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楊萬里的詩范文第1篇

原詩：坐看深來尺許強，偏於薄暮發寒光。半空舞倦居然嬾，一點風來特地忙。

落盡瓊花天不惜，封它梅蕊玉無香。倩誰細橪成湯餅，換卻人間煙火腸。

譯文：坐看落雪，其深已一尺有余，更在這黃昏時分發散著縷縷寒光。雪花在半空中舞到疲倦，顯得輕柔無力，然而些許微風吹過，又翩然起舞。上天渾然不憐惜，讓瓊花似的雪落盡，將梅蕊、海棠的封存在冰雪之下，花香杳無。有誰能將這高潔的雪做成湯和餅，來滌蕩人們滿是人間煙火的腸胃。

（來源：文章屋網 ）

楊萬里的詩范文第2篇

在此對其賠償金額之三次變數暫且不提，單說說這5萬元的獎勵吧。

既是獎勵，自然有獎勵的理由。在管理心理學中，獎勵是對人的某種行為給予肯定與表揚，使人保持這種行為。那么，參照鐵路系統對于罹難者的獎勵，大抵可以歸納為對罹難者家屬的某種行為給予肯定與表揚了。然而，這似乎并不符合邏輯。罹難者家屬的什么行為引發了鐵路系統的肯定繼而表揚呢？且肯定與表揚之下，讓惜金如命的鐵路系統不惜以5萬元的“重金”進行獎勵呢？

罹難家屬幫忙救人了？并不是。罹難者幫鐵路系統發現了安全隱患，繼而獎勵其家屬？說不通。那么，可能存在的原因便是：家屬提前簽訂賠償協議，使得鐵路系統在此次事故中應該承擔的責任變小了，其在事故中的錯誤造成的整個系統的壓力變小了，總而言之，鐵路系統在事故中最重要的麻煩變少了，這就需要獎勵。

當然“獎”遠遠不夠，尚需要“勵”！不僅此次不要惹太多麻煩，下次、下下次，以后更多次，（我當然希望這是最后一次，但是，您信嗎？）不要再發生此類事故之后給當事單位惹麻煩，這就是獎勵機制，通過這種獎勵來減少壓力、解脫自己。這不能不說是利用人最寶貴的生命來換取“平安符”的丑惡做法，表面是增加了賠償，實則是輕視生命、不尊重生命的表現。其用心之險惡，“獎勵”二字可見一斑！

獎勵這個詞，自然不是鐵路系統隨口說出來的，既然已經知道其獎勵背后的卑劣目的，自然就知道了其選用這個詞的時候是怎樣的心領神會：“這是怎樣的一個詞啊。感謝倉頡先生，造出了這樣兩個字，太貼切了！”這個目的的存在，實在讓他們想不到還有哪個詞比“獎勵”更能真切地體現他們的處境，以及急于擺脫這種不利處境的迫切心情。

楊萬里的詩范文第3篇

關鍵詞：工商管理專業；人才培養模式；監控體系；實踐基地

中圖分類號：G642 文獻標志碼：A 文章編號：1002-2589（2016）03-0192-02

隨著我國高等教育規模不斷擴大，高校學生毛入學率的不斷提高，生源質量也不同于精英教育階段，高等教育已經進入了大眾化教育階段，給高校發展帶來機遇的同時，提出了更嚴峻的挑戰。《國家中長期教育改革和發展規劃綱要（2010-2020年）》（以下簡稱《綱要》）[1]中明確指出：“提高質量是教育改革發展的核心任務，樹立以提高質量為核心的教育發展觀，注重教育內涵發展，鼓勵學校辦出特色、辦出水平，出名師，育英才?！币虼?，在實際教學過程中，如何實現分類分層教學，如何提高人才培養質量，形成具有本校特色的人才培養模式，是擺在工商管理專業教師面前的一項艱巨任務。

一、工商管理專業人才培養模式的現狀

（一）實行彈性學分制

這種人才培養模式主要是針對課程設置而進行的改革，學生可以在八年時間里修完專業要求的所有課程而畢業[2]。這種模式在一定程度上緩解了過去課程設置的弊端，增強了學生選課的自主性，學生可以根據自己的實際情況和興趣愛好自主選擇課程。但是，有很多學生為了盡量早畢業，用大學三年的時間把大學四年要修的課程都修完，這就造成了學生一周之內需要上大量的課程，影響了學生對于知識的消化和吸收，同時也影響了學生的全面發展。

（二）分類分層人才培養模式

這種人才培養模式主要針對學生對專業知識的學習而言[3]。學生進入專業課學習階段后，學?？梢愿鶕W生的自身特點和興趣，實行分類、分層教學，設置不同的專業課程模塊供學生來選修，也可以把專業方向細化為不同的模塊，比如人力資源管理、物流管理、生產與運作管理、創業管理等，學生可以根據自己的喜好、優勢等情況選擇相關模塊的課程，通過學習，使學生在某一方面具有較深厚的造詣。

（三）“3+1”人才培養模式

這種人才培養模式是近年來比較盛行的模式[4]，即要求學生在大學前三年主要從事專業學習，在大學的最后一年從事社會實踐。這種模式的優點就是能夠使學生有足夠的時間從事社會實踐，但是學生要用三年時間將四年的課程學完，一定程度上增加了學生的學習壓力，而且如果學校沒有校外實踐基地，讓學生自己從事社會實踐，就必然會導致學生盲目地到企業打工掙錢，從而與專業培養目標相悖。

（四）“3.5+0.5”人才培養模式

這種人才培養模式也受很多高校所推崇，即要求學生用三年半的時間學完大學所有課程，最后半年通過社會實踐來撰寫畢業論文。這種人才培養模式既能夠讓學生有足夠的時間從事專業知識的學習，又能夠抽出一定的時間讓學生從事社會實踐。但是如果專業課程設置不合理也必然無法實現專業人才培養目標。

（五）“1+2.5+0.5”人才培養模式

這種人才培養模式是在高校專業大類招生情況下實施的，即按照大類專業來招收學生，在大學一年級不分具體專業，到大學二年級學生根據自己的興趣可以任意選擇大類專業下的具體專業進行學習。這種培養模式的優勢就是能夠讓學生通過一年的學習，再根據對自身、專業、社會人才需求的認識，重新進行專業的選擇和定位。

二、工商管理專業人才培養模式存在的問題

北方工業大學是一所北京市教委主管的地方院校，目前工商管理專業本科有3個班，專升本有2個班，每一屆學生有170人左右。目前，工商管理專業的人才培養模式已逐步從“3.5+0.5”模式向“1+2.5+0.5”模式轉化，但從人才培養的過程和培養目標來看，仍然存在一些問題。

（一）培養目標與人才培養過程脫節

學校工商管理專業培養學生的目標是把學生培養成既懂技術又懂管理的復合應用型人才。但是，在人才培養過程中，不僅學生的管理理論素養沒能得到提高，學生的實踐能力也沒有得到鍛煉。學生在選擇就業單位時，往往感到無所適從，達不到用人單位的高標準、嚴要求，培養過程質量與培養目標嚴重脫節。

（二）個別專業課程設置不合理

一般情況下，在大學學習階段，通識課、專業基礎課應當盡量安排大學一、二年級，專業必修課安排在大學三、四年級。學校工商管理專業的課程設置中，部分課程設置不合理，有個別專業課程安排在了大學一、二年級，而且還呈現過度娛樂化，這勢必會讓學生與其他課程進行對比，從降低了對其他課程學習的積極性。

（三）校外實踐基地不健全

學校校內的實踐教學內容已經非常豐富，但對于校外實踐基地的建設一直落后于同類院校，無法達到教學大綱規定的實踐教學目標。因此建立校外實踐基地對于工商管理專業學生的培養來講顯得非常重要，也是提高學生實踐能力的有力保障。

三、工商管理專業人才培養模式的完善

（一）完善人才培養監控體系

通過對人才培養方案的完善修訂，建立健全各類人才培養監測點的考核標準，明確培養計劃中專業評價各監測點的內容、目標以及人才培養質量考核的標準和方法，具體體現學校的專業建設特色和專業評價體系的有效實施[5]。在人才培養過程中，應當建立配套的監測點和監控體系，完善工商管理專業的人才培養監控體系，如圖1所示。

學校和學院可以通過制訂人才培養質量標準、實施方案和相關規章制度，建立起高效優質的人才培養保障、服務和支撐體系，確保人才培養質量監控有效實施，保障人才培養方案的順利實施。

（二）突出特色，注重質量，提高人才培養質量

工商管理專業是學校的老牌專業，從學校到學院都非常重視學科建設和人才培養模式的改革。為了提高學生的實踐能力，實踐教學的比重在逐步增大，但是校外實習基地的建設還一直不夠健全。因此，加強校外實習基地建設對于突出人才培養特色，提高人才培養質量有著重要的意義。在現有教學實習的模式下，可以逐步與一些大型國有企業建立長期合作關系，定期派學生到企業去實習、鍛煉，使學生真正把所學理論知識與企業實踐結合起來，從實踐中發現問題，再結合所學知識解決問題，實現理論與實踐的有機結合，從而更加突出北方工業大學工商管理專業的人才培養特色。

（三）構建人才培養模塊，優化人才培養方案

結合學校工商管理專業特色和社會需求，構建人才培養特色模塊。在加強理論教學（通識課+基礎課+專業課）的同時，注重實踐教學的質量和效果，聯系幾家大型企業作為學生校外實踐基地，在實踐中構建“1+2+1”人才培養模塊或“1+2+0.5+0.5”人才培養模塊，加強課堂教學、實踐教學、企業實踐的密切聯系。

1.“1+2+1”人才培養模塊

在學校工商管理專業大類招生背景下，構建“1+2+1”人才培養模塊勢在必行。在這種人才培養模塊中，校外實踐基地的建設顯得尤為重要。學生在大學期間除了學習專業知識，要用最后一年的時間去企業實習和鍛煉，在實踐中檢驗所學專業知識的掌握程度，發現問題，及時補救。

2.“1+2+0.5+0.5”人才培養模塊

這種人才培養模塊也是符合學校工商管理專業發展和社會需求的。學生在大學期間除了學歷理論知識外，在最后一年中用半年時間在企業實習，再用半年的時間結合企業實踐撰寫畢業論文，從實現理論與實踐的有機結合。

3.優化人才培養方案

結合人才培養模塊，優化人才培養方案，是實現工商管理專業人才培養目標的重要途徑。制訂新的人才培養方案應著重從課程設置、專業實習、課程設計、校外實踐等幾個方面來進行改進。首先課程設置應從學生實際和學校的人才培養目標出發，科學、合理地制訂學生在三個階段的課程，在第一階段（一年級）應著重通識課程的學習，把數學、外語、專業基礎課的學習作為重中之重；在第二階段（二、三年級）著重專業基礎課和專業必修課程的學習，在第三階段（四年級）重點放在學生的實踐方面，努力提高學生的實踐能力。其次，專業實習可放在每年的寒假和暑假，學校和與企業達成合作意向，組織學生進入企業調研和實踐。課程設計課程的設置根據課程特點和專業培養目標而制訂。校外實踐基地是專業實習和畢業實踐的重要保障，學校應當把建設校外實踐基地作為人才培養的重中之重。

四、結語

工商管理是一門實踐性非常強的學科，該專業的人才培養目標應該定位于著重培養學生的實踐能力、協調溝通能力和創新能力。當前，學校工商管理專業正面臨著前所未有的挑戰和發展機遇，為實現人才培養目標，應堅持以市場需求為導向，以學生為中心，抓住重點，突出特色，重點培養學生的學習能力、應變能力、適應能力、人際溝通、協調和創新能力，提高學生發現、分析和解決實際問題的能力。

參考文獻：

[1]顧明遠.國家中長期教育改革和發展規劃綱要（2010-2020年）[M].北京：北京師范大學出版社，2010.

[2]程春.論高校彈性學分體質的創新與發展[J].知識經濟，2013（24）：153.

[3]梁川.基于動機激發理論的分層教學模式的實踐研究[J].遼寧高職學報，2015，17（8）：40-42.

楊萬里的詩范文第4篇

（內蒙古師范大學，內蒙古 010020）

【摘　要】隨著新媒體的急速發展，媒介融合日益成為社會傳播的焦點，2015年央視春晚便是這一融合的新生兒。本文分析媒介融合的內涵，以央視2015年的羊年春晚為例，探討媒介融合的價值所在。

關鍵詞 傳統媒體；新媒介；媒介融合；融合價值

伴隨著新型媒介技術的勁爆發展，舊的傳媒格局迅速被新的媒介系統侵蝕，在這種情況下，媒介融合的進程表現得緊鑼密鼓，短時間內，形成蔚為大觀之勢。2014年8月18日，中央全面深化改革領導小組第四次會議審議通過了《關于推動傳統媒體和新興媒體融合發展的指導意見》，主席特別強調，要著力打造一批形態多樣、手段先進、具有競爭力的新型主流媒體，建成幾家擁有強大實力和傳播力、公信力、影響力的新型媒體集團。媒介融合被提升至國家層面，映射出它的重要戰略意義。

1　媒介融合的內涵解析

媒介融合并非新近幾年才出現的樣態，它是與人類文明史始終相隨的常態過程，只是每個歷史時期融合的速率大相徑庭。近年來，率先由西方傳媒業界提及的媒介融合，再一次成為全球新聞傳播界所關注的對象。那么，何為媒介融合，它的內涵究竟怎樣呢？

“媒介融合”（Media Convergence）這一概念最早由美國馬薩諸塞州理工大學的Ithiel De Sola Pool教授在1983年出版的《自由的科技》一書中論及。他認為：數碼電子科技導致涇渭分明的傳播形態聚合，致使各種媒介呈現出多功能一體化的趨勢。由于時代的局限性，他對媒介融合的定義還停留在傳統傳播介質的視域內。時至今日，媒介融合的定義仍未達成共識，專家學者的詮釋日趨多元、深邃，給人以啟迪。美國學者Andrew Nachison認為，“媒介融合應是印刷的、音頻的、視頻的、互動性數字媒體組織之間的戰略的、操作的、文化的聯盟”；道爾（Doyle）認為媒介融合是指電子通訊技術、計算機技術和媒體的融合；詹金斯（Jenkins）詳細闡述了媒介融合的五種形式：技術融合、經濟融合、社會或組織融合、文化融合和全球融合；美國西北大學教授Rich Gordon對媒介融合進行了詳細地探討和劃分，稱融合應包括所有權融合、策略性融合、結構性融合、信息采集融合和新聞表達融合。與此同時，國內學者也紛紛進行了熱烈探討，清華大學熊澄宇教授認為，媒介融合是指“所有的媒介都向電子化和數字化這種形式靠攏，這個趨勢是由數字技術驅動的，并在網絡技術的推動下變得可能?！敝袊嗣翊髮W蔡雯教授將媒介融合定義為，“在以數字技術、網絡技術和電子通訊技術為核心的科學技術的推動下，組成大媒體業的各產業組織在經濟利益和社會需求的驅動下通過合作、并購和整合等手段，實現不同媒介形態的內容融合、傳播渠道融合和媒介終端融合的過程?！?/p>

學者們對媒介融合的定義均有可取之處，卻因立足的媒介文化環境和媒介研究視角不同，顯得媒介融合定義難下定論。筆者認為，媒介融合涉及到的相關系數較為龐雜，但“它肇始于技術創新，加速于制度創新，深化于市場創新，最終表現為產品創新”的規律是不變的。因此把握好媒介融合的內涵比下定義更為合理。有鑒于此，筆者將媒介融合的內涵囊括于三個維度之下：

一是，傳播介質方面的融合。介質作為一種有形的物質存在，是承載傳播信息和觀念的基礎工具，媒介融合就是要將報紙、電視等傳統傳播介質與借助網絡技術發展起來的新型媒體技術相融合，實現“你中有我，我中有你”，優勢互補的全媒體平臺。

二是，業務經營方面的融合。新老媒介的融合必將沖擊傳統的業務操作與媒介經營，媒介融合要求傳媒業者必須提升自身素質，學會并掌握融媒體下的新聞采寫技能、攝影攝像技能、不同媒介的編輯與傳輸技能等，還得樹立融媒體的工作視眼，將工作實踐立足于媒體融合大格局之下。媒介融合也改變著經營管理方式，機構的兼并與重組、資本的運作與經營等具體操作，都需要依據媒介融合的要求進行整合與聯動，以破除獨立經營的弊端。

三是，價值理念的融合。媒介融合不僅要改變原有媒介形態，催生新的媒介形態，還要踐行融合理念，而不是簡單相加。媒介融合需要一個漫長的磨合過程，是系統性工程，它有自身發展規律，需要學界和業界共同探討與摸索。這一過程中，需要我們改變定勢思維，呼喚制度與理念創新，使不同媒介與融合大勢相匹配，真正產生融合實效。

2　媒介融合的成功典范：2015年央視羊年春晚

央視春晚歷經33年的發展，已經成為中國百姓春節不可缺少的年度盛宴。三十多年來，央視春晚始終緊隨時代脈搏，不斷推陳出新，給觀眾留下了深刻的印象。近年來，在新媒體巨浪的卷攜下，央視春晚同其它傳統媒體一樣，受眾受到瓜分，收視率連年下跌。然而，2015年央視春晚卻不拘一格，改頭換面，充分將多媒體炫酷科技嫁接到聯歡晚會，在媒介融合大潮下成功涅槃。

借力新型媒介，創新媒介產品，強化品牌文化。媒介融合是信息技術不斷創新與應用的結果，它沒有終極目標，只有不斷地推進與演化，其特征多趨向為：“多媒體信息在同一平臺上的能量互補；各類媒體之間的信息能量交換；信息傳播者與信息接受者之間的信息能量交互；外部產業對傳媒業的能量支持。”央視春晚作為一檔品牌節目，過去幾十年間，缺乏品牌形象意識，被業界笑稱只會“聯歡”的節目。2015年羊年春晚一反常態，有效地將新媒體應用嵌入熒屏，并借助多維媒介科技，大力開發媒介產品，形成了宣傳曲、宣傳片、吉祥物等一系列媒介產品，使觀眾生動地了解春節與春晚的同時，也助推了自身品牌文化的傳播。特別是微信紅包的發放，以及春晚首個吉祥物“陽陽”的開發，不僅傳遞了傳統春節文化，寄寓了新年愿望，還極大地躍動了觀眾的欲望與激情，更重要的是通過媒介產品研發，潛移默化地塑造了春晚欄目形象，增強了品牌的識別度。

拓展傳播渠道，爭取市場份額，擴大欄目影響。多元傳播渠道的共融與多維聲像技術的集成應用是媒介融合帶來的最顯著變化。這種變化看似新媒體對老媒體進行沖擊，實質是新老媒體的一種交混與更新、優化與培植，關鍵在于媒體順勢而為，傳播渠道和方式的拓展與運籌。以往央視春晚只在央視、衛視頻道，以及個別海外媒體播出，而今年破格將直播權授予像愛奇藝這樣的視頻網站，并加深了與微信、微博、客戶端、You Tube等社交媒體的合作，呈現出多渠道融通與聯動的繁榮，擴大了央視春晚的聲勢影響。索福瑞數據統計顯示：2015年春晚的熒屏總收視率為29.6%，雖不及去年，但人均收視時長較往年大幅增加，是2014年的2倍有余，達155.55分鐘/人。央視春晚欄目組為了擴大海外聲勢，還特意邀請美聯社、路透社等國際媒體參加首次春晚海外推薦會，并與TWITTER、FACEBOOK等海外社交平臺合作，開展2015年春晚預熱活動。此外，在海外播發宣傳片和廣告、組織春節活動等方面也做了巨大努力，有效擴展了春節文化和央視春晚的傳播渠道，獲取了更多的“注意力”，而這種“注意力”正是媒介市場化時代的制勝法寶。

更新價值理念，增強受眾體驗，提升春晚價值。媒介技術的發展使信息傳播由大眾傳媒的“點對面”向傳媒分眾的“點對點”過度，媒介受眾由以往的單向閱聽的被動角色轉變為傳媒為其量身定制資訊、娛樂服務的用戶。這種傳媒趨向直接引發社會階層和文化需求的“碎片化”，“使原有的社會階層經由社會觀念達到集體行動的邏輯發生了某種斷裂，社會觀念的利益化和個性化傾向明顯”。為了適應“碎片化”、“個性化”的時代要求，媒體只有揣度與滿足消費者的需求，轉變“傳者至上”的價值理念，才可能獲得受眾認可。2015年羊年春晚之所以獲贊，就是欄目組能夠站在媒介受眾的角度去思考節目設置，從而較好地滿足了受眾需要。春晚期間，央視通過微信“搖一搖”平臺，與觀眾互動總量超過110億次，微信祝福在185個國家之間傳遞了約30000億公里，相當于往返地月370余萬次。再如“曬曬全家?！?，觀眾通過新型媒介，將全家福上傳到央視演播現場，直接拉近了與春晚現場的距離，有一種賓至如歸的親切感。這樣的媒介創制，不僅激發了全民跨屏互動的熱情，傳遞了新年夙愿，還把“溜走”的觀眾再次拉回熒屏，提升了央視春晚的價值，堪稱傳統媒體攜新媒體的一次華麗亮彩。

3　媒介融合的意義

新媒體攜領傳統媒體奏演的融合之勢如火如荼，它刷新了媒介發展歷史，催生了新的社會變革力量，改變著社會的多維發展，特別是在社會互動、媒介內容、媒介運營模式等方面，凸顯出巨大的融合價值。

有利于打造無界的社會互動空間。媒介融合肇始于技術創新，而媒介技術發展帶來最顯著的變化就是信源泛化和信息傳播的裂變呈現，這些新的信息傳播特點，改變了過去獨占信息的權力中心，自上而下的線性傳播變得岌岌可危，民主化、扁平化、去中心化的無界信息傳播成為潮流。媒體融合大勢之前，傳統媒體掌握著信息的主動權，信息傳播和渠道選擇受制于國家利益和精英階層，公眾無法看到信息的天然狀貌。新媒體的出現，打破了信息的絕對壟斷，呈現出多元化的傳受趨勢，公眾對信息公開透明和主動傳播的欲望加強，更重要的是，他們借助網絡互動平臺，將長期壓抑的情緒釋放出來，崩發出他們對社會的長期關切。媒介融合大勢正迎合了他們參與社會、重置話語權的期望，有效連接了“上下層”的平等對話，緩解了社會氣壓。

有利于開發高品質的媒介傳播內容。傳統媒體形態比較單一，技術手段應用也相對有限，新型媒介技術的開發，使媒介形態變得繁華，為內容、產品、技術、管理、平臺和人才的一體化提供了先決基礎，媒體融合可以將擁有高品質內容的傳統媒體與高技術的新型媒介進行統和，對傳媒內容進行多角度、全方位的二次加工、處理和采編，進而滿足各類人群的個性化需求，增強了他們的媒介體驗，從而有效地提升了媒介信息產品的檔次和品味，最大地實現傳播效果。

有利于推進高級的媒介運營模式。新媒體技術的應用使本來清晰的媒體邊界變得模糊不堪，媒介市場的激烈競爭，迫使獨立運作的媒體企業與其它媒體合作，重新劃分利益地盤，帶來組織結構和營銷方式的調整。媒體融合的好處之一就是讓不同媒體之間相互借力，揚長避短，共同架構高效的媒介組織與營銷方略。中央電視臺的電視技術、電視設備和技術應用都走在了世界前沿，在向新興主流媒體轉型的過程中，發現自己有內容研發和節目生產的優勢，但在多屏傳播上存在欠缺，因此電視臺有針對性地改進了組織管理體系和產業經營體系，如研發了全流程的采編播體系，建立起了央視影音、央視新聞、央視體育、央視樂動為核心的媒體融合產品體系，搭建了全產業鏈的版權開發體系和跨媒體的傳播效果考評體系，有效地做到了傳統媒體和新興媒體優勢互補、一體發展。

參考文獻

［1］蔡雯.新聞傳播的變化融合了什么[J].中國記者，2005（09）.

［2］朱天，彭泌溢.試論媒介融合中的“加減之道”——時代華納與美國在線“世紀婚姻”終結對我國“三網融合”的啟示.http：//media.people.com.cn[OL/J].

［3］高鋼.媒體融合:追求信息傳播理想境界的過程[J].國際新聞界，2007，3.

［4］數據來源：2015年央視春晚索福瑞數據統計[Z].

楊萬里的詩范文第5篇

關鍵詞：甲烷古菌； Hungate除氧系統； 富集； 滾管分離； 純培養

中圖分類號：Q939文獻標識碼：A 文章編號：1006-3315（2014）04-170-003

厭氧微生物的分離是黔南民族師范學院微生物課程開放性實驗項目之一。目前國內高校多數實驗室對嚴格厭氧菌分離純化主要采用焦性沒食子酸法、厭養罐法、厭養培養箱法等[1]。焦性沒食子酸法進行厭養菌分離培養,由于其方法簡單，操作容易,在大專院校微生物實驗教學中仍廣泛使用,但操作過程厭氧條件不易控制，特別是對嚴格厭氧的甲烷古菌分離效果差。厭養罐法能夠為厭氧菌生長提供嚴格厭氧的環境，但不能為整個分離純化操作過程提供厭氧環境，使用受到限制。厭養培養箱法雖然能為厭氧菌分離培養提供嚴格厭氧環境，需要特制設備,在厭氧箱中操作也不方便，由于價格昂貴，因而其應用受到一定限制。為此，為了改進厭氧細菌的分離純化方法，結合對厭氧消化器中甲烷古菌的分離與純化開放性實驗，借助Hungate除氧系統進行稀釋滾管分離，收到了很好的效果，現將有關技術介紹如下。

一、材料用具

1.接種物

取自黔南民族師范學院微生物實驗室厭氧發酵缸（厭氧消化器）底部的沉積物。

2.儀器用具

2.1Hungate除氧系統。Hungate除氧系統由高純氫氣、高純氮氣，銅柱，加熱套，不銹鋼分支管，橡皮膠管，注射器及9號針頭等組成。銅柱結構直徑30～50mm、長300～500mm的石英玻璃管，兩端加工成漏斗狀，便于連接膠管，玻璃管中裝入碎銅絲（長10～20mm，直徑0.5mm），壓緊，銅絲下面墊上玻璃纖維以防止碎銅絲散落，上端留出50mm左右的空間。銅柱外纏繞加熱帶，銅柱頂端用膠管與具有分支的不銹鋼通氣總管連接。不銹鋼總管下的各分支管用橡皮膠管連接，橡皮膠管的另一端連接1mL塑料質注射器，注射器再與9號針頭連接（圖1）。

圖1Hungate厭氧操作系統示意圖

2.2其它器具。高壓滅菌鍋，恒溫水浴鍋，恒溫培養箱，熒光顯微鏡，厭氧管（16×160mm），厭氧瓶（100mL），光波爐，3000 mL三角瓶，各種規格的注射器（1mL、2mL、5mL）等。

二、方法

1.獲取無氧N2、H2、CO2氣體

甲烷菌是嚴格厭氧微生物，都能利用H2和CO2合成CH4，一般分離甲烷菌都用H2和CO2作為營養。其分離過程需要人工保持一個無氧環境進行操作和供其生長繁殖。用于分離嚴格厭氧微生物使用的氣體雖然是高純氣體（99.999%），但仍然含有微量的O2，利用Hungate銅柱除氧系統可除掉這些微量的O2，提供和保持無氧環境。

2.銅柱除氧與還原

銅柱除氧原理：實驗使用的高純氣體（N2、H2、CO2）中含有微量的O2，當氣體經過銅柱時，這些氣體中的微量O2與Cu反應生成CuO（O2＋CuCuO），從而流出銅柱的氣體則為無O2氣體。

銅柱還原：銅柱使用后，里邊的Cu被氧化為CuO不能繼續與O2發生化合反應，失去除氧能力。此時，關掉其它氣體，通入H2，同時使銅柱升溫（達350℃），當H2通過高溫銅柱時，銅柱內CuO與H2反應（CuO＋H2Cu＋H2O）生成單質Cu，CuO在加熱條件下（350℃）被H2還原為Cu，銅柱恢復除氧能力可反復使用。

操作步驟：打開Hungate銅柱除氧系統通氣橡皮管的通氣開關（止水夾），開啟H2鋼瓶，H2氣流通過銅柱，從銅柱里流出的H2用橡皮管引出室外。此時接通電熱套電源，銅柱升溫，溫度達到350℃左右，20～30min后，銅柱內的碎銅絲被H2還原，由黃黑色變為純銅錚亮色，當銅柱里面的水蒸氣被排出完全后，關閉H2鋼瓶，銅柱還原結束。

3.獲取無氧N2、H2和CO2氣體

無氧N2用于厭氧菌分離操作和培養過程中驅趕空氣，保證局部無氧環境。在銅柱還原結束后，立即打開N2鋼瓶，氣流大小控制以針頭對準操作者手背5cm距離明顯感覺到氣流為宜，并隨時注意控制氣流的大小。此時銅柱內的碎銅絲處于還原狀態的單質銅，當通入高純N2（99.999%）時，其中所含的極微量氧與單質銅反應，氧被固定下來（形成CuO），流出銅柱的則是無氧N2。利用無氧N2氣流驅趕厭氧管、血清瓶等培養容器和培養基中的空氣，以及挑菌時保證無氧環境。使用完畢后，先關緊N2鋼瓶，接著用止水夾封閉所有橡皮管。無氧H2、CO2的獲取方法操作步驟相同。

2.制備無氧培養基

2.1培養基配方（詳見表1）

表1培養基配方表[2]

注：微量元素溶液配制時先溶解氨三乙酸，NaOH調pH于6.5左右。依次溶解其它化合物，最后調pH于7.0。

3.制備方法

按照配方稱取藥品置于事先放有適量蒸餾水的三角瓶中溶解后，加入1mL的1‰刃天青液（W/V），0.4g的鹽酸半胱氨酸，用NaOH調節pH值，加足需要水量，用記號筆在三角瓶外壁標上記號，加入一定量的蒸餾水作蒸發量后，置于光波爐加熱煮沸10min后，通入無氧N2（驅趕空氣，保持培養基為無氧狀態）煮沸至培養基顏色變白后再煮10min左右進行分裝。用9號針頭連接的橡皮管，將無氧N2引入待裝培養基的厭氧管和厭氧瓶（16×160mm厭氧管、100mL厭氧瓶）洗管、瓶（用無氧N2換出瓶中空氣，使容器中無氧分子存在），用培養基分液器進行分裝，厭氧管裝4.5mL，厭氧瓶裝45mL，待裝好培養基后取出N2管塞上橡膠塞，旋緊蓋子。轉好培養基的厭氧試管用專用布袋裝好與厭氧瓶一起置121℃，0.1MPa滅菌20min待用。（厭氧瓶內的培養基使用前加入無菌無氧1%Na2S溶液0.1mL和10%NaHCO30.1mL，厭氧管內培養基使用前加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL）。

4.甲烷菌富集

用水樣取樣器取沼氣底泥5克于上述裝有45mL培養基的厭氧瓶中，利用Hungate厭氧系統，按H2/CO2體積比為40/10的比例分別加入H280mL、CO220mL，置30℃恒溫培養30天，用化學吸收法[3]檢測厭氧瓶是否有甲烷氣體產生，在甲烷菌生長對數增長中期，從產甲烷氣體的富集瓶中取樣進行滾管分離。

5.滾管分離和純化培養

5.1滾管分離培養。對檢測有甲烷菌存在的富集處理，進行第1次滾管分離。在分離培養基中補加瓊脂粉（20g/L），分裝于厭氧試管（16 mm×160mm，4.5mL培養基/管），滅菌。滅菌后置55℃水浴中保持液態，每支厭氧管中分別加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL。用1mL無菌無氧注射器取富集的樣品液0.5mL，作10-1～10-9梯度稀釋，重復3次，每支試管上下倒2～3次（注意不要產生氣泡），使樣品與培養基充分混勻并立即將稀釋管置于裝有4℃以下冰水的磁盤中迅速滾管，使培養基與樣品均勻光滑無氣泡凝固于管壁上。

將滾管分離樣品的厭氧管置于試管架上，按H2/CO2體積比為40/10的比例分別加入H240mL、CO210mL，置30℃恒溫培養30天，在管壁的培養基上有明顯的菌落出現，用化學吸收法檢測是否有甲烷氣體產生。對有甲烷氣體產生的管子，置于熒光顯微鏡下觀察菌落，對有熒光反應的菌落用記號筆畫圈作出記號，待進一步分離培養。

5.2甲烷菌純化。純化過程是多次挑取單菌落、稀釋滾管培養的過程。截取細玻璃管（內徑0.5cm、外徑0.8cm，長15cm），兩端塞上脫脂棉，在酒精燈的火焰上加熱并拉成毛細管，高溫滅菌并烘干。在無氧條件下挑菌：將有熒光反應菌落的管子置于鐵架臺上固定，打開管口，用無氧N2吹入管中，使管內保持無氧狀態。取毛細管一端與橡膠管連接（橡膠管一端用夾子封住，含在口中），另一端（2mm左右處）在酒精燈火焰上加熱并使之彎成約90℃，用它的彎頭接觸到有熒光記號的菌落，輕吸一口氣，使菌落進入毛細管，移出毛細管并快速放入有4.5mL培養基的無氧管子中，迅速塞上膠塞的同時折斷毛細管并旋上外蓋。按H2/CO2體積比為40/10的比例分別加入H240mL、CO210mL，置30℃恒溫培養30天，在管壁的培養基上有明顯的菌落出現，用化學吸收法檢測是否有甲烷氣體產生。

通過單菌落分離獲取的菌液經培養后底部有沉淀出現，用吸收法檢測管中有無甲烷氣體產生。對有甲烷氣體的菌管，用上述方法再進行2次滾管分離，則可獲得甲烷菌的純培養。挑取純培養菌落進行液體培養30d后，置4℃條件下進行保藏，同時進行鑒定。

6.甲烷菌鑒定

6.1菌落熒光反應檢測。利用產甲烷古菌在特定波長（420nm）激發下能產生特有的藍綠熒光，對分離到的樣品管進行菌落熒光反應檢測，有熒光反應的樣品管證明其有甲烷菌存在。

6.2產甲烷氣體檢測。利用甲烷菌能產生甲烷氣體的特性，將有熒光反應的樣品管用氣相色譜儀或化學吸收法進行產甲烷氣體檢測，有甲烷氣體產生的樣品管，再一次證明樣品中有甲烷菌存在。

6.3產甲烷菌純度檢測。用1mL注射器抽取有熒光反應的樣品液置熒光顯微鏡下觀察，菌體有熒光產生，物氣體雜菌，則為甲烷菌純菌，并將置常溫冰箱4℃保藏，待進一步研究或應用。

三、結果與小結

1.結果

1.1利用稀釋滾管分離法從厭氧消化器中分離獲得99支甲烷古菌純培養，經產甲烷氣體和熒光反應鑒定證明是甲烷菌（圖2）。

甲烷桿菌屬甲烷短桿菌屬甲烷球菌屬甲烷微球菌屬

Methanobacterium Methanobrevibacter Methanococcus Methanobacterium

（1000×） （1000×）（1000×）（1000×）

圖2采用稀釋滾管分離純化法得到的甲烷菌圖片

1.2甲烷菌分離純化技術流程

經上述試驗，歸納建立甲烷菌分離純化技術，其流程如下：

第一次滾管分離

第二次滾管分離

第三次滾管分離

1.3小結

采用Hungate厭氧操作系統清除氧氣徹底，操作過程能及時發現和控制無氧環境。培養基中加入對氧氣敏感的刃天青指示劑，能及時觀察操作過程的無氧狀態，使整個操作過程和培養都在無氧狀態，滿足嚴格厭氧的要求。建立的稀釋滾管分離法操作簡便、利用熒光顯微鏡觀察，菌落易于辨認，易挑取，操作過程不易污染，分離效率高等優點。只要滿足厭氧微生物的營養需求，樣品中的厭氧微生物都能分離出來。

基金項目：黔教高發[2012]426號；黔南民族師范學院微生物學重點學科[2011.6]；黔南民族師范學院教學質量工程項目院教發[2011]5號。

參考文獻：

[1]龐德公,楊紅建.產甲烷菌的分離純化培養及其培養基對于菌株的選擇作用[J]中國畜牧獸醫,2010，37(6)：32―35