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三角形的特性范文第1篇

“三角形的特性”是人教版四年級下冊的內容，是在學生已經認識三角形的基礎上進行教學的。品讀了兩位教師的”三角形的特性”教學設計后，深深地感受到了兩位教師深厚的文化底蘊，豐實的數學素養，鮮明的教學個性，令人回味無窮。雖是同一教學內容，由于老師的不同，所設計課的結構、風格及所采取的教學方法和策略都不盡相同，呈現給我們的是獨具匠心、各具特色的兩節課。兩節課“同中求異、異中求同”，教師的教學個性彰顯無疑。

這部分教學內容屬于“圖形與幾何”領域，張翠穎老師和李欣兩位老師通過對課標的學習，都精心地設計了“三角形的特性”一課。有幸的是我親自聆聽了張老師的這節課，并與張老師交換了意見。兩位老師都是始終圍繞著以“問題情境——實踐探究——解釋、應用”的基本模式來開展自主探究、動手實踐、合作交流的數學教學活動。讓學生經歷“數學化”的學習過程。遵循學生的認知規律，注重學生已有的生活經驗，尊重學生對問題的獨到見解，關注學生的感受、體驗。力爭把數學課堂還原給學生，使學生真正成為數學學習活動的主人。感受到了她們相同的思想方法和理念，同時也能感受到不同的設計和風格。

一、聯系生活，提出質疑

在導入部分兩位老師都設計了情境教學，并采取了出示大致相同的生活圖片如塔吊、斜拉橋、自行車等圖片讓學生觀察，從而揭示出三角形來。聯系生活實際，借助學生已有的生活經驗，讓學生再找出生活中還有哪些物體上有三角形。同時提出問題：這些物體為什么要做成三角形的呢？數學教學必須從學生熟悉的生活情境和感興趣的事物出發，為他們提供參與的機會，為他們創設一個發展的空間。以此激發學生的求知欲，讓他們在生活中通過觀察去發現問題，并提出問題。在導入部分，兩位老師的教學設計可以看出情境和思路都是相同的。關于“同課異構”的話題曾經也有人提過“同材異構”“同標異構”，主要體現“異構”，在這里的設計為什么是大致相同的呢？可以說這樣的設計充分地體現出了課標中“四能”中的前兩方面能力，為下面落實后兩方面能力做鋪墊。雖然設計大致相同，但是方法和風格還是各有不同。

二、合作探究，分析問題

數學學習是學生獲取知識的過程，是自我建構的過程。本節課中，兩位精心設計探究活動，引導學生自主探究，努力改善學生的學習方式，使他們全身心地投入到數學活動中，在活動中產生深刻的體驗，從而更好地掌握知識。這節課知識點多，包括三角形的概念、底和高的概念、各部分名稱，還有三角形的重要特性：穩定性，及其在生活中的應用。從課題看，特性無疑是重點。而底和高的概念、及高的作法是難點，勢必會耽誤大量時間。如何在一堂課中完成教學任務？

張翠穎老師和李欣老師都采取了自主探究合作交流的方法，留給學生足夠的時間與空間，首先讓學生獨立思考，再采取合作交流的方式。使學生建立空間觀念，建立幾何直觀的思想，由具體直觀形象思維到抽象思維，最后總結概括出三角形的定義及底和高的概念。在集體操作過程中，兩位老師的教學方法各不相同：

張翠穎老師大膽地采取倒敘的設計。通過對教材的深入理解，結合學生的實際情況，教學中設計了許多操作和探究活動，并根據學生的活動設計把教材例1和例2的內容進行了重組。教學中把例1中認識三角形的底和高這部分教學內容后移，把例1中認識三角形的特征和例2三角形的特性安排在一起教學，并設計了一系列的操作活動，使學生在畫一畫、看一看、找一找、拉一拉、想一想、說一說等活動中認識三角形的特征、了解三角形的特性及在實際生活中的應用。在探究過程中，讓3名學生伸開雙臂圍成三角形，張老師首先讓學生理解三角形定義，然后直接明確三角形的表示方法，再探究三角形的底和高。這樣做更容易在三角形中找出對應的底和高。

李欣老師在三個探究活動中采取了出示學習匯報單，請學生以小組為單位自主學習的方式。通過做（擺）三角形、畫三角、判斷三條線段圍成的是不是三角形，明確了什么是三角形。這個過程中讓學生明確探究要求，按步驟去合作探究，通過具體實例來完成三角形的定義。明確強調由三條線段圍成的圖形叫做三角形。之后再探究三角形的底和高，按照循序漸進由淺入深的邏輯進行教學。

關于三角形高的教學，兩位老師的設計也不盡相同。張老師是采取了對應的方法，并突出了直角三角形的兩條高，同時拓展到鈍角三角形高的畫法。李老師是通過對比、判斷的形式明確三角形的高，并且要求會畫三角形的高。

形象直觀、突破難點。在探究三角形穩定性時，張老師結合導入時提出的問題“為什么這些物體要做成三角形的呢”，加以合理的解釋說明，突出了三角形的穩定性這一難點，更確切地說是三角形的牢固性和穩固性。李老師利用對比的方法，利用學具讓學生動手操作通過拉一拉的形式發現三角形比四邊形更穩固，直觀形象地理解了三角形的穩定性。

同樣是探究，而探究的要求、形式卻不相同，體現出了兩位老師的教學思路及教學風格的獨到之處，卻達到了同樣的目的和效果。

三、回歸生活，解決問題

兩位教師在教授新知之后都設計了不同的拓展練習。把當堂所學習的知識當堂消化，并且聯系生活運用到生活中去，解決一些簡單的實際問題。張老師設計了椅子太搖晃了，怎樣才能固定住呢？讓學生來解決這個生活中的實際問題。李老師提出了自行車車架運用了三角形的穩定性原理的問題。同時兩位教師都列舉了關于三角形具有穩定性的一些生活實例，以此讓學生更好地理解數學來源于生活并服務于生活。更加清晰地看到學習數學的重要性和學習數學的目的。

兩位教師的課堂教學讓我們清楚地看到了不同的教師對同一教材內容的不同處理，不同的教學策略所產生的不同教學效果。不同的教師在設計“三角形的特性”的教學時還要從實際出發，進行合理的創編教材，把教材進行重組。因此我們備課時重在“鎖定”新課標、“吃透”教材、“聚焦”關鍵、“挖掘”智慧、多元解讀，實現教無定法，貴在得法，形成獨具特色的教學風格。

三角形的特性范文第2篇

等邊三角形是特殊的等腰三角形。等邊三角形（又稱正三邊形），為三邊相等的三角形，其三個內角相等，均為60°，它是銳角三角形的一種。等邊三角形也是最穩定的結構。等邊三角形是特殊的等腰三角形，所以等邊三角形擁有等腰三角形的一切性質。

三角形是由同一平面內不在同一直線上的三條線段‘首尾’順次連接所組成的封閉圖形，在數學、建筑學有應用。常見的三角形按邊分有普通三角形（三條邊都不相等），等腰三角（腰與底不等的等腰三角形、腰與底相等的等腰三角形即等邊三角形）；按角分有直角三角形、銳角三角形、鈍角三角形等，其中銳角三角形和鈍角三角形統稱斜三角形。

（來源：文章屋網 ）

三角形的特性范文第3篇

【關鍵詞】淮劇;旦角;表演;特性;戲曲;劇種;人物

中圖分類號：J812 文獻標志碼：A 文章編號：1007-0125（2015）10-0039-02

表演藝術是中國戲曲的中心與生命，沒有表演藝術就只有紙上的戲曲劇本而沒有真正的舞臺上的戲曲藝術，這與西方戲劇形成明顯的區別。對于這一點，京劇大師程硯秋先生論述得十分明確而又精辟：“我國傳統表演藝術和西洋演劇的最大區別之一是，在舞臺藝術的整體中，我們把表演提到至高無上的地位。西方雖然也有表演中心論，而且是主要學派，但終不能像中國學派這樣把表演看作是唯一的。歐洲戲劇的發展規律是：時代的美學觀點支配著劇本寫作形式，劇本寫作形式又在主要地支配著表演形式;戲曲卻是：時代的美學觀點支配著表演形式，表演形式在主要地支配著劇本的寫作形式。”[1]

作為中國地方戲曲劇種之一的淮劇，同樣以表演藝術為中心與生命，各行當均如此，旦角當然亦如此。

然而，淮劇旦角表演藝術本身，又是一項全方位、系列化、深層次、高水準的復雜系統工程，其中又以凸顯藝術特性為重點。因為特性作為事物特有的性質，屬于個性范疇，而一切藝術創造，重點也正在凸顯藝術個性。

具體來說，淮劇旦角表演藝術的特性，應以戲曲特性、劇種特性、人物特性為重中之重。我們對此分別進行研究與論述。

一、戲曲特性

淮劇旦角表演藝術的第一大特性，是戲曲特性。

中國戲曲的表演藝術，與西方戲劇表演藝術的根本性區別，是藝術本質與藝術風格的寫意性與寫實性的區別。“寫意是中國古代美學的一個重要命題，在戲曲表演藝術中主要表現為對時間空間限制的突破，以及動作、布景的虛擬。合在一起，就造成了一個與實際的生活形態相去甚遠，藝術的韻律隨著心意流蕩的天地――當然，不會是一個逼真的幻境。”[2]

在寫意的美學原則影響下，淮劇旦角的表演藝術與所有中國戲曲的所有行當的表演藝術一樣，都以虛擬化、夸張化、程式化、歌舞化為主要藝術特性。

從本質上而言，寫意特性就是民族特性的具體體現與張揚。而民族特性又是世界上所有國家、所有民族的所有藝術的生命與靈魂。19世紀俄國著名作家赫爾岑指出：“詩人和藝術家們在他們的真正的作品中總是充滿民族性的。”[3]民族文化是一個民族的精神支柱和血脈，是民族思想的堅實根基。因此，淮劇旦角表演藝術，要從這一思想高度來認知并體現寫意特性的神髓，要為弘揚民族文化而寫意，而不是只為寫意而寫意。戲曲特性的實質就是民族特性。

二、劇種特性

淮劇旦角表演藝術的第二大特性，是劇種特性。

淮劇旦角表演，必須以淮劇本身的劇種特性為其題中應有之義。淮劇作為我國地方戲曲劇種之一，“舊稱‘淮海小戲’‘小戲’……（南派）就其聲腔的構建而言，它是沿著【自由調】曲牌為主體加以延伸拓展，音樂語調又夾在江、浙一帶某些吳語語系的漩渦之中，故南派淮劇的音調多有富麗雕飾、精工細密的格調。北派是江蘇鹽阜、清、淮、寶及里下河廣闊地帶淮劇賴以生存的土家風派。北派淮劇土俗意味濃郁，其聲腔多半是在【淮調】【拉調】曲牌的傳統音樂框架上作衍變，這就為此派淮劇的音調奠定了充滿田園野態、自然飄逸的情趣。淮劇始于清末，以地攤形式演出，后逐漸發展為舞臺劇。曲調質樸優美，以‘拉魂腔’見長。伴奏樂器以板制三弦為主，因而俗稱‘三撥子’。劇目以反映民間生活的小戲為多，傳統戲有《打金枝》《孟麗君》《白虎堂》等。”[4]后來又編演大量現代戲，并創造出【十里好風光】等新曲調。

從本質上說，劇種特性就是地域特性，而地域文化則是民族文化的重要組成部分，地域文化特性愈鮮明，民族文化特性也就愈濃郁。正因為如此，魯迅先生指出：“有地方色彩的，倒容易成為世界的，即為別國所注意。打出世界上去，即于中國之活動有利。”[5]中國文學史與藝術史上成功的精品與經典作品，無一不以鮮明的地域文化特色取勝，《詩經》的黃河文化、《楚辭》的荊楚文化、《紅樓夢》的京味兒、《金瓶梅》的魯味兒、老舍作品的京派文化、魯迅作品的海派文化……如此等等，不勝枚舉。

同樣，所有的中國地方戲曲劇種，無一不以各自獨有的地域文化特性為統領，例如川劇的川文化特性、晉劇的晉文化特性、豫劇的豫文化特性、閩劇的閩文化特性、湘劇的湘文化特性、桂劇的桂文化特性、滇劇的滇文化特性、吉劇的吉文化特性、越劇的越文化特性、贛劇的贛文化特性……如此等等，俯拾即是。

因此，淮劇旦角表演藝術，必須全力張揚淮劇的地域文化特性，凸顯本劇種獨有的藝術特性。

三、人物特性

淮劇旦角表演藝術的第三大特性，是人物特性。

淮劇旦角主要包括青衣、花旦兩個行當。青衣扮演莊重的中青年女性人物，重唱功，又稱“正旦”;花旦扮演天真活潑或放浪潑辣的青年婦女，重做功與念白。此外，還有刀馬旦、武旦等。有些劇種，又將花旦細分為閨門旦、玩笑旦、刺殺旦、潑辣旦等等。

但是，所有這些行當分工，都不能形成類型化。淮劇旦角表演的“最高任務”，是在舞臺上塑造出生動鮮活、個性鮮明的人物形象，是“演人不演行”，行當與各種功法（主要是唱、念、做、打“四功”與手、眼、身、法、步“五法”）只是手段而非目的。因此，衡量一個演員的藝術水準，主要看他創造舞臺角色――人物形象的藝術能力。

在創造舞臺人物形象時，重點是刻畫人物獨特的性格與特有的思想感情，做到傾情投入，做到以情帶聲、聲情并茂，做到以情動人、以情感人。

有人說，“戲曲表演重形式輕體驗”，其實這是一種誤解與誤判。中國戲曲表演從來都十分重視情感體驗，梅蘭芳大師說：“有人說，我在揪趙高胡子的時候，臉上好像笑又好像哭，問我是怎么表演出來的。我在臺上演戲，無法看見那時候自己臉上的表情，這可能是因為我心里交織著兩種極端矛盾的感情，一方面想用裝瘋逃避這險惡的環境;同時，把父親硬叫成‘兒子’也是極不愿意做的事情，所以不自覺地流露出這種似笑似哭的感情來。”[6]

當然，戲曲表演還要做到體驗與表現的有機統一，完美結合，不僅要體驗人物的內心世界，而且還要創造出特定的外形予以表現，做到內部（心理）動作與外部（形體）動作的一體化。也就是說，要以人物情感統領各種舞臺動作，將人物演活、演生動，演出特性來，演出彩兒來。

當然，要做到這一點，絕非輕而易舉之事，必須刻苦鉆研角色，真正進入到角色的內心世界。還要苦練基本功，以精湛的技藝和才藝作為塑造舞臺人物形象的藝術憑借和智力支撐。

綜上所述，淮劇旦角表演藝術的特性，以戲曲特性、劇種特性、人物特性三大特性為重中之重，而這三大特性又是互相滲透、互相影響、互相促進的三維互動的，是相輔相成、相得益彰的。

參考文獻：

[1]程硯秋.程硯秋文集[M].北京：中國戲劇出版社，1959.38.

[2]余秋雨.戲劇理論史稿[M].上海：上海文藝出版社，1983.653.

[3]赫爾岑.往事與沉思[A].赫爾岑論文學[C].上海：上海文藝出版社，1962.27.

[4]上海藝術研究所等.中國戲曲曲藝詞典[M].上海：上海辭書出版社，1981.186.

三角形的特性范文第4篇

一、研究介紹

筆者隨機選取了數所幼兒園大、中、小班各年齡段的幼兒作為研究對象。在幼兒表演、教師單純講課、師幼互動、幼兒自主活動時，研究者若發現研究對象有干擾他人、交頭接耳、做小動作、呆坐、東張西望、出怪聲、走動等注意力分散行為時，就立即進行詳細記錄，包括行為發生的背景、發生的原因、行為的變化、行為的終止與結果等。

二、研究結果與分析

1.幼兒注意力分散的行為表現

調查數據顯示，幼兒注意力分散的行為表現是多種多樣的，其中，做小動作是幼兒最容易出現的注意力分散類型，大多數幼兒在課堂上都有玩衣服上的紐扣、帶有彩燈的鞋等小動作。這表明，幼兒注意力集中的程度很低。觀察中還發現，當幼兒出現注意力分散行為時，鄰座的幼兒很容易受其影響。如有幼兒帶來了卡通貼畫，鄰座的幼兒就可能和他一起看貼畫、分貼畫、搶貼畫、貼貼畫。

2.幼兒在什么樣的活動中容易注意力分散

調查顯示，幼兒在進行師幼互動時最容易注意力分散。教師在提問時，有的幼兒在拉其他幼兒的衣服，跟其他幼兒說話；在朗讀環節，有的幼兒東張西望，有的幼兒在翻看其他頁。幼兒自主閱讀和教師單純講授的過程中，幼兒出現注意力分散的次數也較多，主要表現為呆坐和干擾他人。在幼兒上臺表演期間，留在座位上的幼兒容易注意力分散。

3.教師對幼兒注意力分散行為的處理

幼兒出現注意力分散行為之后，不同老師的關注程度及采取的辦法不盡相同。從統計圖可以看出，幼兒出現注意力分散行為后多依靠自主恢復，也就是幼兒自己玩一會兒之后會覺得沒意思了，便會停止注意力分散行為。相對而言，教師主動引導的比例不高，部分教師看到幼兒出現溜號時甚至不予理睬。

4.幼兒注意力分散行為的性別差異

研究表明，在出現注意力分散行為的孩子中，男孩的比例（占55.9%）要比女孩的比例（占44.1%）高。據觀察顯示，男孩的注意力分散行為多表現為左顧右盼和干擾他人，而女孩則表現為做小動作和呆坐。

三、教育建議

幼兒時期是注意力發展的敏感時期。教師應結合幼兒不同年齡段的特點，在實施各種活動時，科學設計活動，注重教學策略，使幼兒注意力能夠集中。

1.把握教學時間，延長幼兒有意注意的時長

小班幼兒一般只能穩定地集中注意力3～5分鐘，中班幼兒可達10分鐘，大班幼兒可達15分鐘。幼兒教師應根據幼兒不同的年齡段，把握好教學時間，注重教學效率。

2.教師應給予每個幼兒足夠的關注

觀察中發現，那些坐在角落或者位置靠邊的幼兒出現注意力分散的情況最多。教師應對這些幼兒給予較多的關注，并加以引導。同時，教師要關注晨檢環節，對幼兒自帶新奇小玩具、小卡片、小亮片等行為加以限制，必要時可代為保管這些物品。這樣，可避免幼兒受到物品的干擾和刺激而導致注意力分散，也可適當減少安全隱患。

3.善于拋出問題，獲得積極回應

教師應以參與者的身份，努力為幼兒營造一個有趣、輕松的課堂環境。在各類的活動中，教師要避免直接給幼兒提供正確的答案，應增強活動的趣味性，善于創設問題情境，多采用提問的形式，鼓勵幼兒假設與猜想，讓幼兒自主選擇，積極融入活動之中。

4.避免過多地打擾幼兒

在幼兒集中注意力從事某項有意義的活動時，教師應注意調整自己的言行舉止，避免打擾幼兒，分散他們的注意力。如幼兒集中注意力畫畫時，教師應給予幼兒足夠的空間和時間，讓他們自主地去想象、探究、發現，而不能過多地邊走邊講或干涉某個幼兒，影響他們的思路。

5.科學提供對幼兒有意義、使幼兒感興趣的材料

教師為幼兒提供適宜、適量、美觀、隱含教育價值的材料，可以讓他們通過操作材料獲得情感、認知和技能等方面的發展，但材料的投放應注意其中的教育因素。比如，在建構活動中，如果投放的材料太少，孩子不僅不能滿足完整拼搭某種物體的愿望，還可能因為擔心自己僅有的積木被別人搶去，而把注意力轉移到如何保護自己的材料上。而如果投放的材料太多，則會讓孩子們無所適從，他們一會兒玩玩這個，一會兒碰碰那個，根本無法注意力集中地進行某項工作。一般而言，幼兒年齡越小，投放的活動材料的品種應越少，但單類材料的數量應適當多一些；材料需周期性地加以豐富和更新；準備的材料給予孩子創造的空間越大，孩子玩的興趣就越大，注意力也就越集中。

6.教師在講課時應注意音調的變化和音量的調節

教師在活動組織的環節中，應避免出現平淡、無變化的語音、語調，因為單調的聲音容易使人昏昏欲睡。為此，在進行講述時，教師可結合講述內容不斷變化語音、語調，甚至可以模仿各種小動物的聲音，并加上肢體動作，生動有趣地組織活動，吸引幼兒積極參與。

三角形的特性范文第5篇

【摘要】

目的：比較三種不同熒光標記的短雙鏈RNA(siRNA)體外轉染特性. 方法：利用脂質體LipofectamieTM2000轉染三種熒光標記siRNA入小鼠胚胎成纖維細胞系NIH 3T3，流式細胞儀觀察轉染效率，普通倒置熒光顯微鏡觀察其淬滅情況，激光共聚焦顯微鏡觀察其在細胞內的分布情況. 結果：相同轉染條件下三種熒光siRNA進入細胞的速度，細胞內的定位不同，轉染效率不同，三種熒光標記的抗淬滅能力也不同. 結論：熒光標記siRNA可以起到良好的示蹤作用. 用熒光標記siRNA作為無熒光siRNA的分布和轉染效率參照時，要考慮到所選用熒光標記siRNA與無熒光標記siRNA的差異.

【關鍵詞】 熒光標記；siRNA；轉染

【Abstract】 AIM: To compare the transfection character of three different fluorescently labeled small interfering RNA (siRNA) in vitro. METHODS: Three fluorescently labeled siRNA were transfected with LipofectamieTM2000 into NIH 3T3 cells for monitoring their transfection efficiency with flow cytometry， tracking their delivery with confocal microscopy and checking their photostability with fluorescent microscope. RESULTS: These three fluorescently labeled siRNA varied in intracellular distribution， transfection efficiency and quench speed. CONCLUSION: The fluorescence labeled siRNA helps to tracking the delivery of siRNA in cells. The difference between fluorescently labeled siRNA and unlabeled siRNA should be considered when the fluorescently labeled siRNA is used to study the distribution and transfection efficiency of siRNA.

【Keywords】 fluorescence label；small interfering RNA；transfection

0 引言

化學合成的siRNA可以高效特異地抑制靶基因的表達，不僅是分析基因功能的有力工具且有望成為新型藥物［1］，但遞送效率低和體內有效性問題仍然是其應用的瓶頸，因此，深入研究其在體內的分布和動力學過程已逐步受到重視［2］. 利用熒光顯微鏡、流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡等方法檢測熒光標記siRNA［3］，觀察其攝取、分布及代謝情況，借以推斷無熒光標記siRNA的轉染效率和分布. 然而目前雖有多種商品化無沉默效應的熒光標記siRNA可供選擇，但它們的分布和轉染效率是否一致尚少見報道. 本研究比較三種常用熒光標記siRNA利用脂質體轉染時轉染效率、熒光淬滅情況和細胞內分布特點，以探討應用熒光標記siRNA時需注意的問題.

1 材料和方法

1.1 材料

三種熒光siRNA分別為：BLOCKiTTM熒光寡聚物(序列未公開)購自Invitrogen公司；FAM notarget siRNA(正義鏈5′UUCUCCGAACGUGUCACGU3′，FAM標記于5′端)購自廣州銳博公司；Alexa Fluor 546陰性對照siRNA(靶序列 5′AATTCTCCGAACGTGTCACGT3′，正義鏈3′端3標記Alexa Fluor 546)購自Qiagen公司. 前兩種為即用型，后一種按照說明書方法加入退火緩沖液，90℃變性并退火，分裝后避光保存于-20℃. 三種熒光siRNA的儲備液濃度均為20 μmol/L. 小鼠胚胎纖維細胞系NIH3T3由中山大學實驗動物中心細胞庫凍存；高糖DMEM培養基和DPBS購自Gibco BRL公司；胎牛血清購自杭州四季青工程材料研究所；脂質體LipofectamineTM 2000，OptiMEM低血清培養基購自Invitrogen公司；Hochest33342購自美國Sigma公司，其他生化試劑均為進口或國產分析純試劑.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染

NIH3T3細胞常規培養于含100 mL/L胎牛血清無抗生素高糖DMEM培養基，每孔4×104個細胞接種24孔板，24 h后細胞的匯合度達40％. 用LipofectamineTM 2000轉染熒光siRNA，按照說明書操作進行. 不同濃度轉染效率時siRNA各組終濃度分別為0.5，5，40，120 nmol/L，LipofectamineTM 2000均為1 μL. siRNA進入細胞速度時轉染復合物孵育時間分別為1，2，4，6和24 h，siRNA濃度均為40 nmol/L，每組不同時間重復3次；觀察淬滅情況和共聚焦觀察細胞內分布時采用40 nmol/L，觀察時間為4 h.

1.2.2 流式細胞儀檢測

熒光siRNA轉染效率各組細胞用DPBS沖洗2次，0.25 g/L胰蛋白酶消化，用DPBS制成150 μL單細胞懸液，冰上運輸，BD FACSAria流式細胞儀檢測，CellQuest軟件記錄分析.

1.2.3 普通熒光顯微鏡觀察淬滅情況和細胞內分布模式

轉染后6 h后將24孔板直接置于倒置熒光顯微鏡(Leica DMIRE)載物臺上觀察，cold CCD數碼相機Leica Qwin軟件照相. 拍第一張照片時間記為0 min，分別于3 min和5 min后不改動成像參數同一位置再拍攝兩張，觀察熒光淬滅情況.

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察［4］細胞鋪板時24孔板中放滅菌圓形蓋玻片，轉染后6 h培養液中加入Hoechst 33342(終濃度5 mg/L)孵育10 min染核，用DPBS洗3遍后，取出爬片，-20℃預冷丙酮固定10 min，PBS洗3遍，抗淬滅水性封片劑封片. Zeiss LSM 510 META共聚焦顯微鏡40倍物鏡下觀察，BLOCKiTTM熒光寡聚物和FAM notarget siRNA使用488 nm激發光和515～540 nm濾片檢測；Alexa Fluor 546陰性對照siRNA使用568 nm激發光和575～640 nm檢測濾片.

統計學處理： 采用SPSS 13. 0統計軟件處理，χ2分析轉染效率差異，P

2 結果

2.1 FCM檢測熒光siRNA轉染效率

每一樣品收集2×104個細胞，設定一個單細胞區域P1用于熒光分析. 以未轉染的細胞作為空白對照，設定陽性細胞區(P2區)使陰性對照P區細胞數不超過0.1%(圖1A). 40 nmol/L siRNA轉染4 h時轉染效率Alexa Fluor 546陰性對照siRNA的轉染效率為(62.7±2.4)%， BLOCKiTTM熒光寡聚物的轉染效率為(85.1±5.2)%， FAM notarget siRNA的轉染效率為(69.4±3.6)%. χ2分析示Alexa Fluor 546陰性對照siRNA的轉染效率顯著低于BLOCKiTTM熒光寡聚物(P=0.037)，BLOCKiTTM熒光寡聚物的轉染效率顯著高于FAM notarget siRNA的轉染效率(P=0.017)，Alexa Fluor 546陰性對照siRNA的轉染效率低于FAM notarget siRNA BLOCKiTTM熒光寡聚物(P=0.000). 隨著siRNA濃度增加(圖1B)和轉染復合物孵育時間延長(圖1C)，三種熒光標記siRNA的轉染效率增加， 6 h和24 h轉染效率相差不大， 唯FAM notarget siRNA 24 h轉染效率為(59.3±2.5)%. BLOCKiTTM熒光寡聚物在0.5 nmol/L和5 nmol/L濃度時，轉染效率就達FAMsiRNA (27.9±2.5)%和(77.3±3.7)%，孵育1 h和2 h轉染效率達(54.1±4.9)%和(78.2±3.6)%，高于其它兩種(P=0.000).

2.2 普通熒光顯微鏡觀察淬滅情況和細胞內分布模式

三種熒光siRNA在普通熒光顯微鏡下的熒光模式不同. Alexa Fluor 546陰性對照siRNA傾向于以較大顆粒分布在核周胞漿內(圖2A， B， C， D)；BLOCKiTTM熒光寡聚物胞漿、胞核中都有，在胞核中的熒光強度很高(圖2E， F， G， H)；FAM notarget siRNA為細小點狀熒光信號，分布于胞漿和胞核中(圖2I， J， K， L). 用熒光顯微鏡照射3 min(圖2C， G， K)和5 min(圖2D， H， L)發現Alexa Fluor 546陰性對照siRNA抗淬滅能力最高，BLOCKiTTM熒光寡聚物居中，FAM notarget siRNA最低，3 min已幾乎完全淬滅. BLOCKiTTM熒光寡聚物胞漿中的熒光信號先淬滅，而后是胞核中的. 無siRNA只加LipofectamineTM 2000轉染試劑的細胞未見熒光(結果未顯示).

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察三種熒光siRNA細胞內定位40 nmol/L各種siRNA轉染后4 h，Alexa Fluor 546陰性對照siRNA為點狀的熒光，多數位于近核胞漿中(圖3A，D)；BLOCKiTTM熒光寡聚物(圖3B，E)和FAM notarget siRNA(圖3C，F)的模式相似，在核內和胞漿中都可見，部分呈熒光顆粒.

3　討論

脂質體轉染是體外導入化學合成siRNA的標準方法，siRNA體外轉染實驗報道中使用最多的轉染試劑是LipofectamineTM 2000，對許多細胞可以獲得很高的轉染效率和基因沉默效率［3］，所以本研究也選用該試劑作為轉染試劑比較三種熒光標記siRNA的體外轉染特性.

本實驗發現在相同的轉染條件下，三種熒光siRNA的轉染效率不同；BLOCKiTTM熒光寡聚物更易進入細胞，原因可能因為它的核糖骨架經過磷硫酰化修飾［5］，所以其進入細胞的速度明顯增加. 轉染6 h和24 h的效率相差不大，可見LipofectamineTM 2000推薦4 h和6 h更換轉染復合物比較合理，但注意到Alexa Fluor 546陰性對照siRNA 4 h和6 h的轉染效率相差仍比較明顯，所以6 h更換轉染復合物更加合適. FAM notarget siRNA 24 h轉染效率降低為59.3%，原因可能是熒光素淬滅而非轉染效率低.

關于淬滅情況：標記siRNA的熒光物質有許多種，最早有熒光素(fluorescein，FAM)，后來的藻紅素(cy系列)，alexa系列的熒光穩定性和可選擇波長更進了一步. 本研究三種熒光siRNA中熒光素FAM notarget siRNA采用的是FAM標記，BLOCKiTTM熒光寡聚物采用的FITC，似乎都為熒光素，但后者經磷硫酰化修飾，穩定性增強，所以其抗淬滅能力也有所增強. Alexa Fluor 546陰性對照siRNA采用的是Alexa fluor546，其中Alexa fluor546標記的siRNA的抗淬滅能力最強.

關于細胞內的定位：脂質體轉染情況下，siRNA脂質體復合物首先沉積并粘附于細胞表面，然后通過胞吞作用進入細胞形成內含體，在胞漿中通過動力蛋白驅動定向運送到核周區，并迅速在核周區聚集［6］， 最后siRNA從脂質體復合物中釋放出來才能發揮作用. 本研究中用共聚焦顯微鏡觀察發現Alexa Fluor 546陰性對照siRNA幾乎只以顆粒狀分布于近核胞漿中，與Chiu等［3］報道的用LipofectamineTM 2000轉染cy3標記的siRNA結果一致，而BLOCKiTTM熒光寡聚物和FAM notarget siRNA在核內和胞漿中都有，在胞漿中核周區可見大的熒光顆粒. 其中BLOCKiTTM熒光寡聚物的核定位考慮與其磷硫酰化修飾有關，而FAM notarget siRNA為正義鏈5′標記，其核定位可能為與其復合物中混合有單鏈siRNA有關. Ohrt等［7］顯微注射熒光標記的siRNA入Hela細胞的胞漿中，發現雙鏈siRNA不能進入細胞核，而單鏈siRNA有明顯聚集于核內的傾向. 而Alexa Fluor 546陰性對照siRNA未于見核中可能因為siRNA還未從脂質體復合物中釋放. 而siRNA從復合物中釋放是與基因沉默效果相關的，是否說明熒光標記影響基因沉默效果還有待分析.

綜上所述，選取合適的熒光標記siRNA作為轉染效率評估指標和用于細胞內分布研究時，要注意熒光標記物對siRNA的影響，以及靶向目的基因的siRNA與所選用熒光標記的對照siRNA在化學修飾等因素方面的相似性.

參考文獻

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［4］Akita H， Ito R， Khalil IA， et al. Quantitative threedimensional analysis of the intracellular trafficking of plasmid DNA transfected by a nonviral gene delivery system using confocal laser scanning microscopy［J］. Mol Ther， 2004， 9(3):443-451.

［5］Fisher TL， Terhorst T， Cao X， et al. Intracellular disposition and metabolism of fluorescentlylabeled unmodified and modified oligonucleotides microinjected into mammalian cells［J］. Nucleic Acids Res， 1993， 21(16):3857-65.