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免疫組化染色范文第1篇

【關鍵詞】細胞學；薄層液基涂片；染色；方法

【Abstract】objective:tostudythin-layerliquid-basedcytologysmeartechniqueanditsapplicationinImmunohistochemistry.Method:theuseofcomparativesignificanceoftwogroupsofcases.Therewere74casesofadenocarcinomainpleuralfluid-basedsmear.40casesofsmallcell,resolvingphlegmandsmear.Secondgenerationusingimmunohistochemicaltwo-stepdye.Results:adenocarcinomainpleuraleffusionandascitesinathinlayerofliquidbasedsmearsadenocarcinomacellsonCEAantibody-negative,Mesothelialcellstomesothelin(mesothelin)antibody-positivesmallsmallcellundifferentiatedcarcinomacellandresolvingphlegmsmearonCHAantibody-positive.OnLCAantibody-positivelymphocytes.Conclusion:ImmunohistochemicalAntigen-antibodyreactionisahighdegreeofspecificityandsensitivityofbiochemicalreactions,toaspecificantigenrecognitionandstrong.Incells,subcellularleveldetectionAntigenmoleculeisdifficultforotherbiotechnologyandalternative.Onthecytologyhasbroadapplicationprospects.

【Keywords】Cytology;thinlayerliquidbasedsmears;dyeing;method.

【中圖分類號】R156.3【文獻標識碼】B【文章編號】1005-0515(2011)12-0308-02

免疫組化是用特異性抗體對細胞或組織內的抗原進行定性、定位或定量檢測。凡能作為抗原半抗原的物質，都可用免疫組化方法檢測，近年免疫組化技術在病理組織學上廣泛應用，但少見于細胞學薄層液基涂片的報道。本文總結細胞學薄層液基涂片的免疫組化染色實驗，探討免疫組化技術在細胞學上的應用。

1材料與方法

1.1材料：選用有對比意義的細胞學檢材，記有腺癌性胸腹水薄層液基涂片74例，小細胞未分化癌涂片40例，試劑選用邁新公司Elivsionplus免疫組化試劑盒。

1.2方法：免疫組化二代二步染色法：1）胸腹水、痰薄層液基涂片、固定、潮干、PBS液洗滌。2）胰酶消化修復抗原，膠酶濃縮劑與稀釋液按1:3滴加，37℃孵育15分鐘，PBS液洗滌。3）阻斷：滴加3%過氧化氫液，37℃孵育15分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶活性，PBS液洗滌。4）免疫反應，抗體依需要自選，滴加后37℃孵育1小時，PBS液洗滌。5增強反應，滴加增強劑，37℃孵育30分鐘，PBS液洗滌.6）標記：滴加酶標抗鼠/兔聚合物，37℃孵育30分鐘，PBS液洗滌。7）顯色，滴加新制DAB液，鏡下觀察，顯色適當后放入蒸餾水中終止反應。8）蘇木素復染，中性樹膠封固。

2結果

經反復實驗總結出以上染色方法，可使陽性細胞液基涂片中的陽性細胞呈黃棕色或棕褐色。74例腺癌性胸腹水離心涂片中，變形未圓形、卵圓形，聚集成團的深染的腺癌細胞，與增生間皮細胞在鏡下難以區別；通過免疫組化染色，腺癌細胞對CEA抗體顯陽性，間皮細胞對mesothelin（間皮素）抗體顯陰性。40例小細胞未分化癌痰涂片中，小細胞未分化癌細胞略大于淋巴細胞，圓形、卵形、短小梭形，核深染，與大淋巴細胞難以鑒別。通過免疫組化染色，小細胞未分化癌細胞對CHA抗體顯陽性，淋巴細胞對LCA抗體顯陰性，這樣可以鑒別開來。

免疫組化染色范文第2篇

在惡性淋巴瘤的診斷與分型中,免疫組織化學染色標記作為輔助診斷的手段越來越重要,甚至已經成為不可缺少的方法之一。目前,在臨床病理診斷中使用免疫組化方法主要是在石蠟包埋組織中進行。在組織固定、包埋等處理過程中很多抗原被封閉。部分抗原需要按照抗體使用指南中的方法來做抗原暴露修復,組織中的部分抗原仍然不能完全暴露,由此造成假陰性,從而影響正確診斷。筆者在臨床應用免疫組化技術過程中,體會到將部分組織切片采用抗原雙次修復的辦法[1],讓僅一次抗原修復,封閉抗原未能充分暴露的組織能夠得到有效的表達。降低了假陰性和假弱陽性,提高了淋巴瘤診斷與分型的準確率。

1 資料與方法

1.1 一般資料 挑選中山大學附屬第五醫院病理科 2007~2009年淋巴瘤病例37例,其中最終診斷為彌漫大B細胞淋巴瘤的共有23例,套細胞淋巴瘤的共有9例,結外NK/T細胞淋巴瘤,鼻型的共有5例,性別:男20例,女17例,年齡35~72歲。將石蠟組織標本切片后分2組 A組:熱修復組;B組:熱修復聯合胰酶修復組。

UItraSenSitire Tm S P免疫組化試劑盒(A:內源性過氧化酶阻斷劑;B:動物非疫血清;C:生物素標記的二抗;D:鏈霉菌抗生物素蛋白 過氧化酶)。Trypsin 胰蛋白酶修復液 、PBS沖洗液pH7.4。0.01%檸檬酸中性緩沖修復液、日本產家用微波滬、DAB顯色劑。鼠抗人單抗CD3、鼠抗人單抗CD45RO、鼠抗人單抗CD20、鼠抗人單抗CD79a、鼠抗人單抗CyclinD1、鼠抗人單抗CD5、鼠抗人單抗CD56。(以上試劑均購自福建邁新試劑公司)

1.2 方法 ①組織常規固定脫水石蠟包埋切片脫蠟至蒸餾水沖洗 PBS沖洗3 min×3次;

②滴加內源性過氧化酶阻斷劑15 minPBS沖洗3 min×3次;

③A組:切片放入檸檬酸修復液盒中置微波滬里修復。100℃微波1~2 min、40℃微波3 min修復,取出修復盒、室溫下自然冷卻。PBS沖洗3 min×3次;

B組:切片在A組修復的基礎上進行第二次修復:滴加0.1%胰酶修復液15 min,PBS沖洗3 min×3次;

④甩去PBS沖洗液,切片同時分別滴加血清15 min;

⑤甩去血清,滴加相應抗體,濕盒置37℃溫箱中,孵育2~3 h,取出室溫下PBS沖洗3 min×3次;

⑥滴加生物素標記二抗,15 min,PBS 3 min×3次;

⑦滴加鏈霉菌抗生物素蛋白 過氧化酶15 min,PBS沖洗3 min×3次;

⑧滴加DAB顯色劑,顯色(約5 min)后將切片用水沖洗、蘇木素復染、脫水、透明、封片。

2 結果

光鏡下觀察兩組中每一例淋巴瘤的腫瘤細胞胞漿及胞膜,以大于10%的腫瘤細胞胞漿或胞膜出現清晰的棕黃色顆粒為陽性標準,結果如下:

①23例彌漫性大B細胞淋巴瘤組中,CD20用A方法修復的陽性率為34.78%,B方法修復的陽性率為100%;CD79a用A方法修復的陽性率為30.43%,B方法修復的陽性率為91.30%;CD3及CD45RO為T細胞標記,腫瘤細胞不表達。

表1

CD20及CD79a在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的

陽性表達率

分組A方法B方法

CD208/23(34.78%)23/23(100%)

CD79a7/23(30.43%)21/23(91.30%)

注:P值

②9例套區淋巴瘤組中,CD5用A方法修復的陽性率為33.33%,B方法修復的陽性率為88.89%;CyclinD1用A方法修復的陽性率為22.22%,B方法修復的陽性率為88.89%;CD3及CD45RO為T細胞標記,腫瘤細胞不表達。

表2

CD5及CyclinD1在套區淋巴瘤中的陽性表達率

分組A方法B方法

CD5*3/9(33.33%)8/9(88.89%)

CyclinD1**2/9(22.22%)8/9(88.89%)

注:*p值

以上結果經統計學分析均有統計學意義,說明在B細胞淋巴瘤中彌漫性大B細胞淋巴瘤及套區淋巴瘤的診斷免疫組織化學染色中,使用雙次抗原修復法修復CD20、CD79a及CD5、CyclinD1的陽性率顯著高于一次抗原修復法,同時做T細胞標記,兩種修復方法均不易產生假陽性。

筆者還對本科室的5例結外NK、T細胞淋巴瘤,鼻型病例進行同樣比對,發現CD56用A方法修復的陽性率為60%,B方法修復的陽性率為100%;由于CD45RO在NK/T細胞淋巴瘤中的表達不穩定,所以用方法修復對比沒有差異性;CD20及CD79a為B細胞標記,腫瘤細胞不表達。由于樣本數小,不適宜做統計學分析,陳列在此僅供參考!

3 討論

惡性淋巴瘤的病理診斷與鑒別診斷是臨床病理診斷中最困難的領域,隨著免疫學的發展,免疫組織化學技術不僅在診斷方面提供了有力的依據,而且在具體分型及指導用藥方面也起著重要作用。但由于淋巴結本身的結構特點及在石蠟標本制作過程中,組織中的一些抗原容易被封閉,導致免疫標記表達不理想或陰性表達,從而混淆診斷醫師的思路,延長診斷時間,甚至誤診!筆者在學習了免疫組化染色中抗原雙重暴露法后[1],應用于惡性淋巴瘤的診斷。

長期臨床工作中,筆者發現修復的時間與方法不到位時,組織中抗原無法完全暴露。常規應用高溫微波修復,設定溫度100℃修復10~15 min,組織中部分抗原能夠暴露,但薄切的組織切片會破碎、脫落,影響觀察診斷。經反復、設定多個修復時間段實驗(15、10、5、3、1 min),發現高溫100℃修復1~2 min,組織切片形態完整,此時繼續再用40℃溫度,保持3 min修復,組織中抗原能達到一定限度的暴露。部分淋巴瘤腫瘤標記表達較困難,我們用(溫度100℃時間1~2 min;溫度40℃時間3 min)在微波爐中進行熱修復后,再用0.1%胰酶修復15 min。通過兩次修復后,組織中抗原與抗體結合點位增多,免疫標記敏感性進一步加強,組織中抗原充分暴露。同時又沒有破壞免疫標記的準確性和特異性。組織染色后,假陰性表達減少,為醫生提供了準確的輔助診斷信息,確保淋巴瘤診斷與分型的準確性。

免疫組化染色范文第3篇

 

關鍵詞： 胸腔積液;冰凍切片;免疫組化

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2006年5月—2008年12月我們共收集胸水標本64例，其中男性28例、女性36例，年齡32～82歲，平均年齡51.6歲。經組織學或結合臨床資料證實腺癌12例，鱗癌8例，惡性上皮型間皮瘤4例，間皮增生40例。

1.2 方法 ①將送檢的胸水直接用一次性吸管吸取下面沉淀的部分30 ml于試管內，2 500 r/min，離心10 min。將上清液去掉，離心沉淀物涂片1張、HE染色。沉淀的部分放在冰凍切片機上冷凍頭上，然后加入OCT包埋劑進行切片。②胸水離心沉淀物少就直接倒去上清液，先在冰凍切片機的冷凍頭上加入OCT包埋劑，然后將胸水離心沉淀物放在上面進行切片。③胸水離心沉淀物常規切片6張：1張HE染色，5張免疫組化染色。④制作免疫組化染色的冷凍切片必須冷藏保存，然后根據需要進行免疫組化染色。⑤免疫組化染色標記細胞角蛋白(cytokeratin，CK)、上皮膜抗原(EMA)、肺癌相關抗原(LCA)、間皮細胞、波形蛋白(vimentin)。免疫組化染色方法：采用即用型快捷免疫組化MaxvislonTM試劑盒，試劑及抗體和免疫組化陽性片均由福建邁新生物技術公司提供，陰性對照采用PBS作為一抗。

染色步驟：①切片室溫干燥后，入4℃丙酮固定10 min，用PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3 min。②根據每一種抗體的要求，對組織抗原進行相應的修復，除細胞角蛋白用胰酶消化外，間皮細胞、vimentin、LCA、EMA都要檸檬酸高溫修復(按說明操作)。 ③每張切片加1滴3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min。 ④每張切片加1滴自選1抗體，室溫下孵育60 min。⑤PBS沖洗3次，每次3 min。⑥除去PBS液，每張切片加2滴新配制的DAB溶液10 min。⑦自來水洗，蘇木素復染直至中性樹膠封固。

1.3 統計學處理 采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.01，P<0.01認為差異有統計學意義。所有統計均由SPSS 10.0軟件完成。

2 結果

送檢的64例胸水直接離心涂片HE染色診斷陽性細胞7例，陰性39例，可疑18例。應用冰凍切片技術聯合免疫組化檢查結果陽性細胞24例，陰性38例，可疑陽性僅2例;χ2=22.13，P<0.01，見表1。冰凍切片免疫組化標記結果見表2。表1 64例胸水單純涂片與冰凍切片診斷結果表2 冰凍切片免疫組化標記結果

3 討論

胸腔積液是多種胸部疾病特別是惡性腫瘤的常見伴發體征，甚至為患者首發癥狀。通過胸腔積液對明確病變性質及類型有重要意義，對疾病的治療也有重要指導意義。一般的胸水病理檢查僅僅行單純離心、涂片、HE染色，光鏡下觀察，但由于細胞分散、染色效果不理想，又因細胞容易堆積成團，其診斷的陽性率較低，特別是小細胞腫瘤難以和間皮瘤、淋巴瘤、未分化腫瘤細胞區別。

免疫組化染色范文第4篇

【摘要】：本文對免疫組化的優點作了簡要介紹，同時介紹了其在病理診斷中的應用，有支持、鑒別診斷的作用，檢測激素受體與生長因子，對預后及治療產生重要意義。文中還敘說了免疫組化的結果對腫瘤細胞增生和分期具有評價作用，并對免疫組化應該注意的事項也逐一列舉。

當免疫學的理論和技術進一步成熟發展后，就產生了免疫組織化學技術，將這一方法應用在病理診斷上就稱為診斷免疫組織化學。在現代醫學基礎和臨床研究中免疫組織化學對疾病尤其是對腫瘤的診斷、鑒別診斷及發病機制的研究提供了強有力的手段。

（一） 免疫組化的優點

（1） 特異性強

免疫組化是利用抗原、抗體可以特異性結合，也就是“一對一”的結合的原理。

（2） 敏感性高

現在免疫組化的ABC法、SP法的問世，抗體可以稀釋成千上萬倍甚至上億倍，仍可發生抗原抗體的結合。

（3） 定位精確

免疫組化的反應可在組織和細胞中進行，抗原實現了準確的定位觀察，對于病理學的診斷和研究具有非常重要的意義。

（二） 免疫組織化學的應用

（1） 免疫組化對病理診斷具有支持和鑒別診斷的作用。

在病理診斷比較明確的情況下，應用組化標記可以起到支持診斷的作用。有時無法判斷腫瘤來源時，組化的應用將起到極大的幫助，可以鑒別腫瘤的來源和性質。

（2） 激素受體與生長因子的檢測對預后及治療具有十分重要的意義

激素受體的檢測對于乳腺癌的研究已有了較明確的結論，雌激素受體陽性的乳腺癌患者預后優于陰性表達者，同時陽性表達者對內分泌治療效果好，患者生存期延長。

（3） 組化結果對腫瘤細胞增生的判斷和評價。

反應增生程度的指標有Ki67、PCNA，其陽性表達細胞數多者，其腫瘤惡性程度高，預后不良。

（4） 免疫組化對腫瘤分期具有意義

在判斷腫瘤是原位還是浸潤生長方面具有重要意義，能為臨床治療提供依據。如采用層粘連蛋白和Ⅳ型膠原的單克隆抗體可以清楚地顯示基底膜的主要成分，如果證實腫瘤突破了基底膜，那就是浸潤性腫瘤而不是原位癌了，其預后是不同的。

（5） 對腫瘤的治療具有指導作用。

很多腫瘤對化療不敏感，由于瘤細胞內的多藥耐藥基因編碼的酶活性增加所導致，用免疫組化的方法可以檢查細胞內的這些酶或糖蛋白來研究腫瘤是否具有抗藥性，比如檢測P-糖蛋白、MRP、LRP、TOPOⅡa、GST、TS等。

（三） 免疫組化結果的注意事項

（1） 必須設立陽性和陰性對照

每批染色都要有已知的陽性和陰性對照，這樣才能保證結果的可靠性，沒有對照的陽性和陰性結果是不可信的。

（2） 非特異性染色的干擾

非特異性染色屬于假陽性又稱背景染色，它的存在干擾結果的判斷，因此在染色過程中要減少背景著色。

（3） 抗原的聯合標記

免疫組化染色范文第5篇

【摘要】近年來分子生物學技術以及其它高、新技術在病理領域得到廣泛的應用，同樣作為體育界的基礎研究學科運動人體科學的發展已經不能滿足簡單的宏觀的研究，越來越多的醫學檢驗以及病理學實驗技術在運動人體科學廣泛應用，尤其是組織病理學技術中定位技術，例如免疫組化、原位雜交等。本文就以上三種病理學常用的定位技術的方法進行綜述。

【關鍵詞】組織病理學；技術；運動人體科學

【中圖分類號】 R818.02【文獻標識碼】A【文章編號】1005-1074(2009)04-0045-01

1免疫組織化學實驗技術

隨著免疫組織化學染色技術的廣泛應用，病理學研究產生了劃時代的飛躍。免疫組織化學是病理學實驗中常用的方法，是在蛋白質水平用各種特異性抗體檢測細胞內各種抗原物質。根據標記物的不同，免疫組織化學技術可分為免疫熒光細胞化學技術、免疫酶細胞化學技術、免疫鐵蛋白技術、免疫金-銀細胞化學技術、親和免疫細胞化學技術、免疫電子顯微鏡技術等。

1.1免疫組織化學實驗步驟免疫組化技術是在組織化學的方法上結合免疫學的理論和技術發展起來的一門新技術。其原理是利用免疫學的核心――抗原體特異性結合的原理，用標記抗體追蹤抗原，通過化學反應使標記于結合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶、金屬離子、同位素等顯示一定的顏色，并借助顯微鏡、熒光顯微鏡、電鏡對其顏色進行觀察，以達到檢測抗原物的目的[1]。

1.2免疫組化技術的優點免疫組化技術的優點：①特異性強，免疫組化中抗體與組織細胞中的抗原的結合是特異的。如白細胞共同抗原（LCA）顯示淋巴細胞成分。②敏感性高，而今，由于抗生物素―生物素（ABC）法和鏈酶素―過氧化物酶連接（SP）法的出現，使抗體的稀釋度(代表敏感度)達到了上千、上萬，甚至上億倍，使免疫組化技術更加可靠。③定位準確，由于抗原抗體的結合是特異的，因而免疫組化技術可在組織和細胞內準確定位，對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，將形態與功能相結合，對疾病進行深入的研究。

2原位雜交實驗技術

原位雜交是將組織化學與分子生物學技術結合來檢測合定位核酸的技術。它是用一段已知序列的核苷酸片斷來檢測細胞內是否存在欲檢測物質的DNA或RNA，是比免疫組化更加靈敏而深入一個層次的檢驗方法。根據所選探針和待測靶序列的不同，核酸原位雜交有DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交等。

2.1原位雜交技術的應用原位雜交由于不需要從待測組織中提取核酸，可完好的保存組織、細胞的形態結構，將形態學與基因功能活動的變化相結合進行多層面的研究。主要應用：①細胞特異性mRNA轉錄的定位可用于基因圖譜、基因表達和基因組進化的研究；②感染組織病毒DNA/RNA的檢測和定位；③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化的監測；④基因在染色體上的定位；⑤檢測染色體的變化；⑥間期細胞遺傳學的研究。

2.2原位雜交技術與免疫組化的比較

2.2.1兩者的區別原位雜交與免疫組化染色技術相比較，這兩種方法的共同之處均具有定位檢測的功能，且均有較高的敏感性和特異性，所不同的是免疫組化染色是用的是抗體，其檢測對象是抗原，機制是抗原-抗體的特異性結合，是蛋白質表達水平的檢測；原位雜交使用的是探針，遵循堿基互補配對的原則與待測靶序列結合，是DNA或mRNA水平的檢測。從實驗方法來看，免疫組化染色操作相對簡單，成本相對較低，受外界因素的影響相對小；原位雜交技術無論從實驗設計上，還是從實際操作上均較免疫組化染色復雜，成本的高低與試劑的種類和來源密切相關。一般而言，直接選用商品化的標記探測和檢測試劑盒的實驗成本較高；熒光標記探針較非熒光標記探針的成本高，對樣本及實驗條件的要求較高，也更容易受到外界因素的影響。

2.2.2免疫組化與原位雜交雙標技術雙標技術是在同一張組織切片上標記兩種不同的抗體或同時應用兩種不同的檢測手段，如免疫組化和原位雜交技術，在不同層次來檢測同一細胞上某些物質的表達是否有相關性的一種實驗方法。與傳統的單項檢測相比，雙標記具有無可比擬的優越性，可以克服由于切片間各種差異而引起的時間或空間的樣本誤差。實驗方法上先進行原位雜交會減少免疫組化過程中對待測DNA或RNA的破壞或影響，一般目前均推薦先進行原位雜交后進行免疫組化標記[2，3]。具體的操作跟單純的免疫組化和原位雜交各自的方法一致。需要注意的問題就是：①所用的實驗設備必須經DEPC水浸泡或200℃烤箱過夜，操作時須帶口罩及手套；②當雜交步驟完成后，切片必須認真浸泡及長時間洗滌至少超過30min。③作免疫組化的各步驟時間均須適當延長，以增加抗原抗體間的結合，楊青春等人研究發現每個步驟均延長2～3倍時間。④免疫組化顯色后不需要用蘇木精復染，以免遮蓋核信號。

參考文獻

[1]紀小龍，施作霖.診斷免疫組織化學[M].北京：軍事醫學科學出版社，1997.5.

[2]許良中.實用腫瘤病理方法學[M].上海：上海醫科大學出版社，1997:222-223