性已經被越來越多的國內外學者所重視。在小管間質損害過程中腎小管上皮細胞扮演著重要的角色。但血管緊張素Ⅱ誘導腎小管上皮細胞損傷的具體機制不明。NF-κB作為一種重要的核轉錄因子，能與多種基因啟動子或增強子上的κB位點發生特異性結合，并促進基因轉錄，參與許多基因，尤其是炎癥與免疫相關基因的表達與調控。許多刺激，如：腫瘤壞死因子α（TNF-α）、高糖、血小板活化因子、細胞因子等可激活NF-κB[3]。NF-κB游離并移入核內，調控炎癥與免疫相關的基因的表達。在胞漿中還存在另一種蛋白質家族-IκB，它的主要作用是與NF-κB/Rel蛋白在胞漿中結合并使后者保持靜息狀態。NF-κB在核內與新合成的IκB結合后出核，進入胞漿，從而失活。本課題通過體外實驗用血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l）刺激腎小管上皮細胞， EMSA檢測結果顯示NF-κB活性升高，12 h達高峰，并持續至24 h，說明一定濃度血管緊張素Ⅱ可誘導腎小管上皮細胞NF-κB活性升高，與隨后的炎癥、纖維化基因的過度表達密切相關。骨橋蛋白是一種可以在腎小管上皮表達的高度酸化的磷蛋白，現認為它是巨噬細胞趨化因子。而在許多病腎實驗模型上（包括缺血再灌注損傷）發現其表達上調。目前針對臨床腎臟疾病的研究發現骨橋蛋白在伴有蛋白尿的腎小球疾病如微小病變性腎病、膜性腎病、IgA腎病的腎小管上皮細胞處高表達，均與小管間質纖維化密切相關[4-5]。本研究通過體外實驗用血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l）刺激腎小管上皮細胞，RT-PCR結果顯示共同培養后骨橋蛋白的轉錄增加，在12 h達高峰并持續至24 h，與血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l）誘導腎小管上皮細胞內NF-κB活性改變相一致，證實血管緊張素Ⅱ（10-7 μmol/l）可誘導腎小管上皮細胞內骨橋蛋白的轉錄增加，這可能與腎小管間質巨噬細胞浸潤有關。通過對不同濃度纈沙坦共同培養的腎小管上皮細胞的測定，在相同刺激下其NF-κB活性及骨橋蛋白的轉錄水平明顯降低，從實驗角度說明纈沙坦用于慢性腎臟病的治療機制與抑制血管緊張素Ⅱ誘導的腎小管上皮細胞內NF-κB活性及骨橋蛋白的轉錄水平有關，因纈沙坦屬血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體拮抗劑，我們推測血管緊張素Ⅱ誘導腎小管上皮細胞NF-κB及OPN mRNA活性上調依賴于血管緊張素Ⅱ Ⅰ型受體。通過本研究證實血管緊張素Ⅱ可誘導小管上皮細胞內NF-κB活性明顯增加，骨橋蛋白轉錄增加，與炎性細胞小管間質浸潤密切相關，并且這一過程依賴AGNⅡ Ⅰ型受體。但具體的信號轉導途徑仍需深入研究。

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