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細胞因子范文第1篇

一、細胞因子與疾病

正常情況下，細胞因子表達和分泌受機體嚴格的調控，在病理狀態下、細胞因子會出現異常性表達，表現為細胞因子及其受體的缺陷，細胞因子表達過高，以及可溶性細胞因受體的水平增加等。

（一）細胞因子及其受體的缺陷

包括先天性缺陷和繼發性缺陷兩種病理情況，例如先天性的性聯重癥聯合免疫缺陷病人（XSCID），表現為體液免疫和細胞免疫的雙重缺陷，出生后必須在無菌罩中生活，往往在幼兒期因感染而夭折。現已發現這種患者的IL-2受體γ鏈缺陷，由此導致IL-2、IL-4和IL-7的功能障礙，使免疫功能嚴重受損。細胞因子的繼發性缺陷往往發生在感染、腫瘤等疾病以后，如人類免疫缺陷病毒（HIV）感染并破壞TH后，可導致TH細胞產生的各種細胞因子缺陷，免疫功能全面下降，從而表現出獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）的一系列癥狀。

（二）細胞因子表達過高

在炎癥、自身免疫病、變態反應、休克等疾病時，某些細胞因子的表達量可成百上千倍地增加，例如為風濕關節炎的滑膜液中可發現IL-1、IL-6、IL-8水平明顯高于正常人，而這些細胞因子均可促進炎癥過程，使病情加重。細胞因子的抑制劑有可能這為類癥性細胞因子水平升高的疾病。

（三）可溶性細胞因子受體水平升高

細胞膜表面的細胞因子受體可脫落下來，成為可溶性細胞因子受體，存在于體液和血清中，在某些疾病條件下，可出現可溶性細胞因子受體的水平升高。這類分子可能結合細胞因子，使其不再與膜表面的細胞因子受體結合，因而封閉了細胞因子的功能。

二、細胞因子與治療

，利用基因工程技術生產的重組細胞因子做為生物應答調節劑（BRM）治療腫瘤、造血障礙、感染等已收到良好的療效，成為新一代的藥物。重組細胞因子做為藥物具有很多優越之處。例如細胞因子為人體自身成分，可調節機體的生理過程和提高免疫功能，很低劑量即可發揮作用，因而療效顯著，副作用小，是一種全新的生物制劑，已成為某些疑難病癥不可缺少的治療手段。目前已批準生產的細胞因子藥物包括干擾素α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在進行臨床試驗的包括IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等（表4-3、4-4。）這些細胞因子的主要適應癥包括腫瘤、感染（如肝炎、AIDS）、造血功能障礙、創傷、炎癥等。表4-3已批準生產的細胞因子多肽藥物（略）表4-4已批準臨床試驗的細胞因子多肽藥物（略）

細胞因子療法（cytokinetherapy）基本上可分為兩種，即細胞因子補充和添加療法及細胞因子阻斷和拮抗療法。

（一）細胞因子補充和添加療法

通過各種途徑使患者體內細胞因子水平增加，充分發揮細胞因子的生物學作用，從而抗御和治療疾病。目前已有多種細胞因子（多為基因重組產品）試用于臨床治療，經大量臨床資料驗證，以下幾種細胞因子的臨床適應癥比較明確，臨床療效比較肯定。

1．IFN不同型別的IFN各有其獨特的性質和生物學活性，其臨床應用適應癥和療效有所不同。IFN-α主要用于治療病毒性感染和腫瘤。IFN-α對于病毒性肝炎（主要是慢性活動性肝炎）、皰疹性角膜炎、帶狀皰疹、慢性宮頸炎等有較好療效。IFN-α對于血液系統惡性疾病如毛細胞白血病（有效率達80%以上）等療效較顯著，但對實體腫瘤的療效較差。雖然IFN-γ的免疫調節作用強于IFN-α，但其治療腫瘤的效果弱于IFN-α，目前有人應用IFN-γ治療類風濕關節炎、慢性肉芽腫取得了一定療效。

2．IL-2目前多將IL-2與LAD/TIL合用治療實體腫瘤，對腎細胞癌、黑色素瘤、非何杰金淋巴瘤、結腸直腸癌有較顯著的療效，應用IL-2（或與IFN合用）治療感染疾病亦取得了一定療效。

3．TNf由于其全身應用副作用嚴重且療效差，目前多傾向將其局部應用如瘤灶內注射治療某些腫瘤和直腸癌，其確切療效尚待進一步評價。

4．CSF目前主要應用GM-CSF和G-CSF治療各種粒細胞低下患者。例如與化療藥物合用治療腫瘤可以降低化療后粒細胞減少程度，使粒細胞的數量和功能能盡快回升并能提高機體對化療藥物的耐受劑量，從而提高治療腫瘤的效果。對再生障礙性貧血和AIDS亦有肯定療效。用于骨髓移植后可使中性粒細胞盡快恢復，降低感染率。此外，應用EPO治療腎性貧血取得了非常顯著的療效。

（二）細胞因子阻斷和拮抗療法

其基本原理是抑制細胞因子的產生和阻斷細胞因子與其相應受體的結合及受體后信號傳導過程，使細胞因子的病理性作用難以發揮。該療法適用于自身免疫性病、移植排序反應、感染性休克等的。例如抗TNF單克隆抗體可以減輕甚至阻斷感染性休克的發生，IL-1受體拮抗劑對于炎癥、自身免疫性疾病等具有較好的治療效果。

三、細胞因子的檢測

細胞因子檢測是判斷機體免疫功能的一個重要指標，因而具有重要的實驗室價值，同時還可能在臨床上有諸多實用價值、包括許多疾病的診斷、病程觀察、療效判斷及細胞因子治療監測等。但是，由于細胞因子在體內的含量甚微，給細胞因子的檢測帶來困維。細胞因子的主要檢測包括：

（一）依賴性細胞株

一些腫瘤細胞株必須依賴于細胞因子方能在體外增殖，如DTLL細胞株依賴IL-2；FDC-PL細胞株依賴于小鼠IL-3；TF-1細胞株依賴于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用這些依賴細胞株檢測相應的細胞因子。這種方法敏感性高，特異性也不錯，但可異的是并非所有細胞因都能找到相應的細胞株，因而限制了它的。

（二）功能檢測

利用一些細胞因子的功能特性，可建立相應的活性測定方法，如干擾素的抑制病毒感染效應，腫瘤壞死因子對L929細胞的殺傷作用等。這樣的方法敏感性高，但特異性不夠，容易受一些擾因素的。

（三）免疫測定

利用抗原抗體反應的原理，制備出抗細胞因子的單克隆抗體或多克隆抗體，可進行細胞因子的免疫檢測。這種方法的優點是特異性強、操作簡便，缺點是靈敏度不夠，且不能代表活性測定的結果。從目前的國際趨勢來看，已研制出了高靈敏度、特異性高、高度配套的細胞檢測試劑盒，其應用范圍正在擴大，有良好的發展前景。

（四）功能測定與抗體抑制

為解決功能定特異性不夠，免疫測定靈敏度不夠的，可將兩種方法結合起來，利用各自的長處，有可能得到較為可靠的結果。在這一方法中，所用的抗細胞因子抗體必須是具有中和活性的抗體。

（五）分子雜交技術

利用分子生物學技術，制備出細胞因子的基因探針，可通過分子雜交技術檢測細胞內細胞因子mRNA的表達，這是一種高度敏感和高度特異的檢測技術，目前在實驗室研究中使用較廣，其缺點是操作較為繁瑣，測定結果只能代表細胞因子基因的表達，而不能代表活性細胞因子的水平。

細胞因子范文第2篇

【關鍵詞】 干細胞因子； 卵泡； 卵母細胞； 子宮內膜； 生殖醫學

1 干細胞因子在卵泡發育中的作用

1.1 干細胞因子是酪氨酸激酶受體的配體，具有促進細胞增值和分化的作用

動物實驗表明，干細胞因子能夠促進卵泡發育，對優勢卵泡生長有積極的影響。發育卵泡的顆粒細胞產生的干細胞因子對顆粒細胞-卵泡膜細胞相互作用很重要，并能促進卵母細胞發育。干細胞因子也能直接作用于卵泡膜細胞以促進細胞的生長和分化。干細胞因子促進卵泡膜細胞生長并刺激其分泌多種生長因子,使卵泡膜和顆粒細胞之間形成正反饋鏈。應用RT-PCR實驗分析顯示，牛的顆粒細胞表達干細胞因子，卵泡膜細胞表達受體酪氨酸蛋白激酶受體,酪氨酸蛋白激酶和干細胞因子對在體外維持卵母細胞存活與發育起重要作用,酪氨酸蛋白激酶/干細胞因子相互作用對于卵泡竇形成和類固醇激素生成很重要，調整卵母細胞的存活和細胞質成熟I代分離牛卵泡膜內層細胞，培養在游離血清中，當細胞在次融合狀態下以劑量依賴的方式來研究干細胞因子刺激卵泡膜細胞生長的活動方式，發現干細胞因子能刺激卵泡膜細胞分泌雄甾烯二酮產生。表明在卵泡發育中干細胞因子能夠直接刺激卵泡膜細胞生長和類固醇激素的產生。通過測定小、中、大卵泡的全部RNA，發現干細胞因子mRNA的穩定狀態水平在大卵泡的顆粒細胞中最高，在小卵泡中最低，在中等卵泡中居中。而酪氨酸蛋白激酶mRNA穩定狀態水平在大小不同卵泡中沒有差別。干細胞因子在大卵泡中的高表達提示干細胞因子對提高大卵泡、優勢卵泡的生長和類固醇激素產生可能很重要。在大的竇前卵泡中C-干細胞因子相互作用調節卵母細胞的細胞質成熟和卵泡膜細胞產生雄激素的量達到最大。干細胞因子還可能參與產生類固醇細胞之間的信息傳遞，干細胞因子作為顆粒細胞第一起源的生長因子，能夠在促性腺激素的存在下直接刺激卵泡膜細胞生長和雄甾烯二酮的產生，然而，其對卵泡膜細胞孕酮(P)產生在任何密度下均無顯著影響。干細胞因子顯著改變卵泡膜細胞功能，并且支持局部顆粒―卵泡膜細胞相互作用，因而在卵巢局部調節中具有重要作用。干細胞因子不僅是卵泡膜細胞功能的重要調節因子，且還能調節局部間質―上皮細胞的相互作用。牛的卵巢顆粒細胞可表達干細胞因子基因，而且牛顆粒細胞主要表達可溶性干細胞因子，而不是膜性干細胞因子。牛的大、中、小卵泡膜細胞和間質―上皮細胞一樣可表達酪氨酸蛋白激酶受體。已證明酪氨酸蛋白激酶mRNA在提純的膜細胞上表達，小、中、大卵泡均表達干細胞因子和酪氨酸蛋白激酶mRNA，表明干細胞因子和酪氨酸蛋白激酶基因表達貫穿于卵泡的發育過程中。干細胞因子刺激卵泡膜細胞生長對于卵泡內/外層卵泡膜的形成很重要，來源于顆粒細胞的干細胞因子可能對未分化的間質干細胞轉化為卵泡膜細胞募集在早期卵泡周圍有作用，因為在組織培養中干細胞因子顯著增加早期卵泡周圍卵泡膜細胞層數目，有利于卵泡健康發育。如果卵泡膜細胞層分解將導致卵泡發育異常。干細胞因子可刺激融合培養狀態下牛卵泡膜細胞產生雄甾烯二酮,干細胞因子直接刺激雄甾烯二酮產生而不是P產生，提示干細胞因子可能刺激卵泡期而非黃體期卵泡膜細胞的分化狀態。在正常卵泡發育中，較大卵泡不斷產生類固醇激素，發育為優勢卵泡，并被選擇排卵,干細胞因子mRNA在大卵泡的顆粒細胞中最高，提示干細胞因子對增加的卵泡膜細胞類固醇激素產量及優勢卵泡的選擇很重要。在卵泡發育過程中非正常的干細胞因子表達可以明顯改變卵泡功能。干細胞因子過分表達可致發育卵泡數目增多和雄激素水平增高，最終導致多囊卵巢綜合征。而低水平的干細胞因子可能影響優勢卵泡選擇或卵泡終末階段發育。顆粒細胞產生的干細胞因子在卵泡膜細胞生長和雄甾烯二酮產生中的作用提供一種反饋機制，其可能調節卵巢內間質一上皮細胞的相互作用。這些細胞一細胞相互作用對正常卵巢卵泡發育和生殖功能必不可少。

1.2 干細胞因子對體外受精-胚胎移植的影響

干細胞因子是由顆粒細胞產生并且其水平受促卵泡成熟激素調節，提示干細胞因子在人卵泡發育過程中很重要。干細胞因子的表達與卵母細胞質量或人卵泡發育是否有關仍不清楚。衡量卵母細胞質量的標準是卵母細胞的受精能力，卵母細胞和受精后胚胎發育結果是決定受精卵是否能成功植人在宮內的因素。干細胞因子在胚胎移植后獲得成功，妊娠患者的卵泡液中的濃度高于未妊娠者，提示干細胞因子可能是調節人類卵母細胞生長或卵泡發育過程中的一個重要因子，來源于子宮內膜細胞的干細胞因子，以自分泌/旁分泌方式，在胚胎移植過程中，通過受體酪氨酸蛋白激酶刺激胚胎滋養層細胞生長，在接受體外受精-胚胎移植的妊娠者的卵泡液中，干細胞因子濃度高于未妊娠者。干細胞因子對卵泡發育有著顯著的誘導作用。干細胞因子是參與原始卵泡發育的啟動因子。干細胞因子對優勢原始卵泡發育和啟動原始卵泡增值是必要的[3]。發育卵泡的顆粒細胞產生的干細胞因子對顆粒細胞-卵泡膜細胞相互作用很重要，并能促進卵母細胞發育[4，5，6]。干細胞因子也能直接作用于卵泡膜細胞以促進細胞的生長和分化[7]。卵泡液中較高濃度干細胞因子，表明干細胞因子與卵泡生長發育相關。總之，卵巢組織可產生干細胞因子，并通過自分泌和旁分泌等方式參與卵泡發育的過程，誘導、促進卵泡發育，刺激卵泡受體甾體激素產生，提高卵子的質量，從而提高體外受精-胚胎移植的妊娠率。表明干細胞因子是卵巢功能局部調節因子之一。對它的進一步深入研究，有助于不孕癥的治療。

1.3 干細胞因子水平對卵母細胞發育、受精和卵裂的影響

卵泡也是卵母細胞生長發育的微環境，其中含有許多對卵母細胞發育有重要影響的生物活性因子和激素，主要由血漿滲透液及卵巢局部產生的物質組成，其中含有許多對卵母細胞生長發育及受精卵發育潛能有重要影響的生物活性因子和激素[8，9，10]。發育成熟的卵母細胞是卵子受精的前提條件，而優質胚胎又是體外受精-胚胎移植成功的關鍵。動物實驗表明，干細胞因子對誘導原始卵泡發育、促進卵泡膜細胞增殖、竇狀卵泡類固醇激素生成及卵母細胞發育具有積極的促進作[11，12，13]。趙海波等通過卵泡液干細胞因子水平對卵母細胞發育、受精和卵裂影響的實驗研究結果顯示，成熟卵母細胞的卵泡液干細胞因子水平明顯高于未成熟者，說明卵巢自身產生的干細胞因子通過旁分泌和/或自分泌的方式，促進卵母細胞的生長發育[14]。卵母細胞發育的好與壞，直接影響其今后的受精及分裂過程。SMIKLE[15]等研究發現，在體外受精―胚胎移植者中，妊娠組卵泡液干細胞因子水平顯著高于未妊娠組。本實驗結果也顯示，受精卵子的卵泡液干細胞因子水平明顯高于未受精卵子，優質胚胎的卵泡液干細胞因子水平明顯高于劣質胚胎。所以，卵泡液中干細胞因子水平也間接影響著卵子的受精率和胚胎質量，較高水平的干細胞因子有利于卵子的受精和優質胚胎的形成。

2 干細胞因子在促超排卵中的關系

保證良好的促超排卵效果，是體外受精-胚胎移植工作成功的首要一步，如果卵巢反應差可能因得不到足夠數目的成熟卵子，影響臨床妊娠率。足夠發育的大卵泡是得到成熟卵子的前提，對如何提高促超排卵周期中卵泡發育的質量至關重要。 促超排卵中干細胞因子 與促卵泡激素 之間的相互作用，17位作者通過實驗表明，患者在用藥前的個人情況大多相似，血清中干細胞因子、促卵泡激素和黃體生成素水平在各反應組之間沒有差異，而卵泡液中干細胞因子、促卵泡激素和黃體生成素水平在高、中反應組中顯著高于低反應組，說明卵巢對促排卵藥物的反應差異并不在于血清干細胞因子濃度的高低，而主要在于卵泡自身。通過測定小、中、大卵泡的全部RNA，發現干細胞因子mRNA 的穩定狀態水平在大卵泡顆粒細胞內最高，在小卵泡中最低，在中等卵泡中居中［16］；高、中反應組中大卵泡數目多，產生的顆粒細胞和卵泡膜細胞數也多，人卵巢內顆粒細胞、卵泡膜細胞及間質細胞都能夠產生干細胞因子［17，18，19］；這種在大卵泡中的高表達提示干細胞因子對提高大卵泡、優勢卵泡的生長很重要。低反應組中大卵泡數目少，產生干細胞因子也少，以及需要促卵泡激素的水平刺激作用不及高、中反應組。促卵泡激素促使卵泡進一步發育，提供了產生干細胞因子的物質基礎，反過來，干細胞因子又能夠維持和調整卵泡發育，促進卵母細胞成熟。促卵泡激素促進卵巢多個卵泡生長發育的活動，受到卵巢內微環境的內分泌和旁分泌因子的調整，使卵巢內各種類型細胞之間相互作用，這些協同作用可以影響卵泡的發育、卵子成熟與排卵。近年來動物實驗研究認為［19，20］，干細胞因子和促卵泡激素之間的作用對動物卵泡生長發育有重要影響；干細胞因子和促卵泡激素之間相互調節、相互影響，彼此有促進作用。

3 干細胞因子與子宮內膜的關系

飼養層細胞在分離培養人胚胎干細胞過程中起著非常重要的作用，它能夠分泌一些生長因子，如干細胞因子、白血病抑制因子，這些因子可以有效的抑制胚胎干細胞的分化并促進使其增值。曲文玉等用人子宮內膜成纖維細胞作為飼養層，使人胚胎干細胞連續培養14代仍保持胚胎干細胞的所有特性，且子宮內膜傳至20代仍增值旺盛。在人子宮內膜基質細胞飼養層上生長的胚胎干細胞持續培養后，仍具有胚胎干細胞的特性，不影響他們顯著的發育潛能，維持正常的核型。子宮內膜細胞可作為體外培養胚胎干細胞的飼養層細胞，為將來臨床應用提供安全保障。

總之，干細胞因子與生殖醫學密不可分，它的進一步研究和發展，為臨床治療不孕癥和提高體外受精-胚胎移植成功率奠定基礎。

參考文獻

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細胞因子范文第3篇

1轉化生長因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)

TGF-β是一組多功能蛋白多肽,廣泛存在于動物正常組織細胞及轉化細胞中,以骨組織和血小板中含量最為豐富,其在骨形成和骨重建中起著極其重要的作用。TGF-βs能促進成骨細胞、軟骨細胞、間質細胞及前成骨細胞的增殖,同時能有效促進膠原合成及非膠原細胞外基質蛋白的表達;此外,TGF-βs能通過抑制基質金屬蛋白酶的合成和促進金屬蛋白酶組織抑制因子TIMP-1的合成抑制細胞外基質分子的降解[2]。

目前,對DO過程中TGF-β1的表達研究較為深入,多數學者認為TGF-β1在DO的整個過程中均有表達,只是表達水平不同;并且在不同時期表達部位也不同。Mehrara等[3]在鼠下頜DO實驗中發現,在潛伏期末TGF-β1表達較未手術組增加2.5倍,牽張初期增加到正常水平的3倍,并且在整個牽張期都保持高水平,直至固定期第4周末才恢復到正常水平;潛伏期及牽張早期TGF-β1主要在截骨線周圍的炎癥細胞、成骨細胞、間充質細胞、細胞外基質中表達增高;當繼續牽引,則高表達于活性成骨細胞、新生成的血管及細胞外基質中的膠原纖維;固定期TGF-β1表達僅局限于牽張間隙中的成骨細胞。Steinbrech等[4]發現TGF-β1隨牽張的進行而持續表達,并伴有骨基質的輕度礦化和膠原的活躍合成,而且TGF-β1及其受體的表達廣泛存在于皮質切開的骨邊緣、骨膜、周圍軟組織和炎細胞,以及中央纖維形成區的成纖維細胞和各區域的成骨細胞。陳勇等[5]也證實TGF-β1的表達貫穿下頜骨DO的全過程,且TGF-β1mRNA及其蛋白表達在牽引早期達到高峰,此后逐漸減弱,其不同時期表達部位與上述相似。表明牽張機械力刺激可促進TGF-β1的合成和分泌,推測其在牽引成骨中是成骨細胞遷移、分化、胞外基質合成、血管形成的重要調節因子。

然而,外源性TGF-β1對DO中新骨形成作用的研究結果不完全相同。Ozkan等[6]發現外源性TGF-β1增加牽張區新生骨組織的密度和強度;而Rauch等[7]在兔DO實驗中局部應用TGF-β1,結果對成骨量及成骨密度均無影響,僅增加了骨痂區的纖維組織。Seiadini等[8]在對脛骨節段性DO研究中,給予外源性重組人TGF-β,結果發現空白對照組和生理鹽水組骨明顯、連續、穩定、礦化均勻,而注入TGF-β組結果則相反,且隨劑量的增加軟骨和軟骨細胞數量減少,表現出對成骨起抑制作用。表明TGF-βs促進成骨作用在體內可能存在一精確的調節機制,如何利用外源性TGF-βs來促進DO中的骨組織的再生有待進一步研究。

2骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)

BMPs是一種疏水酸性糖蛋白,為TGF-β超家族成員之一,目前已發現的有BMPl-12,其作用具有濃度依賴性,低濃度時能促進細胞趨化和增殖,高濃度時能促進細胞分化和骨形成。Sato等[9]在鼠長骨DO實驗中發現,在截骨后4天,BMP-2、-4mRNA可在骨膜下未成熟骨痂中的軟骨前體細胞中檢測到;截骨后7天,BMP-2、-4mRNA恢復到術前水平;當牽引開始后,BMP-2、-4mRNA在纖維區的軟骨細胞,骨細胞和它們的前體細胞中明顯表達,約是骨切開時表達量的20倍,在整個牽引期維持較高水平;至固定期BMP-2、-4表達消失;而BMP-6、-7在DO中的表達情況與BMP-2、-4的表達不同,牽張初期,BMP-6僅在成軟骨細胞內可以檢測得到,隨著牽張的進行,BMP-6 mRNA表達漸降低,至固定期不表達;BMP-7在整個實驗過程中均未被檢測到。推測BMP-6在軟骨成骨階段可能發揮著一定的作用,BMP-7對其成骨無明顯影響。Rauch等[10]在對兔脛骨施行牽引成骨術時也證實,在潛伏期,BMP-2、-4表達增加,尤其在骨膜的間充質細胞和成骨細胞十分明顯;在牽引期,BMP-2、-4在成纖維細胞和軟骨細胞中表達持續升高;當牽引停止后,表達逐漸下降;但Rauch等發現BMP-7的表達與BMP-2、-4的表達同步,且表達的部位也基本類似。這可能與動物模型的建立、檢測手段和檢測試劑等因素有關。Khanal[11]進行牽引區新生骨組織免疫組化檢查發現,潛伏期BMP-2、-4, Smads 1、5、 8的表達僅輕微增加,牽引期表達顯著增加而進入固定期則逐漸減弱,認為BMP信號通路在將機械應力轉錄為生物學效果中起重要作用。

目前,已證實BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12均有促進新骨形成的作用,其中,以BMP-2促進新骨形成作用最強[12-18]。這些骨形態發生蛋白之間也可能存在協同作用,有文獻報道[19-20]重組BMP-2與BMP-7的聯合基因治療較單一應用其中一個更能促進成骨細胞分化成骨。但目前仍然不知道在牽引過程中產生的機械應力是如何激活機體產生相應生物學信號,尚需進一步研究。

3血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)

血管內皮生長因子也稱血管滲透因子(vascular permeability factor,VPF),最初是在腫瘤細胞分泌物中發現的,是一種糖基化分泌性多肽因子,具有維持血管正常狀態和完整性,增加血管通透性,誘導血管發生,并促進血管生成的作用。Warren等[21]在鼠下頜骨DO實驗中發現,在截骨后5～7天 VEGFmRNA的表達增加,在牽引1周左右達高峰,其表達貫穿整個牽引期及固定期,在牽引帶成骨細胞和內皮細胞上有高濃度的VEGF表達及強烈的血管生成反應。Byun[22]在狗單側下頜骨DO過程中檢測牽引區VEGF和其兩種受體Flt-1、Flk-1,發現牽引7天后牽引區成骨細胞、骨細胞和成纖維細胞中VEGF和其受體表達明顯增加,并在成骨細胞和成纖維細胞中維持14天。牽引28天后VEGF和VEGFR-1在成骨細胞中表達減弱,牽引區細胞中無VEGFR-2表達。在整個觀察期VEGFR-1明顯強于VEGFR-2的表達。Sojo[23]研究發現VEGF在牽引區新生成骨的前部靠近新生成骨的周邊的成骨細胞表達,而BMP-2、-4在肥大的軟骨細胞中表達。在同一標本中VEGF表達區域比BMP-2、-4表達區域離骨干遠,因此認為在成骨之前先有血管生成。Casap[24]在兔下頜骨牽引一側牽引區應用VEGF后發現應用VEGF部位的新骨生成明顯增加,因此,認為VEGF對新骨形成具有積極的作用。但Eckardt等[25]在對兔牽引動物模型中局部導入VEGF或VEGF拮抗劑,結果未發現對新骨形成有明顯影響。推測可能是因為機械牽張已刺激VEGF等生長因子的大量產生,導入的外源性VEGF或VEGF拮抗劑不足以發揮作用。另外,導入VEGF的時機、劑量及處理方式等都可能影響新骨形成。

4堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)

bFGF是一種25kD的多肽,包括至少19個密切相關的單肽,能促進細胞增殖,調節細胞分化,誘導軟骨和骨基質合成,與血管內皮生長因子協同作用,可促進血管再生,從而促進骨生成。Yeung等[26]研究bFGF在牽引過程中的表達中發現,在延遲期、牽引期、固定期bFGF均有不同程度的表達。在潛伏期,骨膜和骨髓質區的類纖維原細胞bFGF表達較明顯,新形成的成骨細胞也有bFGF的表達;牽引期,正在形成中的骨小梁成骨細胞bFGF有非常強的表達。在新形成骨小梁和纖維組織中,成骨細胞密度比相鄰區域明顯增高,bFGF的表達也更明顯。在固定期bFGF的表達比牽引期明顯減弱。劉人愷等[27]在山羊顱骨縫DO實驗中發現山羊顱骨縫在受到牽張力作用后bFGF有高水平表達,以牽張結束當天與第2周最為顯著,主要定位于成纖維樣細胞與成骨細胞,隨著固定時間的延長其表達逐漸減弱。

應用外源性bFGF可刺激骨痂形成,促進骨折修復和再生、移植骨愈合及骨缺損修復。Okazaki等[28]對兔脛骨行牽引成骨,牽引結束后,局部注入200μg bFGF,發現能促進牽引區骨形成。在牽引結束后2～5周,發現骨礦化量明顯增加,提示在骨牽引的固定期,外源性bFGF的應用可以縮短骨延長時間。將bFGF注入兔脛骨近端骺板后,血管由鄰近干骺端長入,加速骨前體細胞的侵入及軟骨骨化。朱永云等[29]將外源性bFGF注射到兔下頜骨牽引區,顯示牽引區新骨生成速度和數量高于對照組,認為局部導入外源性bFGF可能有促進下頜骨牽引成骨的作用,從而為縮短DO療程和減少牽引后復發回彈提供了一種可能的途徑。

5胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)

胰島素樣生長因子是一類對機體生長發育起重要調節作用并具有胰島素樣代謝效應的因子,目前已發現有IGF-1和IGF-2兩種異構體,分別為含有70個和67個氨基酸的單鏈多肽。IGF-1可由成骨細胞產生并以自分泌方式刺激成骨細胞增殖和基質合成,IGF-2的生理作用與IGF-1相似但作用較弱。Eingartner等[30]研究發現,在DO過程中IGF-l的表達呈現明顯的時間性。在牽引早期,血漿中IGF-1水平最先升高,其后牽引帶和周圍骨組織中IGF-1水平開始升高,這可能是由于受牽引力影響,周圍軟組織最先釋放IGF-1,導致血液中濃度升高的結果。而Meyer等[31]檢測牽引成骨時兔血清IGF-1含量發現,在骨切開后IGF-1血清濃度下降,但牽引期其濃度并無明顯升高。Yates等[32]研究IGF-1在豬下頜DO早期的作用,發現牽引早期骨膜中IGF-1升高明顯,牽引帶僅有少量礦化骨質形成;牽引結束后,IGF-1恢復到正常水平,牽引帶有大量礦化骨形成。說明IGF-1可能在牽引早期發揮重要作用。王志國等[33]在研究局部應用IGF-1對兔下頜骨DO的影響時發現,實驗組和對照組動物在X線片上無明顯差異;在組織學觀察上,兩組在牽張間隙內均見到有大量新生骨小梁生成,骨小梁排列方向與牽引方向一致;組織學分級評價結果顯示,實驗組新骨生成數量僅比對照組多2.4%,但統計學檢驗結果表明兩組未見顯著差異。Schrnid[34]研究發現只有在機體缺乏IGF時,外源性IGF對成骨細胞的分化與增殖才有促進作用。在骨切開術和隨后的牽引過程中,局部組織會產生較高濃度的IGF-1,這時候導入外源性IGF-1顯得多余。另外,聯合應用生長因子可能比單獨應用某一種生長因子更有效。

綜上所述,在牽引成骨術中牽張機械力能促進多種細胞因子的表達,其參與了牽引區新骨形成及礦化的調節,這為闡明牽引成骨的分子機制奠定了基礎;但這些細胞因子表達的時間順序及之間的相互作用還尚不清楚,此外,對于外源性細胞因子應用的時間、途徑及劑量還需深入研究。相信隨著對牽引成骨分子機制的研究深入,必將對臨床應用和研究產生重要的指導意義,推動牽引成骨的廣泛應用。

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細胞因子范文第4篇

健康網訊: 王紅英 　閆華 劉衛紅

【摘要】 輸卵管的微環境中含有細胞因子、粘附因子、蛋白質等多種物質，參與輸卵管生理功能、病理過程的調節，作用機制極其復雜。認識輸卵管微環境物質的變化，有助于防治輸卵管炎、輸卵管性不孕、輸卵管妊娠等疾病，提高體外受精成功率。

輸卵管是卵子攝取、和卵子最后成熟、受精、植入前胚胎發育的場所，在人類生殖過程中發揮著重要的作用。而輸卵管的微環境是其物質基礎，輸卵管病變導致輸卵管微環境中物質變化及功能異常，引起輸卵管性不孕、輸卵管妊娠發生，嚴重危害婦女的身心健康;現對輸卵管微環境中細胞因子、粘附因子、蛋白質的表達及作用做一綜述。 輸卵管連于子宮角兩側，細長而彎曲，由漿膜層、肌層、粘膜層構成，其中粘膜層由單層柱狀上皮和固有層組成，單層柱狀上皮包括分泌細胞、纖毛細胞和少數栓細胞;在近排卵時，上皮高度和分泌活動達到最高峰;排卵期雌激素水平升高，輸卵管蠕動推動由子宮角向輸卵管壺腹部移動，同時，峽部粘膜分泌增加，有利于的運行，并為提供足夠的能量;排卵后，輸卵管漏斗部拾卵，使之漂浮于輸卵管液中，、卵子在輸卵管壺腹部相遇、受精，受精卵在輸卵管的蠕動性收縮、纖毛的擺動及輸卵管液的作用下向宮腔運行;輸卵管的功能與微環境的周期調節是分不開的，輸卵管液是輸卵管微環境中最重要的部分，分別來自血漿滲液、輸卵管分泌物、子宮液、卵泡液，含有細胞因子、生長因子、粘附因子、特異性蛋白質、電解質、糖、氨基酸、多種酶等多種物質。輸卵管上皮細胞表達:雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR），其功能是在雌孕激素調節下進行的，它們對、卵子在輸卵管內的遷移、停留和經歷受精前的生理、生化改變及受精卵和胚胎的早期發育起著至關重要的作用 ［1］ 。 1 輸卵管微環境中細胞因子表達 1.1 白血病抑制因子（LIF） LIF是一種具有廣泛生物學功能的細胞因子，能調節胚胎干細胞、原始生長細胞、內皮細胞等細胞的生長和分化，LIF及其受體（ILFR）在女性生殖系統的表達，隨月經周期而變化，故認為與生殖密切相關。對于人體輸卵管組織進行研究表明:輸卵管上皮細胞和間質細胞表達LIF/ILFR，上皮細胞表達的強度大于間質細胞，輸卵管傘部表達較高，分泌期表達大于增殖晚期，LIF與LIFR在輸卵管組織中動態表達與子宮內膜的表達一致;在分泌期，輸卵管LIF表達增加，為受精卵、早期胚胎發育、轉運和成功種植創造了適宜的生理環境，對胚胎有營養和增強生存能力的作用。正常輸卵管LIF表達維持較低水平，培養的輸卵管片段在經過生長因子:表皮生長因子（EGF）、轉化生長因子（TGF）及炎癥因子:腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）等處理后，LIF在基質細胞表達明顯增強，推測LIF、LIFR表達增強可能與輸卵管炎、輸卵管妊娠有關。進一步研究發現:妊娠的輸卵管LIF表達明顯增高，推測輸卵管合成和分泌LIF在促進早期囊胚發育的同時，也有接受孕卵著床的作用 ［2，3］ 。 1.2 表皮生長因子（EGF） EGF具有多方面的生理功能，不僅與機體的物質轉運、糖代謝、細胞增殖、成纖維細胞的游走等有關，并且在生殖過程中起重要作用。輸卵管上皮細胞表達EGF、表皮生長因子受體（EGFR），隨月經周期變化，在增殖晚期、分泌期明顯高于增殖早期，這種周期性變化與雌激素水平相關，EGFR與配體EGF結合，通過旁分泌、自分泌機制刺激上皮細胞生長，參與卵子、在輸卵管的成熟及受精卵的早期發育;HB-EGF為EGF家族成員之一，與EGFR及硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）結合發揮生物作用，其作用EGF強，胚泡種植前期輸卵管峽部、壺腹部有HB-EGF的表達，可能也參與卵子、在輸卵管的成熟及受精卵的早期發育 ［4～6］ 。 1.3 腫瘤壞死因子α（TNF-α） TNF-α是一種單核細胞因子，主要由單核細胞、巨噬細胞產生，具有殺傷腫瘤、抗感染、促進細胞增殖的作用，TNF-α可激活局部單核細胞、巨噬細胞，并產生更多的TNF-α，在抗感染同時造成組織損傷;TNF-α及受體（TNF-αR）在輸卵管組織表達，隨月經周期變化，在卵泡期及排卵后高表達，黃體期未見表達，TNF-α可刺激輸卵管分泌前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、前列腺素F2αprostaglandin F2alpha，PGF2α），內皮素（endothelin-1，ET-1）和血管緊張素ⅡangiotensinⅡ，AngⅡ）等，這些物質可刺激平滑肌細胞收縮，與輸卵管內配子及早期囊胚的運輸有關。輸卵管感染沙眼衣原體（CT）、淋球菌等后，輸卵管液中TNF-α及TNF-αR升高，其中TNF-α與輸卵管損傷程度呈正相關，TNF-α分泌越多，則輸卵管纖毛損傷越嚴重，影響胚胎的運輸;輸卵管液中TNF-α濃度增高，影響配子及胚胎質量，故輸卵管炎易導致異位妊娠;異位妊娠患者血清中TNF-α顯著升高，TNF-α在異位妊娠中的作用機制有待進一步研究 ［7～10］ 。 1.4 白細胞介素8（IL-8） IL-8是白細胞趨化因子之一，參與炎癥反應的調節。在基礎狀態下，人體輸卵管上皮細胞和基質細胞表達IL-8不同，輸卵管上皮細胞表達IL-8mRNA高，基質細胞表達IL-8mRNA低，在IL-1α、TNF-α等前炎癥因子刺激下，輸卵管基質細胞IL-8的分泌增加，而上皮細胞IL-8的分泌無增加;此結果提示IL-8與輸卵管炎的病理損傷有關。宮外孕患者血清中IL-8水平較流產、正常妊娠者血清中IL-8水平高;提示IL-8與異位妊娠有關，其作用機制待進一步研究 ［9，10］ 。

1.5 干擾素γ（IFN-γ） IFN-γ具有誘導單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等細胞MHC-Ⅱ類抗原表達，參與抗原提呈和特異性免疫識別過程。IFN-γ參與抵抗輸卵管CT感染，在抗感染的同時促進輸卵管炎癥損傷和纖維化，IFN-γ介導的組織損傷機制可能為:IFN-γ使CT的57kD在局部組織堆積引起超敏反應，誘導輸卵管上皮細胞膜異常表達MHC-Ⅱ類抗原，呈遞給自身反應性T細胞，啟動自身免疫及刺激其它細胞因子（如:IL-1、TNF-α等）分泌，造成組織增生、纖維化 ［12］ 。 2 輸卵管微環境中粘附分子的表達 粘附分子廣泛分布于全身各組織，在胚胎發育、分化、正常組織結構維持、炎癥免疫應答，傷口愈合、凝血及腫瘤的發生、發展等諸多生理、病理過程中具有重要作用。輸卵管峽部、壺腹部和傘部粘膜上皮纖毛細胞表達整合素β 3 ，隨月經周期而變化:排卵后輸卵管峽部纖毛細胞整合素β 3 的含量顯著增加，為發揮“儲器”的功能，提供一個分子機制，壺腹部粘膜上皮纖毛細胞整合素β 3 含量排卵后顯著下降，此時輸卵管對胚胎的容受性下降，可降低或避免早期胚胎在輸卵管壺腹部植入，傘部粘膜纖毛分泌整合素β 3 排卵期升高，可能與傘部拾卵有關;正常輸卵管粘膜上皮基底膜、粘膜基質表達纖維粘連蛋白（FN），且增殖期大于分泌期，排卵前達到高峰，排卵后顯著下降，FN具有調節細胞生長、分化、促進細胞遷移、增殖和信息傳遞的功能，受雌、孕激素影響，雌激素促進其表達，孕激素抑制其表達，為防止輸卵管妊娠機制之一。在炎癥存在時輸卵管粘膜上皮基底膜、粘膜基質、血管內皮基底膜表達:FN、表皮細胞間粘附分子ECAM）、細胞間粘附分子（ICAM）、血管細胞間粘附分子（VCAM）等增加，提示:輸卵管炎時輸卵管粘膜高表達粘附分子可能為輸卵管妊娠的機制之一。Qin等研究發現:輸卵管妊娠3～9周的母胎界面有整合素和細胞外基質蛋白的表達，輸卵管妊娠5～7周達高峰，參與滋養細胞粘附與侵入 ［13～15］ 。 3 輸卵管微環境中的蛋白質及其作用 3.1 輸卵管特異性糖蛋白（OGP） OGP是輸卵管上皮細胞合成和分泌的糖蛋白，該糖蛋白在排卵期、受精期及早期囊胚發育階段的輸卵管內含量較高，與血清中雌、孕激素和黃體生成素水平有關，其對、卵子受精前的準備和早期囊胚的發育起重要作用。純化的人輸卵管蛋白與卵子共同培養時，可以看到其首先與卵透明帶結合，進而促進與卵透明帶結合，并且形成了輸卵管上皮與早期囊胚間的排斥力，保證早期囊胚在輸卵管內自如活動，再聯合輸卵管纖毛擺動、平滑肌收縮，防止異位妊娠的發生。狒狒的OGP與人的OGP具有高度同源性，但狒狒的OGP可以抑制人和卵子的結合，提示OGP在防止異種精卵結合，維持種屬特異性方面發揮作用。通過體內、外實驗對比發現:相同條件下，在體內OGP與卵透明帶（zona pellucida，ZP）結合明顯高于體外，在體內可能有其它物質參與OGP作用的調節，故體外研究OGP機能是受限的。Woo等研究發現:OGP作為輸卵管上皮細胞分化的標志物，在卵巢組織也有表達，且表達強度不同:在正常卵巢組織呈陰性表達，在卵巢良性、交界性漿液瘤及早期卵巢癌呈陽性表達，而在十二指腸、回腸、胰腺表達極微弱，在46種非婦科腫瘤呈陰性表達;提示:OGP可作為卵巢囊腫及早期卵巢癌的標志 物 ［16～18］ 。 3.2 輸卵管素（oviductin） 輸卵管素也是人輸卵管上皮細胞合成和分泌的蛋白質，可與結合，增加獲能效應和穿透能力，從而有利于與卵透明帶結合及頂體反應發生;并且與選擇性結合，對起到了篩選作用。輸卵管素與ZP和/或卵黃周隙（perivitelline space，PV）結合，卵裂開始后位于2-細胞、4-細胞、8-細胞和早期囊胚的質膜，增強早期囊胚發育能力，隨后逐漸降解。其中發育促進因子-1（DPF-1）容易遷移過卵透明帶，進入內層，呈點狀分布，與早期囊胚細胞膜牢固地結合，可克服早期囊胚體外發育過程中的發育停滯，支持體外卵裂的發生。持續腹腔注射DPF-1抗體，胚胎的植入率下降，提示DPF-1有克服早期囊胚發育停滯的作用 ［19～22］ 。 總之，輸卵管微環境中細胞因子、粘附因子、特異性蛋白質等對輸卵管功能起重要作用，并且受激素的影響，相互作用機制極其復雜;輸卵管病理變化、組織損傷可能導致輸卵管微環境中物質變化，引起輸卵管功能失常，導致輸卵管性不孕、輸卵管妊娠發生;對輸卵管微環境有待進一步了解，揭示輸卵管性不孕、輸卵管妊娠機制，為防治疾病、尋找更有效的避孕措施及提高IVF的成功率提供理論依據。

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細胞因子范文第5篇

【摘要】

目的: 觀察CRLF3蛋白在293T細胞中的表達及亞細胞定位， 并在大腸桿菌中表達和純化了重組CRLF3蛋白。方法: 將真核表達載體pCMVmycCRLF3瞬時轉染293T細胞， 轉染24 h和48 h后免疫熒光染色， 共聚焦顯微鏡觀察蛋白表達及定位; 構建原核表達質粒pGEX4T1CRLF3， 實現插入基因的融合表達， 經GST親合層析純化蛋白。結果: CRLF3蛋白在293T細胞中高效表達， 主要分布在細胞質和細胞膜; 成功構建了表達CRLF3融合蛋白的原核表達載體， 并在大腸桿菌內高效表達， 純化后得到Mr 約為74000的融合蛋白。結論: 在真核細胞中過表達的CRLF3蛋白主要定位在細胞質和細胞膜; 獲得了重組GSTCRLF3融合蛋白，為進一步探討CRLF3的功能奠定基礎。

【關鍵詞】 人細胞因子受體樣因子3 真核表達 原核表達 蛋白純化

[Abstract]AIM: Cytokine receptorlike factor 3 (CRLF3) is a novel gene cloned from K562 cell line. The aim of the current study is to observe CRLF3 expression and subcellular localization in 293T cells and to express and purify the CRLF3 fusion protein in E.coli. METHODS: The plasmid pCMVmycCRLF3 was transiently transfected into 293T cell. The expression and localization of CRLF3 protein was observed by immunostaining approach. CRLF3 was also cloned into pGEX4T1 vector. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed in E.coli and purified by GST affinity chromatography． RESULTS: CRLF3 protein was highly expressed in transfected 293T cells. CRLF3 protein was distributed in both cytoplasm and cell membrane. The GSTCRLF3 fusion protein was expressed as a Mr 74 000 protein and then successfully purified from E.coli cells. CONCLUSION: Overexpressed CRLF3 is a cytoplasmic protein that distributes in both cytoplasm and cell membrane in mammalian cells. The recombinant GSTCRLF3 fusion protein had been isolated and could be used for further antibody production and functional characterization.

[Keywords]CRLF3; eukaryotic expression; prokaryotic expression; protein purification

人細胞因子受體樣因子3（cytokine receptorlike factor 3， CRLF3）是一個具有I類細胞因子受體保守功能域的新基因。本實驗室從K562細胞中克隆出CRLF3[1]， 并提交NCBI GenBank（DQ298450）。CRLF3基因編碼區全長1317 bp， 編碼一個438個氨基酸的蛋白質。生物信息學分析CRLF3定位在17q11.2， 具有一個重要的結構域——FN3功能域， 這一結構域的C末端， 有一個RGD基序和I類細胞因子受體特有的WSXWS基序， CRLF3基因保守存在于多種生物中。對CRLF3的功能研究表明CRLF3 的過表達可以抑制細胞周期， 使細胞停滯在G0/G1期， 減少了進入S期的細胞， 其作用機制尚不明確。CRLF3可能是一種交通信號分子。本研究中， 我們將CRLF3基因在真核細胞中表達， 觀察了CRLF3在真核細胞中的定位， 并在原核細胞中表達和純化了其融合蛋白， 為進一步研究CRLF3的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 真核表達質粒pCMVmycCRLF3、 人胚腎293T細胞、 融合表達載體pGEX4T1、 E.coli DH5α、 E.coli BL21(DE3)均由本室保存; MEM、 胎牛血清購自Gibco公司; T4連接酶、 BamH I、 Xho I限制性內切酶、 λEcoT14I digest DNA marker、 蛋白maker均購自TaKaRa公司; 磷酸鈣轉染試劑購自碧云天生物技術公司; cMyc抗體購自Santa Cruz公司; FITC標記山羊抗小鼠IgG購自中杉金橋公司; GSTTag抗體購自Proteintech公司; Glutathione Sepharose 4B購自GE Healthcare公司; PCR引物由上海英俊生物技術公司合成; 其他均為國產分析純生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 293T細胞的培養和pCMVmycCRLF3的轉染 將生長狀態良好的293T細胞按1×105 cells/孔的密度轉移到放玻片的6孔板中， 在含100 mL/L胎牛血清的MEM培養基中培養24 h。轉染前30 min， 換新鮮的培養液2 mL， 分別取5 μg空載體質粒和pCMVmycCRLF3與磷酸鈣轉染試劑混勻， 室溫孵育20 min， 均勻滴加到6孔板內， 在50 mL/LCO2， 37℃培養箱內培養24 h和48 h。

1.2.2 免疫熒光染色 轉染24 h和48 h后， 棄去培養液， 多聚甲醛固定20 min， 5 mL/L TritonX100去膜10 min。含100 mL/L胎牛血清的PBS封閉1 h， 加入抗cmyc抗體（1∶100）室溫孵育1 h， PBST充分洗滌。加入FITC標記山羊抗小鼠IgG（1∶100）室溫孵育1～2 h， PBST充分洗滌。最后加入0.5 g/L DAPI(聯瞇基苯吲哚酸鹽)標記細胞核15min， 洗滌后500mL/L甘油封片， 共聚焦顯微鏡觀察結果。

1.2.3 pGEX4T1CRLF3融合表達載體的構建 以本室構建的pCMVmycCRLF3質粒為模板， 根據已測得的CRLF3的全長序列設計引物， 進行PCR擴增。上游引物序列為5′TATA GGATCC ATG GAG CTG GAG CCT GAG CT3′， 其中導人BamH I酶切位點; 下游引物序列為5′TATA CTCGAG CTA AAA CAC TAA CAC TTT CC3′， 其中導人Xho I酶切位點。PCR產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳回收， BamH I和Xho I酶切pGEX4T1載體和PCR產物， T4連接酶連接， 轉化DH5α感受態細胞。挑取單個克隆于5 mL LB(Amp+)培養液中培養過夜， 提取重組質粒， BamH I/Xho I酶切鑒定， 陽性克隆提交上海英俊生物技術公司進行測序分析。

1.2.4 GSTCRLF3融合蛋白的誘導表達和純化 將序列正確的重組表達質粒pGEX4T1CRLF3轉化宿主菌BL21（DE3）， 挑選5個單個菌落分別接種到5 mL LB（Amp＋）管中， 與37℃劇烈搖動培養過夜。每個菌落的培養物按1/100的比例接種到2個新鮮LB（Amp＋）管中， 37℃劇烈搖動培養4 h， A550達到0.6～0.8后， 向其中一管中加入終濃度為1 mmol/L IPTG， 另一管為未誘導的對照菌， 30℃繼續培養3～4 h。離心收集培養液各1 mL， 菌體沉淀以100 μL PBS重懸， 取10 μL樣品進行120 g/L SDSPAGE電泳， 考馬斯亮藍染色。以空載體轉化的大腸桿菌BL21(DE3)作為陰性對照， 檢測蛋白表達情況， 選出蛋白表達量高的菌落做種子。

1.2.5 融合蛋白的大量表達和純化 選取融合蛋白表達量高的種子菌， 以終濃度為1 mmol/L IPTG大量誘導菌液500 mL， 離心收集菌體， 1×PBS(pH7.4)懸浮菌體， 冰浴條件下超聲破裂菌體， 4℃、 120000 r/min離心30 min， 取少量上清和沉淀， 進行SDSPAGE檢測， 分析蛋白質在胞內表達形式。確定目的蛋白以可溶性形式存在后， 取超聲上清過裝有500 μL Glutathione Sepharose 4B凝膠的純化柱， 以1 L的PBS淋洗， 去除雜蛋白， 最后用1倍柱體積的GST洗脫緩沖液 (50 mmol/L TrisHC1 pH8.0， 10 mmol/L還原型谷胱甘肽)洗脫目的蛋白。

1.2.6 Western blot鑒定融合蛋白 取純化的蛋白進行120 g/L丙烯酰胺凝膠電泳， 電轉移至硝酸纖維素膜上， 50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜。加入GST抗體（1∶2500）室溫孵育2 h， TBST充分洗滌， 加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（1∶5000）， 室溫孵育1 h， TBST充分洗滌， ECL顯影。

2 結果

2.1 共聚焦顯微鏡觀察結果 采用共聚焦顯微鏡觀察CRLF3蛋白在293T細胞中的表達及分布。以轉染pCMVmyc空載體的293T細胞為本底對照， 40倍物鏡下觀察可見CRLF3在真核細胞中高效表達。油鏡下觀察可見瞬時轉染24h后的CRLF3均勻分布在胞質中; 瞬時轉染48 h后的CRLF3分布在細胞質和細胞膜上（圖1）。

圖1 轉染24 h和48 h后免疫熒光染色（略）

Fig 1 Immunostaining of CRLF3 on 293T cell transfecting pCMVmycCRLF3 after 24 h and 48 h(×1000)

A: Antimyc after 24 h; B: DAPI; C: Merged; D: Antimyc after 48 h; E: DAPI; F: Merged.

2.2 重組質粒的構建和鑒定 以pCMVmycCRLF3質粒為模板擴增的產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 得到一條特異條帶， 與目的片段1318 bp的大小位置相符（圖2）。重組質粒pGEX4T1CRLF3采用BamH I/Xho I酶切鑒定（圖3）， DNA測序分析， 證明插入序列是目的序列， 且與融合表達載體的讀碼框相符。

圖2 CRLF3 PCR擴增產物（略）

Fig 2 CRLF3 product of PCR

1: CRLF3 PCR product; 2: λEcoT14I digest DNA marker.

圖3 重組質粒pGEX4T1CRLF3的酶切鑒定（略）

Fig 3 Restriction analysis of recombinant plasmid pGEX4T1CRLF3

1: λEcoT14I digest DNA marker; 2: pGEX4T1CRLF3 digested by BamH I and Xho I.

2.3 重組蛋白在大腸桿菌BL21中的表達和純化 SDSPAGE結果顯示， 轉化空載體的對照組BL21 IPTG誘導后， 在Mr 26000的位置上出現1條濃集帶; 轉化pGEX4T1CRLF3重組質粒的BL21 IPTG誘導后， 在Mr約為74000的位置上出現1條較濃集而且表達量受IPTG誘導的蛋白條帶， 說明插人的融合基因已經在大腸桿菌中表達， 但在這一位點上也有內源性基因的表達。超聲破碎菌體并離心后， 分別取上清和沉淀進行SDSPAGE電泳檢測， 顯示目的蛋白主要在上清液中， 它在菌體內主要以可溶性形式存在; 利用Glutathione Sepharose 4B親和純化目的蛋白， SDSPAGE分析得到1條Mr為74000的單一條帶。灰度掃描分析， 純度達到85%（圖4）。

圖4 SDSPAGE分析融合蛋白的表達及純化（略）

Fig 4 SDSPAGE analysis of expression and purification of fusion protein

1: Protein maker; 2: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG-）; 3: pGEX4T1 transformed BL21（IPTG＋）; 4: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG-）; 5: pGEX4T1CRLF3 transformed BL21（IPTG＋）; 6: Supernatant; 7: Sediment; 8: Purified fusion protein.

2.4 Western blot檢測 用抗GSTtag多克隆抗體對純化的GSTCRLF3融合蛋白進行Western blot檢測。抗GST的抗體可以檢測到Mr為74000的CRLF3融合蛋白條帶， 提示純化后的蛋白為所需要的GST融合蛋白。

3 討論

CRLF3基因定位在17q11.2， 鄰近NF1 (neurofibromatosis type 1)基因， 在神經纖維瘤患者中， CRLF3基因常與NF1一起缺失。神經纖維瘤的遺傳學致病機制是由于NF1基因的微缺失， 其缺失的范圍至少包括11個基因， CRLF3為其中之一[2， 3]。NF1基因是一種抑癌基因[4]， 而缺失基因簇中的其他基因功能尚不清楚。對CRLF3的生物信息學預測， 它不具有跨膜結構域， 沒有核定位信號與細胞器定位信號， 是一種胞質蛋白質。本研究中通過在真核細胞中表達CRLF3， 可見CRLF3轉染24 h后主要定位在細胞質， 轉染48 h后， 則在細胞質和細胞膜上均有分布， 提示在真核細胞中過表達的CRLF3是一種胞質蛋白質， 充分表達后向細胞膜遷移。CRLF3含有FN3功能域和RGD基序， 含有這樣結構域的分子大部分具有介導細胞間黏附和相互作用的功能， 而且主要以受體和分泌形式存在[5]。具有RGD基序的胞質蛋白CRLF3是否也具有介導細胞間黏附和相互作用的功能， 或在細胞質中發揮通訊分子的作用，有待進一步探討。

本研究中， 我們利用可誘導表達的大腸桿菌表達系統， 以原核表達質粒pGEX4T1為載體表達出GSTCRLF3的融合蛋白， 進一步應用GST親和層析法有效分離得到純化的目的基因CRLF3的融合蛋白[6]， 為下一步制備抗CRLF3的多克隆抗體， 更好的研究CRLF3的功能創造條件。

參考文獻

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