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撐不住成本壓力
先說航空業(yè)。
6月30日,紐約市場(chǎng)原油期價(jià)再創(chuàng)新高,突破每桶143美元。而油價(jià)變動(dòng)對(duì)航空業(yè)來說最為敏感,國際航空運(yùn)輸協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)顯示,燃油開支在航空公司總成本所占比重也由原來的13%飆至35%。
國內(nèi)第一家貨運(yùn)航空公司揚(yáng)子江快運(yùn)甚至停止普貨業(yè)務(wù)。揚(yáng)子江快運(yùn)新任總裁孫洪祥說,“今年的航空貨運(yùn)的價(jià)格比去年同期降低了4%到5%,而此次油價(jià)又大幅上漲,貨運(yùn)的利潤(rùn)也就是3%到5%,以目前的價(jià)格不大可能賺錢了。”
在當(dāng)前情況下,油價(jià)每上漲1%航空企業(yè)利潤(rùn)將減少4%。
在國際貨運(yùn)市場(chǎng),中國籍航空公司的市場(chǎng)份額不足30%,利潤(rùn)更高的國際航線還主要被外資航空公司壟斷。
專門從事航空貨運(yùn)的翡翠航空?qǐng)?zhí)行副總裁蘇總介紹,其國內(nèi)航線貨運(yùn)價(jià)格調(diào)整申請(qǐng)已經(jīng)提交,正等待批復(fù)之中。因?yàn)閲H航線貨運(yùn)價(jià)格調(diào)整權(quán)在貨運(yùn)航空公司自身,在油價(jià)大幅度上漲后,他們已經(jīng)調(diào)整了國際航線貨運(yùn)價(jià)格。至于國內(nèi)航線貨運(yùn)價(jià)格很多年來都沒有任何變化。
另一方面,隨著國際商品出口的益增放緩,國內(nèi)的航空運(yùn)輸市場(chǎng)還面臨運(yùn)力過剩的問題。目前國內(nèi)已有130個(gè)機(jī)場(chǎng)在運(yùn)營(yíng),而據(jù)國際空運(yùn)市場(chǎng)預(yù)計(jì),未來10年內(nèi)中國還將建設(shè)48個(gè)新機(jī)場(chǎng)。運(yùn)力已經(jīng)開始飽和過剩。競(jìng)爭(zhēng)日益激烈,使到航空公司的利潤(rùn)率越來越低,甚至開始虧損。
深航相關(guān)負(fù)責(zé)人表示,7月1日調(diào)整的燃油附加費(fèi)雖然在一定程度上緩解了航空企業(yè)運(yùn)營(yíng)成本壓力,但航空公司的成本壓力“還有很大距離”,只能說部分抵消,絕對(duì)不是全部抵消,航空公司運(yùn)營(yíng)的成本壓力現(xiàn)在依舊很大,僅目前的上調(diào),遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有緩解油價(jià)帶來的沖擊。
鐵路或首現(xiàn)虧損
再說鐵路運(yùn)輸。
盡管市場(chǎng)大部分焦點(diǎn)在高油價(jià)對(duì)航空業(yè)的影響,但能源成本對(duì)鐵路運(yùn)輸業(yè)影響更大,而柴油價(jià)格上漲對(duì)鐵路運(yùn)營(yíng)的影響更大,因?yàn)橹袊蔫F路電氣化率截至去年底僅32.7%,意味著多數(shù)鐵路線仍在使用柴油機(jī)車。
對(duì)此,中國鐵路運(yùn)輸業(yè)終于打破了沉默。鐵道部發(fā)言人王永平指出,由于燃油成本上升,加上雪災(zāi)和四川地震導(dǎo)致鐵路運(yùn)輸受阻,中國鐵路業(yè)可能十年來首次報(bào)告虧損。
隨即,國家發(fā)展和改革委員會(huì)、鐵道部宣布,從今年7月1日起,調(diào)整國家鐵路貨物統(tǒng)一運(yùn)價(jià)。整車貨物運(yùn)價(jià)每噸公里上調(diào)3分至7分,集裝箱1噸箱上調(diào)3.69分,20英尺箱和40英尺箱分別上調(diào)1.0374元和1.6374元。
市場(chǎng)人士認(rèn)為,從運(yùn)輸收費(fèi)情況來看,運(yùn)營(yíng)價(jià)格收費(fèi)只是其中一個(gè)部分,雜費(fèi)的支出也占據(jù)重要比例,因此此次調(diào)整對(duì)部分上市公司運(yùn)輸成本支出并不大。而且從市場(chǎng)的實(shí)際運(yùn)作經(jīng)驗(yàn)來講,通過稍微提高消費(fèi)產(chǎn)品價(jià)格,很容易就能夠化解貨運(yùn)成本支出增加的壓力。
廣深鐵路和大秦鐵路的燃料成本占銷售成本的20%左右。廣深鐵路約40%的火車使用柴油發(fā)動(dòng)機(jī)。對(duì)此,瑞銀預(yù)計(jì),廣深鐵路今年單位成本將增8%左右。
到了生死邊緣
最后說公路運(yùn)輸。
國內(nèi)長(zhǎng)途運(yùn)輸企業(yè)面臨著更高的運(yùn)輸成本。據(jù)一位交通運(yùn)輸行業(yè)分析師介紹,長(zhǎng)途汽車貨運(yùn)企業(yè)除了面臨用油成本上漲的壓力,宏觀經(jīng)濟(jì)帶來貨量減少,也使得貨運(yùn)企業(yè)的經(jīng)營(yíng)環(huán)境面臨著嚴(yán)峻考驗(yàn)。
河南知名的長(zhǎng)通運(yùn)輸有限公司董事長(zhǎng)楊志萍直言將“帶頭漲價(jià)”。
面對(duì)油價(jià)上漲的成本壓力,有實(shí)力的企業(yè)可以利用市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)地位強(qiáng)行漲價(jià),而更多的小企業(yè)是在咬緊牙關(guān),拼命死扛。
“我們快跑不起了,利潤(rùn)幾乎為零了。”北京縱橫經(jīng)緯物流公司總經(jīng)理黃金偉苦笑著說,“這次漲價(jià)是近幾年壓力最大的一次。對(duì)于我們這些小企業(yè)來說幾乎是不可能完成的任務(wù)。”一升油多漲了1元,從北京到石家莊一個(gè)來回就要多出200多元。物流運(yùn)輸成本主要是耗油費(fèi)用、過路費(fèi)、管理費(fèi)、司機(jī)工資等,這些成本已經(jīng)占到整個(gè)物流成本的80%以上,而油費(fèi)則直接占到1/3~1/2左右,油價(jià)的上漲直接提高了經(jīng)營(yíng)成本,生存壓力劇增。“再漲一分錢也可能成為壓垮我們的最后一根稻草。”
為什么美國縮減QE規(guī)模就導(dǎo)致A股大漲呢?美國實(shí)行緊縮貨幣政策之后,美元就升值,這樣其他國家熱錢就會(huì)回籠到美國,這樣導(dǎo)致中國的熱錢回流到美國,如果熱錢大肆回流到美國,那么,中國經(jīng)濟(jì)目前面臨的兩大問題:一是經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,二是地方債務(wù)的問題就會(huì)爆發(fā),這樣,中國經(jīng)濟(jì)的“軟著陸”很難實(shí)現(xiàn),那么,中國經(jīng)濟(jì)將要出現(xiàn)新的問題,因此當(dāng)美國縮減QE規(guī)模,在這三天時(shí)間里我們看到了市場(chǎng)大肆上漲,而且上漲的大多數(shù)是我們上周分析的高鐵等運(yùn)輸設(shè)備板塊以及港口等交通設(shè)施板塊,以藍(lán)籌股居多。
反觀深市的主板和中小板以及創(chuàng)業(yè)板指數(shù)就沒有滬市的大盤指數(shù)上漲力度大,并且創(chuàng)業(yè)板指數(shù)和中小板指數(shù)出現(xiàn)縮量調(diào)整跡象,種種跡象表明在目前“滬港通”還不能開通的情況下,美國QE縮減也會(huì)重現(xiàn)點(diǎn)燃藍(lán)籌股行情。在所有的藍(lán)籌股當(dāng)中,有很多藍(lán)籌股還沒有大幅啟動(dòng),我們看看哪些藍(lán)籌股在未來機(jī)會(huì)明顯?
新華保險(xiǎn)(601336):公司歷史悠久并且為中國最大的個(gè)人壽險(xiǎn)產(chǎn)品提供商之一。根據(jù)中國保監(jiān)會(huì)的數(shù)據(jù),以保險(xiǎn)保費(fèi)數(shù)據(jù)收入計(jì)算,在2014年上半年,壽險(xiǎn)收入668億元,同比增長(zhǎng)30%,市場(chǎng)占有率8.7%,位列中國保險(xiǎn)市場(chǎng)第三位。自2013年12月底,匯金公司增持該公司約占總股本的31.34%。
應(yīng)該說,整個(gè)保險(xiǎn)類板塊,之前都沒有大幅啟動(dòng),但是,新華保險(xiǎn)公司在最近7個(gè)交易日當(dāng)中,迅速拉出新的上升通道,建議積極關(guān)注,止損價(jià):24元。
大唐發(fā)電(601991):公司是京津唐電網(wǎng)最大的獨(dú)立發(fā)電公司,并且在山東、甘肅、云南等地?fù)碛羞\(yùn)營(yíng)電廠,已經(jīng)發(fā)展成為一家全國性的發(fā)電公司。截止2014年6月30日,公司管理裝機(jī)容量中水電為4934兆瓦,占12.44%。2014年7月,公司與國新公司就煤氣化項(xiàng)目進(jìn)行了重組,公司控股的多倫煤化工是年產(chǎn)46萬噸的煤化工項(xiàng)目已經(jīng)達(dá)到使用狀態(tài),該項(xiàng)目總投資162億元。
從該公司技術(shù)形態(tài)來分析,該股從今年7月大盤上漲以來,并沒有大幅上漲,一直處于橫盤情況,建議積極關(guān)注這樣橫盤整理的個(gè)股,止損價(jià):3.90元。
有一次要考試了,在考試的前一天晚上,小明把不會(huì)的內(nèi)容多看一遍,不會(huì)的字抄十遍,等覺得自己可以考100了才去睡覺,而小亮呢,他跑到樓下打鬧去了。
到了考試的那一天,數(shù)學(xué)下課,小明又把考試的內(nèi)容復(fù)習(xí)了一遍。
上課鈴響了,同學(xué)們興沖沖的跑進(jìn)教室。開始考試了小亮一道題都不會(huì)做,全是亂猜的,同桌小明為了不讓小亮抄答案就用書擋住了。下課了,老師讓組長(zhǎng)收試卷送到辦公室。小明又看了一遍語文書,看她寫的對(duì)不對(duì)。
[關(guān)鍵詞] 多重耐藥性;革蘭氏陰性桿菌;Ⅰ類整合子;基因擴(kuò)增
[中圖分類號(hào)] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-7210(2013)04(c)-0091-04
抗生素作為治療人類感染性疾病的主要藥物,其臨床有效性是人類健康的重要保障。但是目前因抗生素的濫用和使用不當(dāng)導(dǎo)致出現(xiàn)大量的耐藥細(xì)菌,細(xì)菌耐藥性的存在大大降低了抗生素的臨床治療效果并大幅增加了疾病治療的成本[1]。但是,因抗生素的研發(fā)周期較長(zhǎng),抗生素更新的速度遠(yuǎn)低于細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的速度。目前,我國已成為當(dāng)今世界抗生素濫用程度和使用量最大的國家[2],并且每年都在大幅增加。在感染性疾病中,因革蘭陰性桿菌[3]所致的疾病占主要比例,抑制革蘭陰性桿菌耐藥性的產(chǎn)生對(duì)于感染性疾病的治療具有重要的臨床意義。國外早在20世紀(jì)80年代末即對(duì)細(xì)菌耐藥基因的水平傳播進(jìn)行了研究,并通過實(shí)驗(yàn)證細(xì)菌耐藥基因的傳播與一種稱為整合子的移動(dòng)基因原件有著密切的關(guān)系[4]。關(guān)于整合子,目前研究證實(shí)其為一類可特異性識(shí)別并捕獲移動(dòng)基因盒的基因重組系統(tǒng),能夠通過整合耐藥性相關(guān)的基因盒而使細(xì)菌的耐藥性在細(xì)菌間水平傳播[5]。研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)菌中目前主要存在Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類這3種整合子[6],且以Ⅰ類整合子的存在比例最大,該類整合子與細(xì)菌特別是革蘭陰性桿菌的多重耐藥性的產(chǎn)生有密切關(guān)系。探明Ⅰ類整合子在革蘭陰性桿菌中的功能和其結(jié)構(gòu)對(duì)于抑制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生、提高抗生素的治療效果而言是一項(xiàng)重要的工作。本研究以多重耐藥銅綠假單胞菌和多耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌為研究對(duì)象,對(duì)其體內(nèi)的Ⅰ類整合子的功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究分析,現(xiàn)報(bào)道如下:
1 材料與方法
1.1 菌株來源
選擇溫嶺市婦幼保健院2009年7月~2011年10月的多重耐藥革蘭陰性桿菌80株,其中銅綠假單胞菌40株,鮑曼不動(dòng)桿菌40株。分離自呼吸科病房15株(銅綠假單胞菌7株,鮑曼不動(dòng)桿菌8株),腎內(nèi)科病房12株(銅綠假單胞菌5株,鮑曼不動(dòng)桿菌7株),消化科病房12株(銅綠假單胞菌9株,鮑曼不動(dòng)桿菌3株),腫瘤科病房14株(銅綠假單胞菌6株,鮑曼不動(dòng)桿菌8株),泌尿外科病房13株(銅綠假單胞菌5株,鮑曼不動(dòng)桿菌8株),血液科病房14株(銅綠假單胞菌5株,鮑曼不動(dòng)桿菌9株)。40株銅綠假單胞菌中,分離于血液標(biāo)本5株,痰標(biāo)本17株,尿標(biāo)本9株,膿標(biāo)本6株、其他3株;40株鮑曼不動(dòng)桿菌中,分離于尿標(biāo)本11株、痰標(biāo)本7株、血液標(biāo)本12株、膿標(biāo)本7株,其他3株。細(xì)菌的篩選與純化均由全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)完成(法國梅里埃公司,VITEC-2 COMPACT),細(xì)菌純度一致,無其他雜菌,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。
1.2 試劑與儀器
主要試劑:瓊脂(天跟生化公司),溴化乙錠(天跟生化公司),限制性內(nèi)切酶 HinfⅠ(大連寶生物工程有限公司),瓊脂糖(杭州天和微生物試劑有限公司),無菌蒸餾水(屈臣氏蒸餾水,經(jīng)滅菌自制),2×Taq PCR Master Mix(大連寶生物工程有限公司),10×H buffer(大連寶生物工程有限公司),dNTP(杭州天和微生物試劑有限公司),DNA聚合酶(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、藥敏紙片(OXOID公司生產(chǎn),分別含有阿莫西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢哌酮-舒巴坦、環(huán)丙沙星、亞胺培南、氨曲南、頭孢克定、復(fù)方新諾明、鏈霉素、氯霉素、阿米卡星、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢克肟、頭孢西丁、鏈霉素、頭孢他定等藥物)。
主要儀器:無菌操作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠生產(chǎn)),恒溫水浴箱(天津大學(xué)精密儀器廠),ZF-302型紫外分析儀(梅特勒公司生產(chǎn)),M1706700PCR擴(kuò)增儀(Thermo 公司生產(chǎn)),臺(tái)式高速離心機(jī)(BECKMAN公司生產(chǎn)),恒溫培養(yǎng)箱(永生生物儀器公司生產(chǎn)),電泳儀(北京六一儀器廠生產(chǎn)),凝膠成像分析系統(tǒng)(GIS-2010,上海天能科技有限公司)
1.3 研究方法
為闡明Ⅰ類整合子在革蘭氏耐藥桿菌中的功能與其結(jié)構(gòu),在本次研究中,首先對(duì)細(xì)菌的耐藥性、耐壓細(xì)菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ELSBs)的情況進(jìn)行了考察。篩選出耐藥且產(chǎn)ELSBs的菌株后,通過PCR技術(shù)對(duì)Ⅰ類整合子的存在情況進(jìn)行了考察,并通過電泳和基因測(cè)序以及Sourthen雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)Ⅰ類整合子的基因結(jié)構(gòu)、基因定位等方面進(jìn)行了考察,具體方法如下所示:
1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑的配制
溴化乙錠(10 mg/mL)的配制方法為,精密稱量溴化乙錠1 g,使用100 mL去離子水進(jìn)行溶解,充分震蕩直至其完全溶解,隨后轉(zhuǎn)入棕色容量瓶中,避光低溫下保存,備用。瓊脂糖凝膠的配制方法,精密稱取理論量的瓊脂糖,使用l×TAE緩沖液對(duì)其進(jìn)行潤(rùn)濕,隨后放入微波爐中使之融化,融化后待其冷卻至60℃時(shí),加入適量溴化乙錠溶液,充分震蕩使之均勻,使制備的濃度為0.5 μg/mL。
1.3.2 藥敏實(shí)驗(yàn)
在本次研究中,使用藥敏實(shí)驗(yàn)對(duì)銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)方法為紙片法,主要分為K-B紙片法藥敏檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和雙紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)[7],前者測(cè)定受試菌株的藥物敏感性,后者測(cè)定菌株體內(nèi)ELSBs的存在情況。
1.3.2.1 K-B紙片法 將瓊脂加熱融化,制備無菌瓊脂培養(yǎng)平板,板厚約1 cm,備用。將銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌用麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行濃度校正,配制0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌溶液,并將多余菌群濾去,使菌液均勻。隨后,于無菌操作臺(tái)內(nèi)使用無菌棉簽沾取標(biāo)準(zhǔn)濃度的細(xì)菌溶液,以涂布的方法將細(xì)菌接種于瓊脂培養(yǎng)平板之中。平板接種后,將其置于室溫下自然干燥3~5 min,隨后將含有一定量抗生素藥物的紙片緊貼于平板表明。圓形紙片中心距離約24 mm,紙片與平板內(nèi)緣的距離保持在15 mm左右。紙片貼在培養(yǎng)平板以后,其中所含的藥物在吸收瓊脂內(nèi)水平的情況下逐漸向四周擴(kuò)散,形成具有遞減特點(diǎn)的藥物部分平板。紙片于瓊脂平板上覆蓋完全后,將其置于37℃溫度下培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結(jié)束后根據(jù)最低抑菌濃度法(MIC)的原理并參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)[8]測(cè)量抑菌圈的大小,對(duì)銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
1.3.2.2 雙紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn) ELSBS是革蘭陰性細(xì)菌中的耐藥機(jī)制產(chǎn)生的一個(gè)重要因素,該酶的與Ⅰ類整合子的存在有著密切關(guān)系,對(duì)于闡述Ⅰ整合子陽性細(xì)菌多重耐藥產(chǎn)生的原因有重要意義。在本次實(shí)驗(yàn)中,其操作為:使用麥?zhǔn)媳葷峁苤苽?.5麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌混懸液,使用無菌操作方法將其均勻涂布于瓊脂平板上,將含有阿莫西林-克拉維酸的含藥紙片緊貼在平板中央,以該紙片為中心,于其周圍25 mm處分別貼上含有頭孢拉定、頭孢曲松、頭孢呋辛、氨曲南的藥敏紙片作為ELSBS的指示劑,在35℃下對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)18 h。平板培養(yǎng)完畢后,觀察抑菌圈的變化,若抑菌圈朝著阿莫西林-克拉維酸方向有擴(kuò)大現(xiàn)象,則說明該類菌株體內(nèi)產(chǎn)生ELSBS。
1.3.3 Ⅰ類整合子基因PCR擴(kuò)增
基因的擴(kuò)增原理[9]為以目的基因的單鏈DNA為模版,在DNA聚合酶的作用下與含有3'、5'末端的互補(bǔ)DNA引物結(jié)合,按照半保留復(fù)制的擴(kuò)增法則進(jìn)行。在擴(kuò)增過程中,DNA分子依次經(jīng)歷了變性、退火、延伸三個(gè)過程,并依次循環(huán)重復(fù)上述過程而逐漸實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。在本次實(shí)驗(yàn)中,從耐藥和產(chǎn)生ELSBs的兩類耐藥菌株中分別隨機(jī)選取25株,共計(jì)50株,其進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),分別對(duì)針對(duì)Ⅰ類整合子的保守區(qū)和可變區(qū)進(jìn)行了相應(yīng)的擴(kuò)增,旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)Ⅰ類整合子結(jié)構(gòu)的分析。
1.3.3.1 基因模版的制備與擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì) DNA的模版制備即為基因擴(kuò)增的倒序行為,其過程則為延伸、退火、變性。本次研究中,使用煮沸法對(duì)DNA擴(kuò)增模版進(jìn)行了制備。具體操作為:將銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌于無菌條件下接種于瓊脂培養(yǎng)平板上,37℃的溫度下培養(yǎng)24 h。精密量取1 mL生理鹽水加入麥?zhǔn)媳葷峁苤校S后使用無菌針挑取瓊脂平板中的菌落,按照麥?zhǔn)媳葷岱ǖ牟僮鞣椒ㄖ苽?個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌混懸液。所制備的菌液倒入離心管中,5000 r/min離心5 min,取上清液,隨后加入300 μL無菌蒸餾水并置于水浴鍋中煮沸10 min,煮沸后轉(zhuǎn)入冰箱進(jìn)行快速冷卻3 min。菌液冷卻后進(jìn)行10 000 r/min離心10 min,將上清液除去,所制備的沉淀物即為DNA模版,轉(zhuǎn)入-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>
引物設(shè)計(jì)方面,參照GeneBank上所公布的基因序列和Ⅰ類整合子的整合酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn),使用Primer Prernier 5.0軟件分別對(duì)Ⅰ類整合子的保守區(qū)和可變區(qū)的引物進(jìn)行了設(shè)計(jì)。可變區(qū)的上游引物結(jié)構(gòu)為5'-GGCATCCAGGACGCAAGT-3',下游引物結(jié)構(gòu)為5'-AAGCAGATTGACCTGAG-3',引物片段設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為800~3200 bp。保守區(qū)的上游引物結(jié)構(gòu)為5'-ATCGCAArAGTTGGCGAAGT-3'(qaeE1-F),下游引物結(jié)構(gòu)為5'-GCAAGGCGGAAACCCGCGC-3'(sul 1-B),理論設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為800 bp。
1.3.3.2 Ⅰ類整合子保守區(qū)的PCR擴(kuò)增 在DNA擴(kuò)增時(shí),其體系包括聚合引物、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、基因模版、DNA聚合酶以及含有Mg2+的緩沖溶液。基于此反應(yīng)體系,在50 μL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)室,分別加入0.5 μL Ex Taq溶液、5 μL的10×Ex Taq緩沖溶液、dNTP混合物5 μL,含有理論量上游引物溶液1 μL,DNA模版溶液4 μL,無菌蒸餾水33.5 μL。擴(kuò)增條件為:95℃溫度下預(yù)變性5 min,隨后94℃溫度下反應(yīng)30 s,60℃保持30 s,72℃ 1 min,共計(jì)循環(huán)30次,最后在72℃的情況下使所擴(kuò)增的DNA延伸10 min。
1.3.3.3 Ⅰ類整合子可變區(qū)的PCR擴(kuò)增 對(duì)Ⅰ類整合子的保守區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,通過測(cè)定含有標(biāo)志性基因片段qaeE1-F和sul 1-B的陽性出現(xiàn)率篩選出Ⅰ類整合子陽性的多重耐藥菌株。在Ⅰ類整合子陽性的銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中隨機(jī)抽取40株,每類細(xì)菌20株。根據(jù)“1.3.3.1”中的底物設(shè)計(jì)方法和模版制作方法設(shè)計(jì)底物,隨后在可變區(qū)擴(kuò)增反應(yīng)體系中對(duì)Ⅰ類整合子的可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為(50 μL):依次加入0.5 μL Ex Taq溶液、5 μL dNTP混合物溶液,5 μL 10×Ex Taq buffer、可變區(qū)上下游擴(kuò)增引物各1 μL、隨后加入4 μL DNA模板標(biāo)準(zhǔn)溶液并用無菌蒸餾水33.5 μL稀釋至反應(yīng)體積。循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性3 min,94℃、62℃各30 s,72℃ 30 s,組后再72℃ 6 min,使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸,循環(huán)次數(shù)為30次。
1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析
1.4.1 Ⅰ類整合子保守區(qū)的基因序列測(cè)定與分析
Ⅰ類整合子保守區(qū)PCR擴(kuò)增后,取產(chǎn)物7 μL,使用Ph 8.0且含有0.50 μg/mL溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析,電壓100V,電泳時(shí)間30 min,確定Ⅰ類整合子的典型擴(kuò)增帶,電泳后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后送往專業(yè)測(cè)序機(jī)構(gòu)進(jìn)行純化與測(cè)序。
1.4.2 Ⅰ類整合子可變區(qū)的基因測(cè)序與分析
Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后,取PCR產(chǎn)物8 μL、10×H buffer溶液2 μL、HinfI溶液1 μL(5 μg/μL)置于反應(yīng)體系中,隨后使用可變區(qū)基因限制性內(nèi)切酶HinfⅠ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析,于37℃下水浴處理4 h。酶切處理完成后,對(duì)其基因片段進(jìn)行電泳分析,篩選出出現(xiàn)頻率最高的片段,并將其送至專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行純化與測(cè)序分析。序列測(cè)定后,通過登錄GeneBank進(jìn)行基因比對(duì),確定可變區(qū)內(nèi)的基因盒種類。
1.5 整合子定位分析
為明確Ⅰ類整合子的具置,對(duì)所有Ⅰ類整合子陽性的菌株的整合子基因進(jìn)行了Sourthen雜交實(shí)驗(yàn)。按照Sourthen雜交實(shí)驗(yàn)的操作方法和所用試劑盒的操作指南,對(duì)Ⅰ類整合子的基因定位進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,40株銅綠假單胞菌中出現(xiàn)多重耐藥性的菌株為36株,40株鮑曼不動(dòng)桿菌中出現(xiàn)多重耐藥性的菌株為37株。ELSBs測(cè)定實(shí)驗(yàn)顯示,36株多重耐藥的銅綠假單胞菌中有27株產(chǎn)生ELSBs,占總菌株的百分比為67.5%(27/40),37株多耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌中28株產(chǎn)生了ELSBs,占總菌株的百分比為70.0%(28/40)。對(duì)耐藥且產(chǎn)生ELSBs的細(xì)菌進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序的結(jié)果顯示,25株多重耐藥銅綠假單胞菌中同時(shí)出現(xiàn)基因片段qaeE1-F和sul 1-B陽性的菌株23株,25株多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌中同時(shí)出現(xiàn)基因片段qaeE1-F和sul 1-B陽性的菌株22株。保守區(qū)作為基因的非可變區(qū)域,其基因片段具有特異性的特點(diǎn),qaeE1-F和sul 1-B作為Ⅰ類整合子保守區(qū)的基因片段,當(dāng)這兩種片段同時(shí)出現(xiàn)時(shí),即表示該類細(xì)菌體內(nèi)含有Ⅰ類整合子。換言之,通過對(duì)Ⅰ類整合子的保守區(qū)基因的擴(kuò)增和測(cè)序,最終結(jié)果顯示,40株銅綠假單胞菌中Ⅰ類整合子陽性的菌株數(shù)為23株,陽性率為57.5%(23/40);40株鮑曼不動(dòng)桿菌中Ⅰ類整合子陽性的菌株數(shù)為22株,陽性率為55.0%(22/40)。此外,對(duì)保守區(qū)進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,位于324 bp擴(kuò)增帶附近的基因序列可能為Ⅰ類整合子的基因區(qū)域。在Ⅰ類整合子可變區(qū)的擴(kuò)增與測(cè)序方面,使用限制性內(nèi)切酶對(duì)可變區(qū)基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分酶切分析和電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,長(zhǎng)度為0.15、1.00、2.00、2.30 kb的基因片段出現(xiàn)的頻率較高,經(jīng)測(cè)序證實(shí),0.15 kb含有Ⅰ類整合子保守區(qū)的基因結(jié)構(gòu)qaeE1-F和sul 1-B。1.00、2.00、2.30 kb長(zhǎng)度的基因分別為aadA、aaeA4、catB8基因盒。Sourthen雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在所有Ⅰ類整合子陽性的菌株中,銅綠假單胞菌23株中Ⅰ類整合子位于質(zhì)粒上的菌株共18株,比例為78.3%(18/23),22株鮑曼不動(dòng)桿菌中Ⅰ類整合子位于質(zhì)粒上的菌株共17株,比例為73.9%(17/23)。通過上述結(jié)果可以看出,革蘭陰性細(xì)菌的耐藥性、ELSBs的產(chǎn)生與Ⅰ類整合子的存在有著密切的關(guān)系。
3 討論
細(xì)菌多重耐藥性的產(chǎn)生,不僅大大增加了疾病治療的成本,同時(shí)給抗生素的研發(fā)與使用也帶來了巨大的壓力。Ⅰ類整合子作為多重藥性細(xì)菌體內(nèi)的一個(gè)重要基因部件[10],目前越來越多的研究證實(shí)其與細(xì)菌耐藥性的遺傳和變異有著密切的關(guān)系。在Ⅰ類整合子的檢測(cè)方面,目前已PCR擴(kuò)增技術(shù)為主,通過對(duì)Ⅰ類整合子基因保守區(qū)和可變區(qū)的基因結(jié)構(gòu)的分析實(shí)現(xiàn)對(duì)Ⅰ類整合子功能和結(jié)構(gòu)的研究。通過大量的研究證實(shí),Ⅰ類整合子在胃腸疾病的致病菌中存在的比例較高,且以銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌較多[11]。在本次研究中,以銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌為研究對(duì)象,對(duì)Ⅰ類整合子在多耐藥革蘭陰性桿菌中的功能和其基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了研究與分析,使用藥敏實(shí)驗(yàn)篩選出了多重耐藥且產(chǎn)ELSBS的銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌,以篩選出的菌株為研究對(duì)象,通過PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序發(fā)現(xiàn),qaeE1-F和sul 1-B這兩個(gè)基因序列為Ⅰ類整合子的保守區(qū)的特征基因序列,兩種序列的同時(shí)出現(xiàn)即可判定該株細(xì)菌體內(nèi)攜帶有Ⅰ類整合子。通過對(duì)比可發(fā)現(xiàn),Ⅰ類整合盒子的陽性率與細(xì)菌的耐藥性的出現(xiàn)有著較好的一致性。雖然有研究稱,qaeE1-F和sul 1-B兩者出現(xiàn)一個(gè)即可判定細(xì)菌攜帶有Ⅰ類整合子,但有研究證實(shí),qaeE1-F和sul1-B的單一出現(xiàn)與整合子陽性檢出之間并不具有相關(guān)性,說明細(xì)菌在耐藥性產(chǎn)生的同時(shí)存在著變異的現(xiàn)象[12-13]。因此,在本次研究中,將保守區(qū)兩種特征基因片段的同時(shí)出現(xiàn)作為Ⅰ類整合子的陽性檢出憑證更為合理。保守區(qū)的基因測(cè)序和分析結(jié)果不僅證實(shí)了,qaeE1-F和sul 1-B兩種基因片段的存在,也從側(cè)面證實(shí)了這兩種基因片段為Ⅰ類整合子所必備的基因結(jié)構(gòu),是細(xì)菌多重耐壓性產(chǎn)生的必要條件。
保守區(qū)的PCR擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果顯示,Ⅰ類整合子在324 kb擴(kuò)增帶處集中出現(xiàn),且以0.15、1.00、2.00和2.30kb長(zhǎng)度的基因片段的出現(xiàn)頻率最高,通過測(cè)序證實(shí)0.15 kb基因片度還有Ⅰ類整合子保守區(qū)的結(jié)構(gòu),其他三種片度則對(duì)應(yīng)著aadA、aaeA4、catB8這兩種基因盒。該結(jié)果表明,可變區(qū)雖然為Ⅰ類整合子的基因可改變區(qū)域,但其所含的特征基因盒和攜帶的保守區(qū)的基因片段并不會(huì)出現(xiàn)大幅度改變,該性能也是保持Ⅰ類整合子基因傳播功能的基礎(chǔ)保障。Sourthen雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大部分的Ⅰ類整合子位于細(xì)菌質(zhì)粒上,這種基因定位方式為Ⅰ類整合子的完整傳播特性也提供了結(jié)構(gòu)保障[14-16]。
目前關(guān)于Ⅰ類整合子的研究還處于起步階段,Ⅰ類整合子的結(jié)構(gòu)和功能的研究依然無法滿足抑制細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的需要。在整合子的研究中,除了Ⅰ類整合子以外,也發(fā)現(xiàn)了Ⅱ類和Ⅲ類整合子,僅僅研究其中的一種對(duì)于完全闡釋細(xì)菌耐藥機(jī)制的產(chǎn)生是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。在將來的研究中,更為綜合地研究細(xì)菌整合子的功能與結(jié)構(gòu)以及探索新型的耐藥機(jī)制相關(guān)的基因部件依然是當(dāng)前細(xì)菌耐藥研究領(lǐng)域中的一項(xiàng)重要任務(wù)。
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1 音樂教育影響著幼兒的審美能力
在當(dāng)前幼兒教育階段,音樂教育包括了唱歌、韻律活動(dòng)、音樂游戲和打擊樂以及音樂欣賞,這些內(nèi)容都是美育的內(nèi)容,也是美育的主要手段。通過這些音樂活動(dòng)能夠培養(yǎng)幼兒對(duì)音樂的興趣和愛好,提高他們對(duì)音樂的感受力。同時(shí),在音樂的感染下提高了幼兒的審美能力,激發(fā)了幼兒感受美、表現(xiàn)美的情趣,豐富了他們的審美經(jīng)驗(yàn),促進(jìn)了幼兒對(duì)美好事物的喜愛和對(duì)美好生活的向往,建立起了健康的審美觀點(diǎn),使每個(gè)幼兒都真正獲得了美的體驗(yàn),進(jìn)而達(dá)到美育的教育目的。
1.1 培養(yǎng)幼兒感受音樂美的能力。音樂中優(yōu)美動(dòng)聽的旋律,會(huì)撥動(dòng)幼兒心靈中的琴弦,使之產(chǎn)生豐富的美感體驗(yàn)。由于幼兒的知識(shí)、經(jīng)驗(yàn)思維發(fā)展水平有限,這種體驗(yàn)往往很膚淺、不穩(wěn)定,需要精心指導(dǎo),因而在引導(dǎo)幼兒感受音樂美時(shí),必須做到以下兩點(diǎn):一是要選好音樂。幼兒的審美具有直觀性和形象性等特點(diǎn),他們只對(duì)生動(dòng)形象、具體直觀的審美對(duì)象產(chǎn)生興趣、萌生美感。應(yīng)選擇一些符合幼兒審美特點(diǎn)的優(yōu)秀音樂作品;二是要引導(dǎo)幼兒對(duì)構(gòu)成音樂美的諸要素有充分的感受力。我們分以下幾個(gè)步驟進(jìn)行:首先讓幼兒安靜地傾聽音樂,幫助幼兒熟悉音樂,仔細(xì)體會(huì)優(yōu)美的旋律、明快的節(jié)奏、飽滿的和聲等,初步產(chǎn)生印象美;其次讓幼兒邊聽邊打節(jié)奏,培養(yǎng)幼兒對(duì)音樂速度、力度和節(jié)奏的感受力;最后讓幼兒邊聽邊想,使幼兒在愉快的音樂氛圍中對(duì)音樂所表現(xiàn)的不同形象和情節(jié)進(jìn)行想象,提高幼兒的興趣,為幼兒感受、表現(xiàn)和創(chuàng)造音樂美提供表象依據(jù)。
1.2 培養(yǎng)幼兒表現(xiàn)音樂美的能力。幼兒在反復(fù)聆聽、充分感受音樂的過程中逐步對(duì)音樂產(chǎn)生興趣后,隨即會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的表演欲望,這是由于幼兒的審美情感強(qiáng)烈、外露所致。我們要因勢(shì)利導(dǎo),啟發(fā)幼兒將自己對(duì)音樂美的感受進(jìn)行思維加工,用語言和動(dòng)作充分展示出來,培養(yǎng)幼兒對(duì)音樂美的表達(dá)能力。有一次,幼兒在充分感受了《懶惰蟲》音樂之后,我啟發(fā)他們說一說聽了音樂后有什么感覺,孩子們紛紛舉手。有的說:“懶惰蟲的做法不對(duì)。”這是對(duì)音樂性質(zhì)(進(jìn)行曲)的感受,有的說“我不想做懶惰蟲”……孩子們盡情地述說著他們對(duì)音樂美的理解和感受。
1.3 培養(yǎng)幼兒創(chuàng)造音樂美的能力。隨著幼兒音樂知識(shí)、經(jīng)驗(yàn)的積累及情感的發(fā)展,他們渴望用自己特有的方式來表現(xiàn)對(duì)美的感受和理解,萌生音樂的創(chuàng)造力。這時(shí),我們應(yīng)有意識(shí)地加以引導(dǎo)和培育。我在讓幼兒表演《小雨沙沙》之后,繼續(xù)鼓勵(lì)他們聯(lián)想:小雨還可以做什么?啟發(fā)幼兒創(chuàng)編歌詞和動(dòng)作,引導(dǎo)幼兒創(chuàng)編音樂節(jié)奏型、配樂器演奏……通過這些創(chuàng)編活動(dòng),讓每個(gè)幼兒都有充分展示自己創(chuàng)編音樂美的機(jī)會(huì),使幼兒逐漸從感知音樂表面形式美過渡到理解音樂作品的內(nèi)在美。同時(shí),當(dāng)幼兒對(duì)音樂作品的興趣越來越濃時(shí),要抓住時(shí)機(jī),設(shè)法將幼兒頭腦中豐富的美感體驗(yàn)引入表現(xiàn)階段,發(fā)展幼兒的形象思維能力,并通過啟發(fā)和引導(dǎo),培養(yǎng)幼兒對(duì)音樂美的創(chuàng)造能力。
2 音樂教育影響著幼兒情感的發(fā)展
音樂能夠觸動(dòng)人的情感,美好的音樂作品能夠使人振奮,能夠使人感染。隨著幼兒社會(huì)交往不斷擴(kuò)大,情感體驗(yàn)社會(huì)越來越豐富。通過音樂教育就能大大促進(jìn)幼兒情感的健康發(fā)展,使其懂得對(duì)美好的喜愛和對(duì)丑惡的憎恨,產(chǎn)生同情心和自豪感。我們?cè)诎嘀性O(shè)立了“音樂區(qū)”,其中放置了一些頭飾、彩帶、節(jié)奏樂器等,通過播放音樂,讓孩子們自由表演、自由創(chuàng)作,孩子們可開心了,當(dāng)響起輕快的音樂時(shí),學(xué)生都會(huì)做自己喜歡的動(dòng)作,很多人都說:“女孩比較喜歡音樂,男孩就喜歡玩。”其實(shí)不然,我發(fā)現(xiàn)我班的很多男孩也很喜歡音樂,但是由于平時(shí)主動(dòng)參與的不多,看到女孩跳的那么好自己也就不好意思唱唱跳跳了。發(fā)現(xiàn)了男孩的這一特點(diǎn)后,我們就多為班中的男孩子創(chuàng)造機(jī)會(huì),多鼓勵(lì)他們,多讓他們大膽表現(xiàn)自己,現(xiàn)在有很多男孩子很喜歡跟著音樂唱唱跳跳,有時(shí)還能自編許多優(yōu)美的動(dòng)作。我們還給幼兒提供一些廢舊材料,如:易拉罐、玻璃瓶、盒子等,通過孩子自己動(dòng)手制作各種打擊樂器、頭飾等,讓孩子們?cè)谧鲋袑W(xué)、做中玩。
3 音樂教育影響著幼兒聽覺、記憶的發(fā)展
幼兒學(xué)習(xí)音樂,首先是靠他的聽覺得到,然后在多次視聽中學(xué)會(huì)欣賞音樂,鑒別音樂,感受音樂,表達(dá)音樂。在不斷的學(xué)習(xí)過程中,幼兒聽覺能力得到加強(qiáng)與提高。當(dāng)然,在此過程中,幼兒不僅靠聽覺學(xué)習(xí),而且更要靠記憶來鞏固。只有幼兒在記住歌詞、旋律、舞蹈動(dòng)作的前提下,才能學(xué)會(huì)唱歌、跳舞,才能使幼兒的記憶力得到不斷發(fā)展。同時(shí),幼兒在集體的音樂活動(dòng)中,他們之間的相互影響、相互交流也會(huì)促進(jìn)記憶力的發(fā)展。培養(yǎng)孩子的音樂記憶力是智力發(fā)展的重要構(gòu)成部分,它是創(chuàng)造音樂活動(dòng)的基礎(chǔ)。
4 音樂教育影響著幼兒想象力、創(chuàng)造力以及語言的發(fā)展
幼兒時(shí)期正是形象思維占主要地位的時(shí)期,是由再造想象逐步向創(chuàng)造想象發(fā)展的時(shí)期。幼兒在進(jìn)行內(nèi)容豐富的音樂活動(dòng)中,可運(yùn)用想象進(jìn)行創(chuàng)造。如:一段悠揚(yáng)的旋律,幼兒可以想象成小魚游水,鴨子嬉戲,還可以在此基礎(chǔ)上,創(chuàng)造性地想象自我在大海或天空中翱游、飛翔。幼兒在想象音樂、創(chuàng)造音樂的同時(shí),為了表達(dá)內(nèi)心世界,他就要積極地運(yùn)用語言來展現(xiàn),把自己的想法體驗(yàn)與周圍的人進(jìn)行交流,在交流中加強(qiáng)了語言能力的發(fā)展。