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凝膠滲透色譜范文第1篇

【摘要】 目的建立凝膠滲透色譜（GPC）凈化-毛細管氣相色譜測定中成藥中有機氯農(nóng)藥殘留量的方法。方法凝膠滲透色譜采用的流動相為丙酮-環(huán)己烷 (1∶4)，最佳流速是5 ml/min，最佳餾分收集時間是15～26 min。結(jié)果低、中、高3個添加水平的回收率分別為85.5%～115.0%，84.3%～123.4%，86.7%～114.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.1%～9.3%，檢出限0.008～0.05μg/kg。結(jié)論該方法簡便，分離效果好，靈敏度高，重現(xiàn)性好。

【關(guān)鍵詞】 氣相色譜 凝膠滲透色譜 有機氯農(nóng)藥 中成藥 殘留量

有機氯類農(nóng)藥(OCPs)是一類高效廣譜殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于殺滅農(nóng)業(yè)害蟲，曾是各國殺蟲劑中使用最廣泛的一大類。這類農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，脂溶性強，殘效期長，易在脂肪體內(nèi)蓄積，造成慢性中毒，嚴(yán)重危及人體健康，中藥材及中成藥的農(nóng)藥殘留問題近年來逐漸引起人們的重視。盡快建立中藥中農(nóng)藥殘留的檢測方法及限量標(biāo)準(zhǔn)，對保證人們用藥安全具有積極的意義。目前中藥材中有機氯農(nóng)藥殘留測定主要采用有機溶劑提取，濃硫酸凈化，氣相色譜分析。但因中藥成分復(fù)雜，其中農(nóng)藥殘留量屬痕量范疇，這樣使得農(nóng)藥的提取、分離、凈化與富集的難度加大。凝膠滲透色譜作為一種自動化的分離技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中得到了推廣和應(yīng)用［1～7］。本研究運用凝膠滲透色譜替代硫酸凈化，有效地克服了硫酸凈化回收率偏低的難題，建立的毛細管氣相色譜分析方法，具有操作簡便、分析速度快、分離效能高、檢測靈敏度高等優(yōu)點，適合于中成藥中痕量有機氯農(nóng)藥的測定。

1 材料

Agilent 6890N 氣相色譜儀，配備捕獲檢測器（μ-ECD），安捷倫GC工作站。GPC純化系統(tǒng)：泵（Waters 515 HPLC Pump ），二極管陣列檢測器（Waters 2996 PAD）， 自動餾分收集器（Waters Fraction Collector III），GPC純化柱（Shodex CLNpak EV2000，20.0 mmID×300 mm），數(shù)據(jù)處理軟件（Waters Empower），5 ml定量環(huán)。OV-1701毛細管色譜柱30 m×0.32 mmID×0.32 μm；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI）；電子分析天平（R200D）。

丙酮、環(huán)己烷均為色譜純（天津科密歐），二氯甲烷為分析純（天津科密歐）。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：甲體-六六六（α- BHC）；乙體-六六六（β- BHC）；丙體-六六六（γ- BHC）；丁體-六六六（δ- BHC）；對對位滴滴依（PP`-DDE）；鄰對位滴滴涕（OP-DDT）；對對位滴滴滴（PP`-DDD）；對對位滴滴涕（PP`-DDT）；五氯硝基苯（PCNB）。所用標(biāo)準(zhǔn)品由中國成都化學(xué)試劑生產(chǎn)，純度大于99%。用甲醇分別配成0.1 mg/ml的單標(biāo)儲備液，再分別移取一定量的單標(biāo)儲備液于10 ml容量瓶中，用丙酮-環(huán)己烷（1∶4）混合液定容，配成混合標(biāo)準(zhǔn)液。

2 方法

2.1 樣品的提取 準(zhǔn)確稱取仙靈骨葆膠囊樣品（膠囊直接取其粉末即可，顆粒須經(jīng)磨碎成粉末） 2.5 g于具塞錐形瓶中，加入10 ml水浸泡過夜或超聲30 min，加丙酮30 ml超聲30 min，加3 g氯化鈉，振搖，再加30 ml二氯甲烷，超聲30 min，靜置1～2 h，取30 min上清液于100 ml濃縮瓶中，在50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮近干，再加丙酮-環(huán)己烷（1∶4）混合液5 ml，重復(fù)2次，用丙酮－環(huán)己烷混合液定容至10 ml，4 000 r/min離心10 min待用。

2.2 GPC凝膠凈化實驗

2.2.1 GPC洗脫規(guī)律實驗取5 ml一定濃度的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)液進樣，用Waters 2996 PAD進行全波長掃描，以丙酮－環(huán)己烷（1∶4）混合液作流動相， 流量5 ml/ min，每毫升收集于一個試管中，收集30個，用氮吹近干，丙酮－環(huán)己烷定容至1 ml得到待測液1。同樣在做成藥洗脫曲線時，用帶0.45 μl尼龍微孔濾膜的10 ml的注射器取樣品提取液5 ml過GPC，其余同上，得到待測液2。

2.2.2 GPC凈化取“2.1”項的提取液5.0 ml進樣到GPC；保持流速為5 ml/ min，收集第15～26 min餾分。濃縮淋洗液，用丙酮－環(huán)己烷定容至5 ml待測，得到待測液3。

2.3 GC分析條件Agilent 6890N 氣相色譜儀，配備捕獲檢測器（μ-ECD），ov-1701彈性石英毛細管色譜柱30 m×0.32 mmID×0.32 μm；進樣口280℃，柱溫220℃，檢測器370℃，載氣為高純N2（純度99.99%），柱前壓105 KPa，柱流量1.5 ml/min，進樣量1 μl，不分流進樣。

3 結(jié)果

3.1 凈化條件的確定餾分收集時間點的確定要充分考慮被滲透排除的機體組分與混合標(biāo)準(zhǔn)組分的分離情況和回收率。成藥樣品和農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)GPC凈化后GC-ECD檢測結(jié)果表明，收集第15～26 min的餾分，成藥（仙靈骨葆膠囊，貴州同濟堂制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)）樣品凈化率可達70%，加標(biāo)回收率為85%～115%，回收率滿足痕量分析的要求，成藥樣品色譜圖見圖1。

3.506 min為α- BHC，3.77 min為PCNB，5.94 min為β- BHC

圖1 成藥樣品GC-ECD色譜圖

3.2 成藥及9種有機氯農(nóng)藥的GPC流出規(guī)律GPC是根據(jù)多孔凝膠對不同大小分子的排阻效應(yīng)進行分離，大分子的油脂、色素(葉綠素、葉黃素)、生物堿、聚合物等先淋洗出來，農(nóng)藥及工業(yè)污染物等分子量較小，后淋洗出。GPC凝膠柱對成藥以及9種有機氯農(nóng)藥的分離、凈化效果進行如下試驗。將待測液1分別用Agilent 6890N 氣相色譜儀，電子捕獲檢測器（μ-ECD）檢測出各段流出農(nóng)藥的含量，結(jié)果見圖2。9種有機氯農(nóng)藥在凝膠滲透色譜柱上都是在第15～26 min時流出，但在第15 min僅有δ- BHC和第26 min有PCNB流出少量，所以，在樣品基質(zhì)較復(fù)雜的體系中，只需收集16～25 min，這可最大限度去除油脂等雜質(zhì)的干擾，回收率達到85%～115%。將待測液2分別用Agilent 6890N 氣相色譜儀，電子捕獲檢測器（μ-ECD）檢測出各段流出液雜質(zhì)的含量，結(jié)果見圖3。成藥流出液雜質(zhì)（油脂、色素、生物堿等）在凝膠滲透色譜柱上是在第10～35 min流出，其中10～15 min時流出 50%的雜質(zhì)，第15分鐘收集的餾分在ECD上響應(yīng)值最高，第900分收集的餾分在ECD上有響應(yīng)。

圖2 9種有機氯農(nóng)藥的GPC流出規(guī)律

圖3 仙靈骨葆膠囊的GPC流出規(guī)律

3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和方法學(xué)評價配制5個不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度重復(fù)3次，取峰面積平均值，得線性回歸方程，見表1。有機氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖4。從表1得出，在一定的濃度范圍內(nèi)，9種有機氯農(nóng)藥的線性關(guān)系良好，線性關(guān)系系數(shù)r（0.998 9～0.999 7）。加標(biāo)樣品按3倍基線-噪聲比計算9種有機氯農(nóng)藥的檢出限。

3.4 回收率及精密度實驗在2.5 g成藥樣品中加入3種不同濃度（添加水平見表2）有機氯混合標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法進行，同時做空白對照，回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表2，成藥加標(biāo)GC-ECD色譜圖見圖5。 表2 回收率與精密度測定結(jié)果

3.5 樣品測定按照本文建立的方法，測定了貴州省出口潛力較大的3種中成藥，農(nóng)藥殘留測定結(jié)果見表3。結(jié)果表明，貴州中藥有機氯農(nóng)藥的殘留自實行中藥藥材規(guī)范化種植以來，中藥中有機氯農(nóng)藥污染已得到了控制。表3 3種成藥中有機氯農(nóng)藥的殘留量mg·kg-1 H1-仙靈骨葆膠囊（批號：060428），貴州同濟堂制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)；H2-抗婦炎膠囊，貴州遠程制藥有限責(zé)任有限公司生產(chǎn)（批號：Z20025698）；H3-婦科再造丸（批號：Z20025056），貴州德昌祥藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。“-”表示未檢出

4 討論

本文以貴州出口中成藥仙靈骨葆膠囊為樣品，系統(tǒng)地研究了其提取液和有機氯農(nóng)藥的GPC流出規(guī)律，建立了仙靈骨葆膠囊中有機氯農(nóng)藥殘留的測定方法，并成功地運用于其他中藥的測定。建立的GPC凈化，氣相色譜測定中成藥中有機氯農(nóng)藥殘留量的方法具有自動化程度高，回收率和凈化效率好等優(yōu)點，適合于大部分中成藥中9種有機氯農(nóng)藥的測定。但對于含糖組分較高的中成藥，如糖漿類成藥，本文建立的樣品提取方法不適用，有待進一步研究。

參考文獻

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凝膠滲透色譜范文第2篇

【關(guān)鍵詞】天然藥物；強極性化學(xué)成分；親水作用色譜；反相色譜；高速逆流色譜

長期以來，由于條件的限制和方法的不成熟，對天然產(chǎn)物化學(xué)成分的研究多局限于脂溶性成分，關(guān)于天然藥物中非極性、低極性化合物的分離純化均有相關(guān)專著，然而根據(jù)傳統(tǒng)用藥習(xí)慣，天然藥物大多用水煎服，許多有效成分如生物堿、有機酸、多糖類等都較親水，極性強。強極性化合物的分離一直是天然產(chǎn)物分離工作中的難點之一，本文綜述了天然藥物中各類親水性、強極性化學(xué)成分的分離純化技術(shù)，歸納各類強極性化學(xué)成分分離純化方案，以期系統(tǒng)、快速、有效的提取、分離純化以及制備高純度的天然化合物，為全面研究天然藥物化學(xué)成分提供一定的參考。

一、層析分離

層析分離是一種經(jīng)典的傳統(tǒng)分離手段，具有分離效能高，快速簡便等特點，被廣泛用于黃酮類、生物堿、揮發(fā)油、蒽醌類等天然產(chǎn)物中化合物的分離和純化。根據(jù)分離機理，大致可以將強極性化學(xué)成分分離層析方法歸納為以下幾種。

1．親水作用色譜。親水作用色譜（Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）是采用極性固定相、高含量極性有機溶劑－水相緩沖液為流動相的一種分離技術(shù)，它能有效地保留反相色譜中保留弱或者不保留的強極性化合物。HILIC作為一種分離極性化合物的液相色譜模式，其概念最早是由Alpert于1990 年提出。其主要特征是使用類似于正相色譜的極性固定相和水/有機溶劑流動相與正相色譜類似，在HILIC模式下化合物的保留時間隨化合物極性的增強而增加。但是，由于HILIC使用含水流動相，這就可以解決正相色譜中水溶性物質(zhì)不溶于流動相的問題。近年來隨著強極性化合物的分離問題引起了各個研究領(lǐng)域的重視及HILIC自身的優(yōu)勢，使得HILIC逐漸引起人們的關(guān)注。Min Liu等以Atlantis HILIC 硅膠住為固定相，乙腈/50mM甲酸銨為流動相，調(diào)pH3，梯度洗脫，成功的分離強極性化合物2-氨基咪唑（2-AMP）及其類似物3-AMP、4-AMP。

2．反相色譜。反相色譜是以表面非極性載體為固定相，而以比固定相極性強的溶劑為流動相的色譜分離模式。天然產(chǎn)物化合物的分離常用的反相層析柱固定相為十八烷基（ODS）。ODS反相柱可減少死吸附，有效的實現(xiàn)中到大極性化合物的分離。日本學(xué)者Shiji Yahara采用反復(fù)硅膠柱層析和ODS層析對新疆一枝蒿Astragalus shikokianus 40%甲醇洗脫物進行化學(xué)成分分析，得到黃酮苷astrasikokioside I。ODS柱對于極性較大的糖苷類化合物具有很好的吸附與解吸能力。多用于正丁醇部位、水部位化學(xué)經(jīng)大孔樹脂、硅膠等粗分后所得組分細分時所用材料。

3．正相色譜。正相色譜是采用極性固定相和相對非極性流動相，由于極性化合物更容易被極性固定相所保留，所以正相液－液色譜系統(tǒng)一般可用于分離極性化合物，化合物保留時間隨著極性的增強的加長。主要用于分離甾醇類、類脂化合物、磷脂類化合物、脂肪酸以及其他有機物。A.E. Borgund采用正己烷、二氯甲烷、甲醇混合溶劑為流動相，正相液相色譜模式分離、富集油中的有機酸，建立的方法既可以用于分離，也可以用于制備。正相色譜雖然多用來分離弱極性或非極性的烴類化合物，但條件適當(dāng)，可用于分析分離苷類化合。

4．凝膠過濾色譜。凝膠色譜也叫凝膠滲透或分子篩過濾。固定相是具有一定大小孔徑的多孔凝膠制成。各組分在柱內(nèi)的保留時間和從柱中流出的次序決定于分子的大小，分子量大、體積大的，不能進入凝膠顆粒內(nèi)部而被排阻在凝膠粒子外部，只能在顆粒間移動，較早地被溶劑沖出來，因此大分子首先從柱底流出，分子量小、體積小的化合物可自由滲入微孔擴散到凝膠顆粒內(nèi)部，故通過色譜柱時阻力增大，流速變慢，最后從柱底流出，因此，各組分在凝膠柱色譜被洗脫出柱的先后順序基本是按分子大小排列的，不受化合物極性大小的限制，故可用于強極性化合物的分離純化。天然產(chǎn)物化合物分離中，用的較多的是Sephadex LH-20。在國外，很多學(xué)者采用凝膠進行分段，國內(nèi)很多實驗室Sephadex LH-20 用于除去色素和最后的細分。

二、高速逆流色譜

高速逆流色譜（High-speed counter current chromatography，HSCCC）是利用溶質(zhì)在兩相無不相容的溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的不同，從而進行分離的色譜法。由于其無不可逆吸附，回收率兩大特點，逆流色譜從逆流分配、液滴逆流色譜到現(xiàn)在的HSCCC歷程十年，技術(shù)和設(shè)備日臻成熟，受到不同學(xué)者的關(guān)注，廣泛用于中藥及天然產(chǎn)物的研發(fā)。HSCCC在天然產(chǎn)物分離中成功應(yīng)用在于兩相溶劑系統(tǒng)的選擇和優(yōu)化。當(dāng)前，HSCCC廣泛的被用于分離生物堿類、黃酮類、蒽醌類等化合物。

三、膜分離技術(shù)

膜分離技術(shù)是現(xiàn)代分離技術(shù)領(lǐng)域先進的技術(shù)之一，使用膜技術(shù)(包括半透膜、超濾膜、微孔濾膜、反滲透膜等)可以在原生物體系環(huán)境下實現(xiàn)物質(zhì)分離，可以高效濃縮富集產(chǎn)物，有效去除雜質(zhì)。超濾法是上世紀(jì)六、七十年展起來的一種膜分離技術(shù)，是以超濾膜作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)，具有分離不同分子量分子的功能。超濾法的工作原理是含有兩種或兩種以上溶質(zhì)的溶液，通過濾膜分離流動時，其中分子體積小的溶質(zhì)，經(jīng)濾膜流出，而分子體積較大的溶質(zhì)，不能通過濾膜而被截留；含有一種溶質(zhì)的溶液，通過濾膜可將溶質(zhì)全部截留，經(jīng)濾膜流出的是純凈的溶劑。超濾法的特點是有效膜面積大，分離效率高，濾速快，不易形成表面濃度極化現(xiàn)象，無相態(tài)變化，能耗小，可在常溫下進行操作，對分離熱敏性、保味性的藥物更為適用。這種分離方法應(yīng)用于中藥有效成分的分離純化中已顯示出極大的優(yōu)越性，以超濾為代表的膜分離技術(shù)曾被列為醫(yī)藥領(lǐng)域國家“八五”重點科技項目，目前，國家中醫(yī)藥管理局又將膜分離技術(shù)列為“十五”新藥研究研發(fā)中的支持項目，相信此技術(shù)將有良好的應(yīng)用前景。

四、小結(jié)與展望

天然產(chǎn)物開發(fā)及新藥的發(fā)現(xiàn)經(jīng)常要面對化學(xué)成分的分離問題，天然產(chǎn)物的化學(xué)成分極其復(fù)雜，要獲得大量高純度的單一有效成分，常要綜合性地利用各種溶劑提取法及層析方法。所有的層析方法包括親水作用色譜、反相色譜、正相色譜、凝膠色譜（Sephadex LH-20）、高速逆流色譜、膜分離，均具有選擇性高、載量大、有機溶劑用量少等特點。利用這些層析純化概念，希望能夠更系統(tǒng)、快速、有效的提前、制備天然產(chǎn)物中親水性、強極性化合物。

綜上所述，縱然各種方法在天然產(chǎn)物開發(fā)中取得了很好的效果，但由于天然產(chǎn)物種類繁多，性質(zhì)各異，必須針對各類甚至各個化合物的性質(zhì)綜合考慮提取、分離、純化中的各個環(huán)節(jié)。針對不同的化合物性質(zhì)制定特異性的分離方案，結(jié)合現(xiàn)代化的分析手段與藥效學(xué)評價，闡明化合物結(jié)構(gòu)與藥效之間關(guān)系，才能更好的開發(fā)更多的具有價值的先導(dǎo)化合物。

參考文獻

凝膠滲透色譜范文第3篇

【關(guān)鍵詞】  高效凝膠色譜法； 多花黃精多糖； 分子量及其分布

多花黃精多糖是從傳統(tǒng)中藥百合科植物多花黃精中發(fā)現(xiàn)并分離出一種低分子量活性多糖，為新藥(中藥)原二類,全國第一個治療病毒性角膜炎的中藥。多花黃精多糖抗單純皰疹病毒i型的體外細胞培養(yǎng)試驗結(jié)果結(jié)果表明,多花黃精多糖有明顯的抗單純皰疹病毒i型的作用。多糖為單糖的天然聚合物，多糖的性質(zhì)和藥理作用與其分子量大小，分子量分布及其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。多糖的分子量不是均一的，具多分散性，需要用統(tǒng)計方法表征其平均分子量及其分子量分布。高效凝膠色譜法測定多糖的分子量及其分布，具有快速，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，在國內(nèi)外得到了廣泛的應(yīng)用[1]。多花黃精多糖為水溶性多糖，針對其單糖組成和空間結(jié)構(gòu)與葡聚糖相似，在色譜柱的選擇上傾向于更適合于水溶性多糖分離測定用的shodex ohpak sb803hq系列（對葡聚糖的排阻極限為1×105）。有關(guān)多花黃精多糖的平均分子量及其分子量分布尚未見相關(guān)報道，本文應(yīng)用凝膠滲透色譜（gpc）法測定多花黃精多糖的平均分子量及其分子量分布[2]，為考察生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定一致性及控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，為多花黃精多糖分子大小和藥理作用的相關(guān)性研究打下了一定基礎(chǔ)。

    1實驗部分

    1.1儀器與試藥

    agilent 1100型高效液相色譜儀（自動進樣器），示差折光檢測器。shodex ohpak sb803hq凝膠色譜柱。北京龍智達公司提供gpc專用軟件。

    供分子量測定用右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，d0、d1、d2、d3、d5、d6、d8、d2000分子量依次為180、2500、4600、7100、21400、41100、133800、2000000）；其余試劑均為分析純；高純水用milliporeq超純水系統(tǒng)制得。

    試驗用樣品多花黃精多糖由四川泰華堂制藥有限公司提供。

    1.2方法與結(jié)果

    1.2.1色譜條件色譜柱為shodex ohpak sb803hq，流動相為0.71%硫酸鈉溶液（內(nèi)含0.02%疊氮鈉），柱溫：35 ℃，示差折光檢測器（檢測器溫度35 ℃），流速0.5 ml·min－1，取供試品溶液及對照品溶液各20μl注入液相色譜儀。

    1.2.2溶液的制備取多花黃精多糖適量，加流動相制成每1 ml中約含10 mg的溶液，振搖，室溫放置過夜，作為供試品溶液。另取d0，d2000及4～6個已知分子量的葡聚糖對照品，同法制成每1ml中各含10 mg的溶液作為對照品溶液。

    1.2.2.5系統(tǒng)適應(yīng)性試驗取葡萄糖對照品溶液（d0），按1.2.1的色譜條件進樣，紀(jì)錄色譜圖，按葡萄糖峰計算理論塔板數(shù)n=5.54×trw1/2=16083；另取d2000對照品溶液，1.2.1的色譜條件進樣，紀(jì)錄色譜圖，計算分配系數(shù)，kd=trt0ttt0=0.52，kd在0～1之間，符合中國藥典2005年版的要求。式中tr為供試品峰保留時間，t0為藍色葡聚糖（d2000）峰保留時間，tt為葡萄糖（d0）峰保留時間。

    1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及樣品測定

    取上述右旋糖酐系列對照品溶液分別進樣，記錄洗脫峰的保留時間，由gpc專用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)分子量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)色譜峰的保留時間為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程。該方法的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)達0.9997。根據(jù)gpc專用軟件繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線及供試品的保留時間采用gpc專用軟件計算樣品各組分的重均分子量及其分子量分布。 表1  右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)對照品保留時間及其相應(yīng)的對數(shù)值

1.2.4  精密度試驗取供試品溶液20 μl，按“1.2.1”項下色譜條件，連續(xù)測定5次，根據(jù)gpc曲線計算重均分子量（mw）分別為5018，5009，5009，5028，5017，rsd為0.16%，表明該系統(tǒng)測定樣品分子量的精密度良好。

    1.2.5重復(fù)性試驗取批號為060701的樣品，按“1.2.2”項下方法分別制備供試品溶液5份，按“1.2.1”項下色譜條件測定分子量及其分子量分布，根據(jù)gpc曲線計算重均分子量（mw）分別為5020，5028，5044，5054，5053，rsd為0.30%。表明該分析方法測定樣品分子量精密度良好。

    1.2.6穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件，在0h、2h、4h、8h、12h和24h分別進樣，測定分子量及分子量分布，根據(jù)gpc曲線計算重均分子量（mw）分別為5055，5090，5100，5126，5160、5046，rsd為0.84%。表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

    1.2.7樣品的測定取不同批號的多花黃精多糖樣品，按“1.2.2”項下的方法制備供試品溶液，然后按“1.2.1”項下的色譜條件測定分子量及分子量分布，結(jié)果見表2。表2  3 批樣品重均分子量及其分布情況表

2討論

  根據(jù)以上測定結(jié)果可見，測定的三批多花黃精多糖的重均分子量分布在2500～7500之間，分布寬度小于2.0。用本方法測定多花黃精多糖的分子量與分子量分布，準(zhǔn)確可行，簡便快捷，精密度好。

    分布寬度的引入，使多花黃精多糖的分子量分布更具可控性，能夠通過檢測該指標(biāo)反映生產(chǎn)該樣品的工藝的變化以及樣品質(zhì)量的變化，使得樣品的質(zhì)量更具有可控性。

凝膠滲透色譜范文第4篇

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法 發(fā)展 優(yōu)勢 劣勢 發(fā)展 應(yīng)用

高效液相色譜法使用的流動相是液體，應(yīng)用高壓輸液裝置，將具有不同極性的單一溶劑或者不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相壓進裝有固定相的色譜柱中，各種成分在柱內(nèi)分離以后，然后進入檢測器被檢驗，最后對試樣進行分析。

一、高效液相色譜法的發(fā)展

1.高效液相色譜法的歷史

色譜分析法的一個分支就是高效液相色譜法，在20世紀(jì)60年代末期，以氣相色譜法和經(jīng)典液相色譜發(fā)為基礎(chǔ)，形成的一種新的分離和分析技術(shù)。到了1960年，隨著氣相色譜法理論和實踐的不斷發(fā)展，同時光學(xué)、機械、電子等技術(shù)也在不斷發(fā)展，液相色譜法逐漸被相關(guān)學(xué)者使用。到了20世紀(jì)60年代末，高效液相色譜發(fā)就應(yīng)用高壓泵和化學(xué)鍵合固定相。

2.高效液相色譜法和其他色譜法的比較

2.1高效液相色譜法和經(jīng)典液相色譜的比較

經(jīng)典液相色譜法使用的是粗粒多孔固定相，將固定相裝在口徑大、較長的玻璃柱管內(nèi)，流動相只能通過重力流過色譜柱，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)和擴散的速度都很慢，因為柱的入口壓力很小，導(dǎo)致柱子的效果很差，在很大程度上增加了分析時間。而高效液相色譜法使用的固定相是全多孔微粒，將固定相裝在口徑小、短的不銹鋼的柱子內(nèi)，流動相通過高壓輸液泵進入了柱壓很大的色譜柱中，在固定相中，溶質(zhì)的傳質(zhì)和擴散速度都很快，所以在很多的時間內(nèi)，柱子的效率和分離能力都很好。

2.2和氣象色譜法的比較

高效液相色譜法和氣象色譜法相比有很多的類似之處。氣象色譜法的選擇性很高、分析效率也不低，同時還具有很高的靈敏度和分析速度，可是這種分析方法只能對那些蒸氣壓低和沸點低的樣品進行分析，對于那些高沸點的有機物、具有不高穩(wěn)定性的化合物、高分子物質(zhì)和生物活性物質(zhì)來說，這種方法就行不通了。經(jīng)過分析，只有20%的有機化合物可以使用氣象色譜法進行分析。可是對高效液相色譜法來說，就能分離和分析剩余的80%的有機化合物。

二、高效液相色譜法的綜合分析

1.高效液相色譜法的有適合劣勢

高效液相色譜法和其它分析方法相比具有很高的分辨率，為了達到最佳的分離效果可以選擇流動相和固定相；同時它的分析速度很快，一般只需要幾分鐘或者即使分鐘；它還具有很高的重復(fù)性，使用的樣品還可以回收；它使用的色譜柱還可以重復(fù)使用，非常環(huán)保；具有較高的自動化程度，在進行分析時，分析的精確度也很高。所以高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用，尤其是對大部分的有機化合物進行分離和分析，在分離和分析高沸點、極性強、大分子、熱穩(wěn)定差的化合物時有很大的優(yōu)勢。

可是高效液相色譜法需要很高的壓力，一般要達到150～350×102 KPa。同時如果流動相的配比在進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等發(fā)生任何變化，或者被分離的物質(zhì)發(fā)生擴散或者滯留的現(xiàn)象都會加寬色譜峰，降低柱效率。

2.對高效液相色譜法的分類

由于分離機制不同，高效液相色譜法可分為以下幾類。（1）吸附色譜。這種方法的固定相是固體吸附劑，流動相是不同極性溶劑，根據(jù)各個組分在吸附劑上的吸附能力不同對其進行分離。（2）分配色譜。這種方法的固定相是液體。因為每一個組分在固定相中的溶解能力不同，對試樣中的組分進行分離。（3）親和色譜。這種方法主要是對固定相的結(jié)合特性進行利用，然后將分子分離。親和色譜在凝膠過濾色譜柱上連接和有待分離的物質(zhì)有一定結(jié)合能力的分子，同時這種結(jié)合是可逆的，在對流動條件進行改變時，也能對其進行分離。（4）離子交換色譜。這種色譜的固定相是離子交換劑，將離子交換樹脂上可電離的離子和流動相中的具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，因為這些離子和交換劑的親和能力不同，就會分離開來。（5）體積排阻色譜。這種色譜的固定相是具有化學(xué)惰性的多孔性凝膠，固定相對各組分的體積阻滯作用不同，這樣各組分就會發(fā)生分離。因為流動相的不同又可分為凝膠過濾色譜和凝膠滲透色譜。

三、高效液相色譜法的應(yīng)用

1.高效液相色譜法的應(yīng)用范圍

對于那些高沸點不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的、高分子的、具有不同極性餓有機化合物，生物活性物質(zhì)和各種天然的物質(zhì)，高效液相色譜法都能對其進行分離和分析。這些物質(zhì)在食品、合成藥物、石油化工產(chǎn)品、生物化工產(chǎn)品等方面都有應(yīng)用，其中在這些方面應(yīng)用的無機物中占20%，在這些方面應(yīng)用的有機物中占80%，特別是那些永久性氣體、易揮發(fā)的、具有中等分子量的化合物都能進行分析。

2.高效液相色譜法應(yīng)用的限制

首先高效液相色譜法使用的流動相是多種溶劑，同時使用這種方法進行分析需要的成本比氣象色譜法高，對環(huán)境也會產(chǎn)生污染。特別是在進行不同濃度的操作時，還要對其進行洗脫，操作起來比氣象色譜法復(fù)雜。同時，這種方法使用的檢測器不是通用的，和氣象色譜相比就處于劣勢了。可是這幾年蒸發(fā)激光散射檢測器逐漸被應(yīng)用，很有可能成為高效液相色譜法分析時一種通用的檢測器。還有就是，高效液相色譜法是不可能取代氣象色譜法的，因為對于組成復(fù)雜、具有多種沸程的石油產(chǎn)品來說，它需要柱效達到10萬塊塔板和毛細管氣相分析發(fā)分析。最后，這種方法也無法取代中、低壓柱色譜法。在柱壓從200千帕升到到1兆帕?xí)r，具有生化活性的生化樣品收到壓力容易分解、變性。

四、結(jié)束語

高效液相色譜法是在氣象色譜和液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展的，同時發(fā)展也很快，因為這種方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確、效率高，當(dāng)前，在各個方面的應(yīng)用也非常廣泛。可是這種方法也有缺陷，所以要不斷的對其進行完善，使其變得更加快捷精準(zhǔn)。

參考文獻

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凝膠滲透色譜范文第5篇

[關(guān)鍵詞] 復(fù)方南星止痛膏；凝膠膏劑；透皮吸收；水楊酸甲酯；透皮促進劑；丁香酚

[收稿日期] 2012-10-11

[基金項目] 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室開放基金項目（SKL2010M0302）；北京中醫(yī)藥大學(xué)復(fù)方中藥制藥研究創(chuàng)新團隊項目（2011-CXTD-13）；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項目（2011JYB22XS-063）

[通信作者] *杜守穎，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新劑型與新技術(shù)研究，Tel：（010）84738615，E-mail：

[作者簡介] 黎迎，碩士研究生，E-mail： 復(fù)方南星止痛膏的處方由丁香、肉桂、白芷、川芎等中藥組成，具有散寒除濕、活血止痛的作用。臨床上用于寒濕瘀阻所致的關(guān)節(jié)疼痛，腫脹，活動不利，遇寒加重，舌質(zhì)暗淡或瘀斑[1]。凝膠膏劑屬于中藥經(jīng)皮給藥制劑，具有載藥量大，透皮效果好，對皮膚無刺激等優(yōu)點。國際上常用的促滲劑有亞砜類、吡咯酮類、月桂氮酮類、表面活性劑類等10多種，其中有些促滲劑的毒副作用較大，該制劑處方含有樟腦、冰片、水楊酸甲酯等揮發(fā)性成分，文獻報道冰片[2-4]、樟腦[4]不僅本身具有的殺菌、消炎、止痛、鎮(zhèn)痛的作用，而且對藥物的透皮吸收具有促進作用，起到了藥輔合一的效果。本研究通過考察復(fù)方南星止痛凝膠膏劑的體外透皮情況，并與不含水楊酸甲酯的凝膠膏劑進行比較，探討水楊酸甲酯在處方中的促滲作用，為臨床使用和優(yōu)化復(fù)方南星止痛膏處方提供實驗依據(jù)。

1 材料

高效液相色譜儀（日本島津公司，包括LC-20AT泵，VWD檢測器，LC Solution色譜工作站）；Sartorius BS 110S型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TP-5智能透皮試驗儀（南京紅藍電子科技有限公司）；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（上海振捷實驗設(shè)備有限公司）。丁香酚（中國食品藥品檢定研究院，批號10719-200613）；復(fù)方南星止痛凝膠膏劑（自制）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團）；甲醇（色譜純，Promptar公司）；冰醋酸（色譜純，美國FISHER公司）；PEG-400（天津市光復(fù)精細化工研究所）；氯化鈉（西隴化工股份有限公司）；其他試劑均為分析純。CD-1裸鼠，體重15～18 g，由維通利華實驗動物中心提供[SCXK（京）2012-0001]。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立

本試驗以丁香酚作為復(fù)方南星止痛貼膏劑的指標(biāo)成分，建立了測定體外透皮后接收液，皮中及剩余膏中丁香酚的HPLC檢驗方法。

2.1.1 色譜條件 Merck RP-18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以1%冰醋酸溶液-甲醇（54∶46）為流動相，流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備及線性試驗 精密稱取丁香酚對照品適量，加甲醇制成每1 mL含丁香酚

A. 對照品；B. 接受液樣品；C. 膏處理樣品；D. 皮膚處理樣品；E. 空白接收液；F. 空白皮；1. 丁香酚。

圖1 復(fù)方南星止痛貼膏劑有效成分HPLC圖

Fig.1 HPLC chromatograms of index compositions of compound Nanxing pain paste cataplasm

0.091 6 mg的對照品溶液，分別進樣0.2，0.5，1，5，10，20，30，40 μL，進行色譜分析；以進樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算回歸方程。 Y =1.00×106 X-10 866， r = 0.999 9。結(jié)果表明，丁香酚在0.018～3.66 μg線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗 取上述對照品溶液，精密吸取對照品溶液20 μL重復(fù)進樣6次，計算RSD。丁香酚峰面積的RSD為0.69%，表明儀器精密度良好。

2.2 體外透皮吸收實驗[5-7]

2.2.1 離體鼠皮的制備 裸鼠脫頸椎處死，取下腹皮，用干棉花將脂肪及黏液組織擦試干凈，置于-20 ℃冰箱中保存，實驗時取出，室溫下自然解凍。

2.2.2 實驗方法 采用TP-5智能透皮試驗儀，F(xiàn)ranz擴散池，上室為擴散室，下室為接收室，擴散池容積為7 mL，有效擴散面積為2.80 cm恒溫水浴加熱，溫度（37±0.2） ℃。實驗時，接收室加滿釋放介質(zhì)（含有30%PEG-400的生理鹽水），將裸鼠皮附在接收室上，再將貼膏貼于裸鼠皮上，使其背襯層朝向擴散室，將其固定在兩室之間，排除氣泡。磁攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為300 r·min-1，在設(shè)定的時間點1，2，4，6，8，10，12，24 h精密移取接收液0.4 mL，同時補加同樣體積的新鮮接收液。過濾進行含量測定。

2.2.3 體外透皮吸收實驗結(jié)果 根據(jù)以下公式計算體外累積透皮率（ Q %）及單位面積累積透過量（ m/A ），以6組數(shù)據(jù)平均累積體外透皮率對時間作圖，結(jié)果見圖2；以單位面積累積滲透量 m/A 對時間 t 進行線性回歸得方程 m/A = Js× t +B，所得斜率 Js即為穩(wěn)態(tài)滲透速率（μg·cm-2·h-1），2種復(fù)方南星止痛凝膠膏劑中丁香酚透皮吸收相關(guān)參數(shù)見表1。公式中， V 為接收室中接收液的體積（mL）； V S為取出接收液的體積（mL）； C n為第 n 個取樣點測得的接收液中藥物濃度（g·L-1）； W 為貼膏劑中所含藥物的量（mg）； A 為藥物有效擴散面積（cm2）。

Q %=（ VCn + n-1 i =1 V sCi ）/ W ×100

m/A =（ VCn + n-1 i =1 V sCi ）/ A

圖2 2種凝膠膏劑中丁香酚累積透過率-時間曲線圖

Fig.2 The curve of cumulative permeation percentage-time of eugenol in two kinds of cataplasm

采用統(tǒng)計軟件分別對含水楊酸甲酯和不含水楊酸甲酯凝膠膏劑中丁香酚24 h累積透過率和穩(wěn)態(tài)滲透速率進行統(tǒng)計學(xué)處理， t 檢驗分析結(jié)果表明，兩者的丁香酚24 h累積透過率和穩(wěn)態(tài)滲透率之間差異均具有顯著性（ P

表1 2種凝膠膏劑中丁香酚透皮吸收相關(guān)參數(shù)（ n= 6）

Table 1 Parameters relevant to TDD absorption of eugenol in two kinds of cataplasms （ n= 6）

2.4 膏中殘留量的測定

2.4.1 膏中殘留量的測定方法 體外經(jīng)皮滲透試驗結(jié)束后，揭去制劑，將膏從襯布上刮下，加入3倍量硅藻土將膏研磨均勻后，放入錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理40 min，冷卻到室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液，進行含量測定。

2.4.2 膏中殘留量和殘留率的測定結(jié)果 分別將2種復(fù)方南星止痛凝膠膏劑的6組試驗結(jié)果取平均值，結(jié)果見表3。

表3 膏中殘留量和殘留率結(jié)果（ ±s，n= 6）

Table 3 Results of retention amount and retention rate in cataplasms（ ±s，n= 6）

3 討論

實驗結(jié)果表明，復(fù)方南星止痛凝膠膏劑體外滲透作用時間較長，可減少用藥次數(shù)，提高患者順應(yīng)性。在透皮過程中，有效成分一部分透過皮膚進入血液循環(huán)，一部分殘留于凝膠膏劑中，另一部分滯留于皮膚上，但皮中滯留量很低，當(dāng)揭掉制劑后，不會對身體產(chǎn)生影響。

由于測定累積透過率、皮中滯留率、膏中殘留率的樣品需要分別制備、測定，且測定皮膚滯留率和膏中殘留率的樣品需要經(jīng)過比較復(fù)雜的處理過程，因此產(chǎn)生的測定誤差使三者之和不等于100%。但是2種凝膠膏劑中有效成分總體回收率均在90%～110%，符合了一般樣品測定的要求。

藥物的透皮吸收過程分為3個階段：藥物從基質(zhì)中釋放，藥物穿透角質(zhì)層屏障，藥物通過表皮和真皮被血管吸收。皮膚是主要的限速因素，增加藥物透皮吸收是提高血藥濃度的關(guān)鍵。實驗結(jié)果表明，水楊酸甲酯能促進藥物透皮吸收，水楊酸甲酯屬芳香酯類化合物，是外用制劑中常用的藥物，具有強烈的嗅味，其促滲機制可能在于能增加皮膚的類脂流動性來促進丁香酚的經(jīng)皮滲透；也可能使脂質(zhì)分子層產(chǎn)生扭轉(zhuǎn)效應(yīng)，形成微孔，增加藥物通過角質(zhì)層的滲透性。水楊酸甲酯既為處方中的藥物，具有消炎、抗菌、止痛等多種藥理作用[10]，同時可作為促滲劑，具有促滲的作用，對提高藥物使用率，節(jié)約藥物資源，提高用藥經(jīng)濟性都有重要意義。本研究為復(fù)方南星止痛膏處方及劑型研究提供了參考。

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Study on transdermal characteristics of compound Nanxing pain-relieving

cataplasm and effects of gaultherolin in prescriptions

LI Ying， DU Shou-ying LU Yang， BAI Jie， WANG Ying-zi， WANG Yue， XING Yu-shu， XIAO Wei2， 3

（1.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

3. State Key Laboratory of New Pharmaceutical Technology of Traditional Chinese Medicines， Lianyungang 222001， China）

[Abstract] Objective： To study transdermal absorption characteristics of eugenol in compound Nanxing pain-relieving cataplasm， and discuss the effect of gaultherolin on the transdermal absorption of the cataplasm. Method： The improved franz diffusing cell was adopted with hairless mice skins as transdermal carriers. The content of eugenol in receptor liquid， skins and cataplasm were analyzed by HPLC and compared with the cataplasm without gaultherolin. Result： The penetration rates of eugenol of cataplasms with and without gaultherolin were 13.18 and 9.58 μg·cm-2·h-1， with the retention amount in skins of （185.02±19.23） and （160.23±16.54） μg·g-1 and the retention amount in cataplasms was （1.96±0.12） and （1.71±0.15） mg， respectively. Conclusion： Eugenol in compound Nanxing pain-relieving cataplasm has good pereutaoeous permeation. Gaultherolin in the cataplasm prescription can promote the absorption of eugenol.