免疫抑制劑
前言：想要寫出一篇令人眼前一亮的文章嗎？我們特意為您整理了5篇免疫抑制劑范文，相信會為您的寫作帶來幫助，發現更多的寫作思路和靈感。
免疫抑制劑范文第1篇
目前，器官移植已達到相當成功的水平，這與免疫抑制劑，特別是環孢素A（CsA）在臨床應用是分不開的。但是CsA存在著毒副作用大，治療窗窄等問題，因此人們一直在尋找和開發新型免疫抑制劑。
FTY720（以下簡稱FTY），化學名2-amino-2[2-(4-octylphenyl)ethy-1]-1，3 propanediol hydrochloride，是一種新合成的免疫抑制劑。它是將冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-Ⅰ進行結構改造而成。該藥研制成功至今雖然只有三四年的時間，但它已經顯示出顯著的免疫抑制效果和獨特的作用。下面就該藥的特點，綜述相關文獻。
1 顯著的免疫抑制作用
1.1 在各種移植模型中的應用
至今，FTY已在各種動物同種異體移植模型中進行了試用，效果良好，其中有大鼠皮膚移植、心臟移植[1]、肝移植、小腸移植、肢體移植和犬腎移植。除了同種異體移植模型外，FTY還可延長異種移植物的存活[2]。給藥方式大多是從手術當日起，口服數天至14天，劑量由0.1-10mg/kg/d不等，各種模型的實驗結果顯示FTY有如下特點：
①明顯延長移植物存活，存活時間與藥物劑量正相關，②強烈的免疫抑制效果，當達以相同的延長移植物存活時間時，FTY的劑量僅為CsA的1/20，③FYT既可預防急性排斥發生，也可逆轉已經發生的排斥反應。
另外，我們最近的一項研究顯示，術前3天至術后14天給予FTY（3mg/kg/d）可使大鼠同種異體心臟移植物長期存活。除此之外，FTY還可阻止自身免疫性Ⅰ型糖尿病的發生。
1.2 誘導免疫耐受
總體上，對FTY在免疫耐受誘導中的意義研究還不多。注射同種異體嵌合蛋白折同時給予短時FTY可以誘導同種異體心臟移植物的長期存活，若將長期存活受者的淋巴細胞轉移給另外一個受者，則可誘導該受者對同基因供者的免疫耐受，IL-2不能逆轉耐受狀態[3]。在給予胸腺內注射供者脾細胞的同時給予FTY可延長供者移植物的存活[4]。我們的一項實驗表明，FTY與供者脾細胞合用可誘導供者特異性免疫耐受，若與從地塞來松處理過的供鼠分離的脾細胞聯合應用則更能增強免疫耐受的誘導效果[5，6]。
1.3 與其它免疫抑制的協同作用
與CsA的協同作用 亞治療劑量的CsA（3mg/kg）與FTY聯合應用可明顯延長移植物存活時間（即使FTY的劑量只有0.1mg/kg）。Hoshino 報道，當FTY3mg/kg聯合應用時，7只同種異體心臟移植受鼠中有6只移植物長期存活。FTY的使用不影響CsA的谷值，所以并非靠提高CsA的血藥濃度來提高療效的。我們知道，兩種藥物間的相互作用可由組合系數（Combination Index CI）來衡量。CI值＜1表示兩者協同，CI值=1表示兩者相加，CI值＞1表示兩者拮抗。在大鼠心臟移植模型中，1mg/kgCsA與0.1mg/kgFTY的CI值=0.15，高度協同[7]。上述結果基本上是在嚙齒類動物中的研究結果，而最近對一組靈長類動物的研究也發現FTY可以增強CsA的免疫抑制效果，延長移植的存活時間[8]。
與FK506和雷帕霉素的協同作用除了與CsA的協同作用外，已證明，FTY與雷帕霉素（Rapa）有協同作用，而且FTY/CsA/Rapa三聯療法的協同作用更強[7]。FTY與FK506能否協同作用仍存在爭論，Wang等認為FTY與FK506沒有協同作用，而Hoshino和Xu等則認為兩者之間存在協同作用[7，9，10]。
2 獨特的藥 理作用
2.1 與CsA不同的藥理作用
如同藥理作用不同的抗生素可以產生協同作用一樣，FTY與CsA有協同作用的原因之一也是因其有與CsA完全不同的藥理作用。當在體外用ConA刺激大鼠脾細胞時，1000nM的FTY對IL-2的產生沒有抑制作用，而這一濃度下的CsA已經可以完全IL-2的生成。當分別用同種異體抗原、ConA、IL-2刺激大鼠脾細胞，CsA可抑制前兩種刺激所引起的細胞增生反應，但不能抑制 IL-2的刺激。FTY則不同，它可以抑制包括IL-2在內的所有這三種刺激引起的細胞增生。FTY減少移植物中T細胞的浸潤，以及抑制移植物內CD3 mRNA和細胞毒性分穿孔蛋白、顆粒酶以及以FasLmRNA的表達[1，11，12]。而且毒性分子尤其是FasL的表達抑制與移植物存活有密切關系，提示FTY減少了移植物中的細胞毒性T細胞（CTL）。我們知道，CsA產生免疫抑制的主要藥理作用是抑制編碼IL-2的基因的表達，而FTY并沒有對IL-2的調控作用。對于它是通過什么機制減少了外周淋巴細胞和移植物中的CTL目前仍不清楚。
2.2 誘導淋巴細胞凋亡
大鼠脾細胞與FTY共育后，出現典型的凋亡特征：表面微絨毛消失、染色質濃集、凋亡小體形成、DNA梯形條帶等。人淋巴細胞體外用FTY處理后也出現相似表達，并且細胞內Bcl-2蛋白表達下調，Bax上調[13]。
MRL lpr/lpr小鼠的Fas基因缺失，而MRL野生型小鼠沒有該缺陷。當它們的淋巴細胞與抗-Fas抗體共育時，只有野生型出現細胞凋亡；與FTY共育時，MRL lpr/lpr和野生型均出現與藥物濃度正相關的細胞死亡，兩者之間無差異。用10mg/kg FTY喂飼這兩種小鼠時，它們的外周淋巴明顯下降，兩者無差異[13]。這一結果表明FTY誘導凋亡不依賴Fas-FasL途徑。
Jurkat淋巴瘤細胞bcl-2基因過表達，對FTY存在抗性，而bcl-2表達正常的Jurkat淋巴瘤的新型瘤株（neo-type），就不存在FTY抗性。人單個核細胞經FTY處理1小時后，細胞內Bax蛋白顯著上升，而2小時后Bcl-2蛋白明顯下降，細胞存活率低。這提示FTY可能通過影響bcl-2/bax比值，誘導細胞凋亡。
HL-60是人淋巴母細胞瘤株，其培養液中加入1～8uM FTY，1分鐘后可觀測到細胞內Ca++明顯上調。用過量的EGTA鰲合細胞外Ca++，對這一效應沒有影響，而Thapsigargin可以抑制這一效應。已知Thapsigargin通過抑制Ca++-ATP酶抑制細胞內Ca++儲存池的轉運。當用磷脂酶C的抑制劑U73122處理細胞后，完全抑制了FTY引起的細胞內Ca++濃度升高，同時也抑制了細胞的凋亡[14]。這說明FTY可通過激活磷脂酶C，引起細胞內Ca++的釋放，繼而誘發凋亡。FTY激活磷脂酶C導致細胞內Ca++上升和調節bcl-2/bax 比值是相對獨立的兩個作用還是同一作用的上、下游效應還有待進一步闡明。
有趣的是，最近發現FTY對淋巴細胞的凋亡有雙相調節作用，FTY可以增強超抗原引起的成熟淋巴細胞凋亡，而胸腺中的負選擇（胸腺細胞凋亡）卻受到FTY的抑制，表明FTY的作用可能是加速了成熟T淋巴細胞的凋亡，同時提示未成熟和成熟淋巴細胞的細胞凋亡機制是不同的[15]。
2.3 加速外周循環的成熟淋巴細胞歸巢
盡管最初的研究發現FTY可誘導淋巴細胞的凋亡和體內外周血淋巴細胞的減少。但仍有一些現象難以用凋亡的誘導進行解釋。如FTY誘導細胞凋亡的研究主要是體外實驗，而體內實驗并未發現大量的凋亡細胞。其中一個解釋是凋亡細胞可能在體內很快被體內的吞噬系統吞噬。我們的一項實驗表明，將FTY誘導的凋亡細胞與脾細胞共溫育，發現可抑制脾臟中T細胞的活化，由于另外一個細胞凋亡誘導劑（CHX）具有同樣的效果，提示細胞凋亡后被受者的吞噬系統吞噬后可能介導了FTY的免疫抑制效果[16]。另外一個難以解釋的現象是FTY的有效劑量很低，0.05mg/kg即有免 疫抑制效果，5mg/kg劑量的FTY僅使血濃度達到200ng/ml(0.58umol/L)，而體外實驗中誘導細胞凋亡需要1umol/L以上的濃度。由此，一些作者尋找FTY的其它作用機制。Chiba觀察到[17，18]，口服小劑量FTY（0.1mg/kg）后，大鼠外周血脾臟及胸導管內淋巴細胞明顯減少的同時，外周淋巴結腸系淋巴及派爾結中的淋巴細胞顯著增加，將標記后的淋巴細胞靜脈輸入后，證實FTY可以加速外周淋巴細胞歸巢至PLN、MLN和PP，并與用藥劑量正相關，如用抗CD62L、CD49D和CD11a處理淋巴細胞，而后靜脈輸入，歸巢被完全阻斷，這提示FTY加速外周淋巴細胞歸巢是通過歸巢受體（homing releptors）介導的。
從上述的一些實驗證據得出FTY似乎有兩個方面的作用，其一是誘導淋巴細胞凋亡，其二是誘導淋巴細胞歸巢。要假設同一個藥物同時具有這兩個方面的作用是困難的。目前淍無直接的實驗證據證明兩者之間是否存在關系。
3 藥物代謝動力學
目前在這方面的研究較少。FYT可用氣相色譜進行檢測。由于FTY溶于水和乙醇，因而有很高的生物利用度，在狗、大鼠和靈長類動物中的生物利用度分別大于60%、80%和40%。在血液中，血細胞的分布大于血漿。在狗和大鼠，口服FTY后的血濃度達峰時間約為8～9小時，而母藥的半衰期分別為12和29小時。FTY與CsA聯合應用對兩者的血濃度都沒有影響。母藥的谷值濃度與口服劑量之間有線性關系。目前尚未發現有免疫抑制作用的代謝產物。在大便和尿中都發現了FTY的代謝產物，其中尿中的代謝產物比大便中的略低，這些提示FTY主要在肝臟代謝。
4 毒副作用低
4.1 高度的細胞選擇性
大鼠一次性口服10mg/kg FTY，3小時以后外周血淋巴細胞降至服藥前的18.3%，3天后降至谷底6.1%。此時外周血各種淋巴細胞的降低幅度存在顯著差異。與服藥前相比，T細胞降至2.3%，B細胞降至19.7%，CD4+細胞降至8.4%，CD8+細胞降至20%，單核細胞不變。而多核細胞數上升了3倍，CD4+、CD8+雙陽性細胞上升（這是不是因為體內大量淋巴細胞凋亡后，巨噬細胞增生，以吞噬并清除這些凋亡細胞呢？）。脾臟T細胞明顯減少，胸腺、腸系膜淋巴結的細胞數及各種細胞的比例無變化。將不同組織中的淋巴細胞在含有10uMFTY的培養液中培養3小時后，細胞存活率分別為：胸腺53.2%，脾臟37.2%，外周血42.7%[19]。Chiba[2]等給大鼠連續口服FTY0.1mg/kg/d，14天后，外周血中CD3+細胞明顯減少，CD45RA+B細胞不受影響。骨髓細胞和胸腺細胞也不受影響。這些結果提示，FTY選擇性作用于外周淋巴細胞，特別是CD4+T細胞。
4.2 對動物的影響
大鼠大劑量FTY（10mg/kg）服用15天，沒有出現腹瀉、嘔吐、消瘦、感染而引起死亡[20]。也沒有中毒性腎損傷，但體重增長受到抑制[2]。犬腎移植受者連續服藥3個月，沒有明顯的副作用[20]。我們最近的一項研究表明，FTY的劑量在0.3～10mg/kg的范圍內無論是單獨應用或是與CsA聯合應用，連續服藥兩周后，明顯降低外周血淋巴細胞和脾臟淋巴細胞，對粒細胞、血紅蛋白以及胸腺和骨髓均無明顯影響。服藥后2周外周血淋巴細胞的數量一直維持在較低的水平，而且在停藥后維持4周左右恢復到服藥前的水平，表明FTY對淋巴細胞的影響是可逆的，而CsA不能增強FTY減少淋巴細胞的作用。
4.3 減少CsA用量 FTY與CsA聯合應用時，CsA的劑量只需達到亞臨床劑量（3mg/kg）就可達到滿意的治療效果[2]，從而避免了CsA過量所可能引起的肝、腎毒性。
轉貼于
5 結語
對FTY的研究雖然時間不長，但相關的研究已顯示該免疫抑制劑有較好的前景。但也有許多問題有待澄清。如特異性地誘導T細胞凋亡的機制有待進一步闡明，FTY為何僅對T細胞有作用，而對其它細胞似乎沒有影響呢？是T細胞內有特殊的“受體”或酶系嗎？誘導細 胞凋亡和細胞歸巢之間有何關系呢？兩者對免疫系統的影響如何？單用或聯合應用CsA可使移植物長期存活，那么這種效果是免疫抑制還是免疫耐受呢？對這些問題的深入探討也許會給免疫學的研究和臨床帶來新思路或方法。
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免疫抑制劑范文第2篇
【關鍵詞】 姜黃素; NF-?資B; 胰島素; 抵抗 )
Abstract: 【Objective】 To investigate inhibitory effect of curcumin and its mechanism on insulin resistance. 【Methods】 Curcumin co-operated high fat diets were tested for the effect of curcumin on obesity induced insulin resistance in rodent model. Transcription factor I and circulating cytokines were also detected after curcumin treatment. 【Results】 (1) Curcumin inhibited TNF?琢-stimulated NF-?資B activation in Fao cells. (2)The fasting plasma glucose level was not obviously decreased after the treatment of curcumin, but the level of fasting insulin decreased by about 30%. Furthermore, the level of glucose tolerance curve dropped significantly. (3) The level of TNF?琢[(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL] in circulation was not obviously changed, but the level of IL-1?茁 [(33.9±3.2) pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] and IL-6 [(72.1±9.8) pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL] was suppressed dramatically. (4) IRS-1 tyrosine phosphorylation levels stimulated by insulin obviously increased, but the phosphorylation level of insulin receptor did not change. Being parallel with tyrosine phosphorylation levels of IRS-1, the phosphorylation levels of P85 and AKT increased accordingly. Significantly improved insulin sensitivity was observed in groups with curcumin. 【Conclusion】 Curcumin inhibits NF-?資B dependent inflammatory pathway and reverses obesity-induced insulin resistance.
Key words: curcumin, NF-?資B, insulin, resistance
姜黃(Curcuma longa L.)是常用中藥,臨床上用于活血、行氣、通經、止痛。姜黃素(curcumin)是一種黃素,從姜黃中提取得到的主要有效成分。近年來,大量研究發現它具有免疫調節、抗氧化、抗炎及抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等生理和藥理作用[1-4]。在實驗室資料中姜黃素是良好的免疫調節劑,并有結果提示姜黃素可以抑制宿主抗移植物反應,而且提高受體動物的存活率[5,6]。在實驗研究中,炎癥又與胰島素抵抗密切相關[7,8]。炎癥被證實是代謝綜合征的共同土壤,聯想到許多抗炎藥物如阿司匹林可以逆轉胰島素抵抗,本文嘗試利用姜黃素治療肥胖合并極度胰島素抵抗的炎癥模型,并對姜黃素逆轉胰島素抵抗的機制作初步探討。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 姜黃素 購于印度亞洲公司(純度99%)。
1.1.2 動物 Obob雄性小鼠16只,8周齡、空腹體質量(33~38 g),購自南京國家模式動物中心,用含脂肪6.4%的標準飼料飼養,實驗前1周紀錄小鼠的飼料攝取、空腹血糖、空腹胰島素水平及體量等。
1.1.3 FAO細胞 購自 The American Type Culture Collection(ATCC)。
1.1.4 試劑 IR、IRS-1、AKT、P85 多克隆抗體由Steven Shoelson實驗室(Joslin Diabetes Center, Harvard)提供。FBS TNF?琢、胰島素購自Sigma, St. Louis USA, I-?資B?琢 抗體,IKK?酌抗體,購于 Santa Cruz, CA, GST-I-?資B(1-54) 底物由Boston Biologicals, Wellesley, MA合成。
1.2 方 法
1.2.1 體外細胞實驗 FAO細胞使用培養液 DMEM(購自 Gibco公司),細胞置于37 ℃,5%CO2的培養箱中培養。在10 cm 培養皿用10 mL DMEM+10%FBS含有高濃度葡萄糖(25 mmol/L)的培養液中培養至80%重疊率,經5 mL 0.1%BSA孵育16 h后接受不同濃度(0~40 umol/L)的姜黃素預處理,然后接受鼠TNF?琢 10 nmol/L刺激處理,于20 min后用預冷的PBS終止,并收集細胞,用于制作蛋白勻漿,備用, I-?資B?琢的水平用免疫印跡的灰度表示。NF-?資B的活性用20 min內試驗細胞和對照細胞I-?資B?琢灰度差值表示。
1.2.2 動物實驗 利用食物參入法制成含2%姜黃素的顆粒飼料(Lab Diets, 5008),低溫保存。動物飼養環境為中央通氣,層流環境,恒溫(23 ℃)、恒濕,12 h明暗光照循環,24 h隨意飲食環境. 動物購入后第5天開始接受口服葡萄糖耐量試驗,并留取空腹血漿作血漿胰島素水平,和其它循環因子的檢查。在驗證空腹血糖和胰島素水平后動物被隨機分成兩組,并接受姜黃素治療,對照組用顆粒飼料5008作為對照。每天記錄動物的攝食量,每3周測量空腹血糖并留取空腹血漿1次, 第6周空腹狀態下進行第2次口服葡萄糖耐量試驗,并留取空腹血漿。試驗后繼續接受姜黃素治療,第7周于空腹狀態下接受5 U/kg胰島素富強注射,注射后5 min整,用斷頸法迅速處死動物, 留取肝臟經液氮過渡后在-80 ℃低溫冰箱保存,作胰島素信號分析之用。血漿多種循環炎癥細胞因子的檢查用Linco Research 的Luminex 試劑盒并采用Luminex 200 監測結果。
1.2.3 免疫印跡 細胞或組織裂解液(30 mmol/L Hepes, 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 7.4。蛋白酶抑制劑由1 mmol/L PMSF, 3 ?滋mol/L aprotinin, 5 ?滋mol/L pepstatin, 10 ?滋mol/L leupeptin, 25 mmol/L Benzamidin, 2 mmol/L Na-vanadate, 5 mmol/L ?茁-glycerolphosphate, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L Ammonium Molybdate, 30 mmol/L tetrasodium pyrophosphate, 5 mmol/L EGTA)裂解細胞, SDS-聚丙烯酰胺凝膠(6%),蛋白加熱變性后每孔加30 ?滋g, 電轉移儀將蛋白轉到PVDF膜。5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液洗膜,加一抗, 4 ℃孵育過夜,TBS-T緩沖液洗膜,加過氧化物酶標記的IgG 抗體(購自Amersham USA),室溫1 h,TBS-T緩沖液洗膜,加ECL 1 min,暗室顯影2~3 min后沖洗膠片。凝膠成像分析系統攝像。
1.2.4 統計學分析 采用t檢驗。
2 結 果
2. 1 姜黃素抑制NF-?資B的量效和時效關系
Fao細胞在10 cm2 培養皿用10 mL在10% FBS+DMEM含有高濃度葡萄糖的培養液中培養至80%重疊,經5 mL 0.1% BSA孵育16 h后接受姜黃素預處理:劑量關系用梯度濃度如圖1所示,時效曲線用30 μmol/L。預處理后接受鼠TNF 10 nmol/L刺激處理,于20 min后用預冷的FBS終止,并收集細胞,用于制作蛋白勻漿。用免疫印跡檢測勻漿內I-?資?注?琢的水平。如圖1A所示:20 μmol/L姜黃素20 min預處理能夠抑制TNF刺激的I?資?注?琢的降解。從姜黃素的時效關系圖1B可見,姜黃素有效劑量30 μmol/L對NF-κB的抑制作用在30~60 min時最強。
2. 2 姜黃素以逆轉肥胖小鼠的胰島素抵抗
經過6周姜黃素的治療,小鼠的空腹血糖水平沒有明顯下降,但空腹胰島素的水平下降約30%(圖2),口服葡萄糖耐量曲線的水平也明顯下降(圖2A),曲線下面積的比較有明顯差異(P< 0.01)。由空腹血糖和胰島素水平計算的HOMA指數[用FBS(mmol/L) ×胰島素(mmol/L)/22.5 計算]也呈明顯降低(P< 0.05,圖2C),提示小鼠對胰島素抵抗的水平得到明顯改善。
2. 3 姜黃素對循環細胞因子的影響
Obob 小鼠治療6周后的空腹血漿用Linco Research Luminex 試劑盒同時檢測細胞因子IL-1?茁,IL-6 和 TNF?琢的水平。如圖3所示:盡管循環胰島素的水平明顯下降,但TNF?琢 [(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL]水平沒有明顯改變,與之對應,循環中IL-1?茁[(33.9±3.2)pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] 和IL-6 [(72.1±9.8)pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL]水平明顯被抑制(P< 0.05)。
2. 4 姜黃素為胰島素信號的增效劑
經胰島素刺激的肝臟組織在液氮下作粉碎并以1% Triton X100 RAPA(含有全部蛋白酶抑制劑,和蛋白磷酸酶抑制劑)緩沖液在冰點勻漿。經全速4 ℃離心30 min取上清液(1 mg 蛋白質)作IRS-1和 IR聯合免疫沉淀。經上樣緩沖液釋放的沉淀目標蛋白質經6%的SDS-PAGE 分離,轉移到PVDF膜上。用4G10、P85、 AKT抗體作免疫印跡。如圖4所示:胰島素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明顯升高, 而胰島素受體的磷酸化水平沒有明顯改變。與IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行,P85的磷酸化水平也明顯升高,AKT的磷酸化的水平也明顯升高。
3 討 論
胰島素抵抗(IR)及胰島?茁細胞功能減退是2型糖尿病發病機理的重要環節[9],目前被認為是一個慢性非特異性炎癥過程,胰島素對胰島素敏感組織作用的缺陷(肝臟、脂肪組織、骨骼肌)會導致慢性、低水平炎癥狀態的惡化,任何與慢性炎癥有關的過程都會削弱胰島素的作用,作為惡性循環,胰島素抵抗又會使炎癥惡化[10]。在抗炎藥物對胰島素抵抗有逆轉作用的報道之后, 我們探索新的抗炎藥物對胰島素抵抗的治療作用, 姜黃素是繼阿司匹林后又一個具有類似協同作用的活性成分[11]。在姜黃素治療6周后,盡管治療組和對照組的體重沒有明顯改善,但小鼠空腹血糖的水平明顯下降,而且胰島素的水平也明顯降低,提示胰島素的敏感性明顯升高,葡萄糖耐量曲線在治療后也明顯改善,說明小鼠整體對葡萄糖的處理能力明顯升高,即obob 小鼠的胰島素抵抗的水平得到明顯改善。這些都進一步說明姜黃素治療改善肥胖誘導的胰島素抵抗。
研究證實NF-?資B是啟動和控制炎癥的主要核轉錄因子,在非激活條件下,NF-?資B和胞漿內一種被稱為NF-?資B的抑制物(I-?資B)的蛋白質結合處于無功能狀態。我們利用胰島素敏感組織來源的細胞系FAO,驗證了姜黃素能夠抑制TNF?琢刺激的I?資B?琢的降解,繼而抑制NF-?資B的活性, 我們推測在高度肥胖NF-?資B高度激活的肥胖小鼠obob 體內,姜黃素可能具有更加明顯的改善代謝的作用。
在NF-?資B激活的模型上我們證實炎癥激發的高水平循環細胞因子是系統性胰島素抵抗的原因。采用細胞因子的中和抗體可以逆轉胰島素抵抗,在NF-?資B抑制型模型,胰島素敏感性升高,而且循環中細胞因子的水平較低。在肥胖發生過程中,NF-?資B 活性與動物的體重呈正相關。Obob 小鼠的肝臟,脂肪以及淋巴組織中NF-?資B的活性水平升高,循環細胞因子的水平增高,這些都說明炎癥介質與胰島素抵抗的關系。經姜黃素治療的肥胖動物循環中細胞因子IL-1, IL-6水平均明顯下降,由于IL-1和IL-6是NF-?資B活性調控的重要因子,因此,我們認為姜黃素在胞漿內有多個作用靶點,通過對上述細胞因子的抑制作用,影響NF-?資B 的活性,繼而達到逆轉胰島素抵抗和改善胰島素敏感性的作用。在肝臟組織的胰島素信號檢測中,胰島素刺激的IRS-1 酪氨酸磷酸化的水平明顯升高,AKT的活性也明顯增強。這些結果都進一步說明肥胖小鼠胰島素的敏感性在治療后得到了改善,姜黃素能提高obob小鼠胰島素的敏感性,姜黃素作為一個免疫調節劑用于抑制免疫排斥的同時,對系統性炎癥也有抑制作用,可能是通過抑制NF-?資B來改善胰島素敏感性的。
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免疫抑制劑范文第3篇
【關鍵詞】甲狀腺相關性眼病；免疫抑制劑；藥物局部注射
【中圖分類號】R581.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2013）01-0019-02
甲狀腺相關性眼病是在成人中常見的眼眶疾病之一，屬于一種自身的免疫性疾病，對于此種疾病的發病機制仍然沒有明確規定，對于出現此種疾病的患者，容易伴發甲狀腺機能紊亂疾病，從而在一定程度上加重患者的病情。此種疾病的主要臨床表現為流淚、畏光、眼腫、視力下降等，從而對患者的正常生活和工作造成了嚴重的影響，制約了患者生活質量的提高[1]。因此，對于此種疾病，臨床醫生要及時給予患者對癥治療，以促進患者病情的改善，降低患者發生病殘的機率，實現其生活質量的提高。當前，隨著醫學技術的不斷發展，臨床上治療此種疾病的方法越來越多，其中，采用免疫抑制劑靜脈沖擊聯合藥物局部注射治療的效果尤為顯著[2]。現在選取我院收治的甲狀腺相關性眼病患者，對其采用此種方法治療的情況進行回顧性分析，并將回顧結果報告如下。
1 資料和方法
1.1 一般資料 選取在2007年5月-2012年8月間到我院診治的76例甲狀腺相關性眼病患者，其中，男性40例，年齡在23-59歲之間，平均年齡為38.1歲，女性36例，年齡在26-67歲之間，平均年齡為39.7歲，所有患者均經臨床診斷為甲狀腺相關性眼病，需要進行及時的對癥治療。將76例患者隨機分為兩組，觀察組38例，對照組38例，觀察組患者采用免疫抑制劑靜脈沖擊聯合藥物局部注射治療，對照組患者采用單純的免疫抑制劑靜脈沖擊治療，跟蹤觀察兩組患者的治療過程，并將所得實驗數據記錄。
1.2 方法
1.2.1 診斷標準 患者表現出典型的甲亢癥狀，而且具有甲亢病史，甲狀腺均出現不同程度的重大，并伴有眼部疼痛、畏光、流淚、水腫、充血等癥狀。對所有患者的臨床癥狀和體征進行詳細詢問并記錄，同時采用專業診斷儀對患者進行診斷，以確診患者的病情[3]。
1.2.2 治療方法 首先給予所有患者常規治療，對于患者出現的并發癥進行對癥及支持治療，以有效改善患者的各項身體指標，并促進患者的生命體征維持在穩定狀態。在給予患者常規治療后，觀察組患者采用免疫抑制劑靜脈沖擊聯合藥物局部注射治療，給予患者口服甲亢藥物治療，同時對患者采用0.5g的甲波尼龍聯合250ml的生理鹽水、0.2g的環磷酰胺聯合500ml的生理鹽水進行靜脈滴注治療，每天1次，對患者持續治療3天，然后間隔5-7天，再重復治療，對患者持續治療3-5個療程，然后再給予患者間隔性的局部注射50mg的環磷酰胺、5mg的地塞米松、50mg的環孢素A治療，每天1次，沖擊結束后再對患者采用二丙酸倍他米松肌內注射治療，共7mg，半個月進行1次，治療一個月后改為每月1次，持續治療2個月[4]。對照組患者僅采用免疫抑制劑靜脈沖擊療法進行治療，標準同觀察組。對所有患者進行隨訪，持續6個月-2年，對患者的血常規、尿常規、腎功能、肝功能、電解質等指標進行跟蹤觀察，以評估患者病情的改善情況。
1.3 療效標準 顯效：患者的臨床癥狀和體征明顯消失，眼痛、水腫緩解，視力有較大程度的恢復，對于正常生活和工作影響較小。有效：患者的臨床癥狀和體征有所消失，眼痛、水腫有所緩解，視力有一定程度的恢復，對于正常生活和工作有一定的影響。無效：患者的臨床癥狀和體征沒有消失，病情呈現出不斷加重的趨勢，對患者的正常生活和工作造成了嚴重影響[5]。
1.4 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件對所得實驗數據進行t檢驗，對于兩組患者的年齡、性別進行統計學檢驗，差異較小，無統計學意義（P>0.05）。對于兩組患者的治療效果進行檢驗，差異顯著，有統計學意義（P
2 結果
通過對所有患者實行一系列的治療，其病情均得到了較大程度的改善，觀察組38例患者中，顯效22例，有效12例，無效4例，治療有效率為89.5％，對照組38例患者中，顯效16例，有效11例，無效11例，治療有效率為71.1％。對觀察組和對照組患者的臨床治療結果進行分析對比可知，觀察組患者的治療效果要顯著優于對照組患者的治療效果，對于患者病情的改善和生活質量的提高有著較大的幫助作用。見表1
3 討論
甲狀腺相關性眼病是在臨床上較為常見和多發的一種眼科疾病，導致患者出現眼痛、視力下降、充血、水腫等臨床癥狀和體征，致使患者需要承受較大的痛苦，嚴重的還會危及到患者的生命安全，從而制約到其生活質量的提高。對此，臨床醫生應當及時給予患者準確診斷，并對患者實行對癥治療，以促進患者病情的改善，降低患者的死亡率，實現其生活質量的提高[6]。
在本文的研究過程中，首先給予患者基礎治療，以有效改善患者的各項身體指標，并促進患者的生命體征維持在穩定狀態。在此基礎上，觀察組患者采用免疫抑制劑靜脈沖擊聯合藥物局部注射治療，效果顯著，其中的甲波尼龍和地塞米松能夠對機體細胞功能起到良好的抑制作用，同時可以對淋巴細胞在免疫活動中的影響起到破壞作用，從而緩解炎性介質對患者的影響，以逐步的改善患者的臨床癥狀和體征，促進患者視力的快速恢復。此種治療方法不僅對于患者的治療效果顯著，而且對于患者的副作用較小，從而能夠有效提高患者的生活質量，減輕患者及其家庭的經濟負擔和精神壓力。對照組患者采用單純的免疫抑制劑靜脈沖擊治療，雖然對于患者病情的改善也有一定的幫助，但效果較差，難以實現患者的快速康復。因此，免疫抑制劑聯合藥物治療的方法值得在臨床上推廣應用。
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免疫抑制劑范文第4篇
【關鍵詞】 姜黃素； NF-?資B； 胰島素； 抵抗 )
Abstract： 【Objective】 To investigate inhibitory effect of curcumin and its mechanism on insulin resistance. 【Methods】 Curcumin co-operated high fat diets were tested for the effect of curcumin on obesity induced insulin resistance in rodent model. Transcription factor I and circulating cytokines were also detected after curcumin treatment. 【Results】 （1） Curcumin inhibited TNF?琢-stimulated NF-?資B activation in Fao cells. （2）The fasting plasma glucose level was not obviously decreased after the treatment of curcumin， but the level of fasting insulin decreased by about 30%. Furthermore， the level of glucose tolerance curve dropped significantly. （3） The level of TNF?琢［(34.5±3.4)pg/mL vs (31.3±1.1) pg/mL] in circulation was not obviously changed， but the level of IL-1?茁 [(33.9±3.2) pg/mL vs (15.6±1.1) pg/mL] and IL-6 [(72.1±9.8) pg/mL vs (47.2±5.3) pg/mL] was suppressed dramatically. （4） IRS-1 tyrosine phosphorylation levels stimulated by insulin obviously increased， but the phosphorylation level of insulin receptor did not change. Being parallel with tyrosine phosphorylation levels of IRS-1， the phosphorylation levels of P85 and AKT increased accordingly. Significantly improved insulin sensitivity was observed in groups with curcumin. 【Conclusion】 Curcumin inhibits NF-?資B dependent inflammatory pathway and reverses obesity-induced insulin resistance.
Key words: curcumin， NF-?資B， insulin， resistance
姜黃（Curcuma longa L．）是常用中藥，臨床上用于活血、行氣、通經、止痛。姜黃素（curcumin）是一種黃素，從姜黃中提取得到的主要有效成分。近年來，大量研究發現它具有免疫調節、抗氧化、抗炎及抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等生理和藥理作用［1-4］。在實驗室資料中姜黃素是良好的免疫調節劑，并有結果提示姜黃素可以抑制宿主抗移植物反應，而且提高受體動物的存活率[5，6]。在實驗研究中，炎癥又與胰島素抵抗密切相關［7，8］。炎癥被證實是代謝綜合征的共同土壤，聯想到許多抗炎藥物如阿司匹林可以逆轉胰島素抵抗，本文嘗試利用姜黃素治療肥胖合并極度胰島素抵抗的炎癥模型，并對姜黃素逆轉胰島素抵抗的機制作初步探討。
1 材料與方法
1.1 材 料
1.1.1 姜黃素 購于印度亞洲公司（純度99%）。
1.1.2 動物 Obob雄性小鼠16只，8周齡、空腹體質量（33～38 g)，購自南京國家模式動物中心，用含脂肪6.4%的標準飼料飼養，實驗前1周紀錄小鼠的飼料攝取、空腹血糖、空腹胰島素水平及體量等。
1.1.3 FAO細胞 購自 The American Type Culture Collection（ATCC）。
1.1.4 試劑 IR、IRS-1、AKT、P85 多克隆抗體由Steven Shoelson實驗室（Joslin Diabetes Center， Harvard)提供。FBS TNF?琢、胰島素購自Sigma， St. Louis USA， I-?資B?琢 抗體，IKK?酌抗體，購于 Santa Cruz， CA， GST-I-?資B(1-54) 底物由Boston Biologicals， Wellesley， MA合成。
1.2 方 法
1.2.1 體外細胞實驗 FAO細胞使用培養液 DMEM（購自 Gibco公司），細胞置于37 ℃，5%CO2的培養箱中培養。在10 cm 培養皿用10 mL DMEM+10%FBS含有高濃度葡萄糖（25 mmol/L）的培養液中培養至80％重疊率，經5 mL 0.1％BSA孵育16 h后接受不同濃度（0～40 umol/L）的姜黃素預處理，然后接受鼠TNF?琢 10 nmol/L刺激處理，于20 min后用預冷的PBS終止，并收集細胞，用于制作蛋白勻漿，備用， I-?資B?琢的水平用免疫印跡的灰度表示。NF-?資B的活性用20 min內試驗細胞和對照細胞I-?資B?琢灰度差值表示。
1.2.2 動物實驗 利用食物參入法制成含2％姜黃素的顆粒飼料(Lab Diets， 5008)，低溫保存。動物飼養環境為中央通氣，層流環境，恒溫(23 ℃)、恒濕，12 h明暗光照循環，24 h隨意飲食環境. 動物購入后第5天開始接受口服葡萄糖耐量試驗，并留取空腹血漿作血漿胰島素水平，和其它循環因子的檢查。在驗證空腹血糖和胰島素水平后動物被隨機分成兩組，并接受姜黃素治療，對照組用顆粒飼料5008作為對照。每天記錄動物的攝食量，每3周測量空腹血糖并留取空腹血漿1次， 第6周空腹狀態下進行第2次口服葡萄糖耐量試驗，并留取空腹血漿。試驗后繼續接受姜黃素治療，第7周于空腹狀態下接受5 U/kg胰島素富強注射，注射后5 min整，用斷頸法迅速處死動物， 留取肝臟經液氮過渡后在-80 ℃低溫冰箱保存，作胰島素信號分析之用。血漿多種循環炎癥細胞因子的檢查用Linco Research 的Luminex 試劑盒并采用Luminex 200 監測結果。
1.2.3 免疫印跡 細胞或組織裂解液（30 mmol/L Hepes， 150 mmol/L NaCl， 1% Triton X-100， pH 7.4。蛋白酶抑制劑由1 mmol/L PMSF， 3 ?滋mol/L aprotinin， 5 ?滋mol/L pepstatin， 10 ?滋mol/L leupeptin， 25 mmol/L Benzamidin， 2 mmol/L Na-vanadate， 5 mmol/L ?茁-glycerolphosphate， 10 mmol/L NaF， 1 mmol/L Ammonium Molybdate， 30 mmol/L tetrasodium pyrophosphate， 5 mmol/L EGTA）裂解細胞， SDS-聚丙烯酰胺凝膠（6%），蛋白加熱變性后每孔加30 ?滋g， 電轉移儀將蛋白轉到PVDF膜。5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液洗膜，加一抗， 4 ℃孵育過夜，TBS-T緩沖液洗膜，加過氧化物酶標記的IgG 抗體(購自Amersham USA)，室溫1 h，TBS-T緩沖液洗膜，加ECL 1 min，暗室顯影2～3 min后沖洗膠片。凝膠成像分析系統攝像。
1.2.4 統計學分析 采用t檢驗。
2 結 果
2. 1 姜黃素抑制NF-?資B的量效和時效關系
Fao細胞在10 cm2 培養皿用10 mL在10% FBS+DMEM含有高濃度葡萄糖的培養液中培養至80%重疊，經5 mL 0.1% BSA孵育16 h后接受姜黃素預處理：劑量關系用梯度濃度如圖1所示，時效曲線用30 μmol/L。預處理后接受鼠TNF 10 nmol/L刺激處理，于20 min后用預冷的FBS終止，并收集細胞，用于制作蛋白勻漿。用免疫印跡檢測勻漿內I-?資?注?琢的水平。如圖1A所示：20 μmol/L姜黃素20 min預處理能夠抑制TNF刺激的I?資?注?琢的降解。從姜黃素的時效關系圖1B可見，姜黃素有效劑量30 μmol/L對NF-κB的抑制作用在30～60 min時最強。
2. 2 姜黃素以逆轉肥胖小鼠的胰島素抵抗
經過6周姜黃素的治療，小鼠的空腹血糖水平沒有明顯下降，但空腹胰島素的水平下降約30％（圖2），口服葡萄糖耐量曲線的水平也明顯下降（圖2A），曲線下面積的比較有明顯差異（P< 0.01）。由空腹血糖和胰島素水平計算的HOMA指數［用FBS(mmol/L) ×胰島素（mmol/L)/22.5 計算］也呈明顯降低（P＜ 0.05，圖2C），提示小鼠對胰島素抵抗的水平得到明顯改善。
2. 3 姜黃素對循環細胞因子的影響
Obob 小鼠治療6周后的空腹血漿用Linco Research Luminex 試劑盒同時檢測細胞因子IL-1?茁，IL-6 和 TNF?琢的水平。如圖3所示：盡管循環胰島素的水平明顯下降，但TNF?琢 ［(34.5±3.4）pg/mL vs （31.3±1.1） pg/mL］水平沒有明顯改變，與之對應，循環中IL-1?茁［（33.9±3.2）pg/mL vs （15.6±1.1） pg/mL］ 和IL-6 ［(72.1±9.8)pg/mL vs （47.2±5.3） pg/mL］水平明顯被抑制（P< 0.05）。
2. 4 姜黃素為胰島素信號的增效劑
經胰島素刺激的肝臟組織在液氮下作粉碎并以1％ Triton X100 RAPA（含有全部蛋白酶抑制劑，和蛋白磷酸酶抑制劑）緩沖液在冰點勻漿。經全速4 ℃離心30 min取上清液（1 mg 蛋白質）作IRS-1和 IR聯合免疫沉淀。經上樣緩沖液釋放的沉淀目標蛋白質經6％的SDS-PAGE 分離，轉移到PVDF膜上。用4G10、P85、 AKT抗體作免疫印跡。如圖4所示：胰島素刺激的IRS-1酪氨酸的磷酸化水平明顯升高， 而胰島素受體的磷酸化水平沒有明顯改變。與IRS-1酪氨酸的磷酸化水平平行，P85的磷酸化水平也明顯升高，AKT的磷酸化的水平也明顯升高。
3 討 論
胰島素抵抗（IR）及胰島?茁細胞功能減退是2型糖尿病發病機理的重要環節［9］，目前被認為是一個慢性非特異性炎癥過程，胰島素對胰島素敏感組織作用的缺陷（肝臟、脂肪組織、骨骼肌）會導致慢性、低水平炎癥狀態的惡化，任何與慢性炎癥有關的過程都會削弱胰島素的作用，作為惡性循環，胰島素抵抗又會使炎癥惡化[10]。在抗炎藥物對胰島素抵抗有逆轉作用的報道之后， 我們探索新的抗炎藥物對胰島素抵抗的治療作用， 姜黃素是繼阿司匹林后又一個具有類似協同作用的活性成分[11]。在姜黃素治療6周后，盡管治療組和對照組的體重沒有明顯改善，但小鼠空腹血糖的水平明顯下降，而且胰島素的水平也明顯降低，提示胰島素的敏感性明顯升高，葡萄糖耐量曲線在治療后也明顯改善，說明小鼠整體對葡萄糖的處理能力明顯升高，即obob 小鼠的胰島素抵抗的水平得到明顯改善。這些都進一步說明姜黃素治療改善肥胖誘導的胰島素抵抗。
研究證實NF-?資B是啟動和控制炎癥的主要核轉錄因子，在非激活條件下，NF-?資B和胞漿內一種被稱為NF-?資B的抑制物（I-?資B）的蛋白質結合處于無功能狀態。我們利用胰島素敏感組織來源的細胞系FAO，驗證了姜黃素能夠抑制TNF?琢刺激的I?資B?琢的降解，繼而抑制NF-?資B的活性， 我們推測在高度肥胖NF-?資B高度激活的肥胖小鼠obob 體內，姜黃素可能具有更加明顯的改善代謝的作用。
在NF-?資B激活的模型上我們證實炎癥激發的高水平循環細胞因子是系統性胰島素抵抗的原因。采用細胞因子的中和抗體可以逆轉胰島素抵抗，在NF-?資B抑制型模型，胰島素敏感性升高，而且循環中細胞因子的水平較低。在肥胖發生過程中，NF-?資B 活性與動物的體重呈正相關。Obob 小鼠的肝臟，脂肪以及淋巴組織中NF-?資B的活性水平升高，循環細胞因子的水平增高，這些都說明炎癥介質與胰島素抵抗的關系。經姜黃素治療的肥胖動物循環中細胞因子IL-1， IL-6水平均明顯下降，由于IL-1和IL-6是NF-?資B活性調控的重要因子，因此，我們認為姜黃素在胞漿內有多個作用靶點，通過對上述細胞因子的抑制作用，影響NF-?資B 的活性，繼而達到逆轉胰島素抵抗和改善胰島素敏感性的作用。在肝臟組織的胰島素信號檢測中，胰島素刺激的IRS-1 酪氨酸磷酸化的水平明顯升高，AKT的活性也明顯增強。這些結果都進一步說明肥胖小鼠胰島素的敏感性在治療后得到了改善，姜黃素能提高obob小鼠胰島素的敏感性，姜黃素作為一個免疫調節劑用于抑制免疫排斥的同時，對系統性炎癥也有抑制作用，可能是通過抑制NF-?資B來改善胰島素敏感性的。
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免疫抑制劑范文第5篇
[關鍵詞] 皮膚移植；免疫抑制；雷公藤內酯醇；作用機制
[中圖分類號] R657.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（b）-0012-04
Immunosuppressive effect and mechanism of Triptolide on skin allografts in mice
LIANG Kuo1 LIU Shuang1 CUI Yeqing1 SUN Haichen1 LUO Bin1 WAN Suigui2 SUN Xuejing2 LI Fei1
1.Department of General Surgery， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing 100053， China； 2.Department of Hematology， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing 100053， China
[Abstract] Objective To investigate the immunosuppressive effect and the possible mechanism of Triptolide on skin allografts in murine model. Methods BALB/c mice to C57BL/6 mice skin allografting models were created. The recipients were divided into three groups. The mice in the treatment groups were injected intraperitoneally with Triptolide at 100 μg/kg （low-dose Triptolide group， L-Tri group） or 200 μg/kg （high-dose Triptolide group， H-Tri group） daily in the first 6 days （0-5 days）； while the mice in control group were given vehicles （1% Tween 80）. The median survival time of skin allografts in each group was monitored. The proportion of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in spleen tissue were tested by flow cytometry. Results The median survival time of skin allografts in the control group， L-Tri group and H-Tri group were （8.3±1.2）， （12.4±1.9） d and （14.9±2.2） d respectively. The percentage of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells in spleen tissues of three groups were （5.6±0.8） %， （12.6±1.5）% and （16.1±2.1）% respectively. Compared with control group， the L-Tri group and H-Tri group show significantly prolonged skin allograft survival time （P < 0.05）， increased percentage of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells （P < 0.05）. Conclusion Tri can inhibit immune rejection， prolong the skin allograft survival time in mice. The anti-rejection effect of Tri may be attributed to the upregulation of regulatory T cells. In addition， the immunosuppressive effect of triptolide shows dose-dependent.
[Key words] Skin transplantation； Immunosuppression； Triptolide； Mechanism
同種器官移植已成為治療人類腎臟、心臟及肝臟等嚴重疾病的一種重要手段。但是，由于目前臨床應用的免疫抑制劑長期使用時具有一定的毒副作用，因此研制開發新型、高效、低毒的免疫抑制劑，一直是臨床關注的熱點[1-2]。雷公藤內酯醇（Triptolide，Tri）是從我國傳統中藥雷公藤中分離出來的含有三個環氧基的二萜內酯化合物，具有較強的抗炎、抗腫瘤和免疫抑制作用[3-4]。動物實驗證實其在心臟[5-6]、腎臟[7]、肝臟[8]、肺臟[9]、胰島[10-11]等多種移植模型中均具有較好的抗排斥作用，是一種極有潛力的免疫抑制藥物。但目前國內外學者對于Tri在移植中的抗排斥作用機制仍然存在較多爭論[12]。本研究旨在通過觀察Tri在小鼠同種異體皮膚移植中的抗排斥效果，初步探討其可能的免疫作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
近交系雄性BALB/c小鼠（H-2d）8只為供體，雄性C57BL/6（H-2b）24只為受體，均為8～12周齡，體重22～25 g，購自北京維通利華公司。飼養于恒溫（25～27℃）、恒定濕度（45%～55%）、無特定病原體（SPF級）環境中。
1.2 主要試劑
Tri購自中國藥品生物制品檢定所，吐溫80購自北京思語偉業生物公司，鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、膠原酶Ⅴ購自Sigma公司，Ficoll 400購自瑞典Pharmacia公司，胎牛血清購自Gibco公司，免疫組化試劑購自邁新公司。藻紅蛋白（PE）標記的抗小鼠Foxp3單克隆抗體（mAb）、異硫氰酸熒光素（ FITC）標記的抗小鼠CD4單克隆抗體（mAb）、別藻青蛋白（APC）標記的抗小鼠CD25單克隆抗體（mAb）等免疫熒光染料均購自eBioscience公司。
1.3 皮膚移植與分組
供體（BALB/c）脫椎法處死后，取尾部皮膚，剪成0.8 cm×0.8 cm大小的皮片置于無菌PBS中備用。C57BL/6受鼠給予4%水合氯醛腹腔注射（10 μL/g）麻醉。制備受鼠背部移植床，將供體皮片置于移植床，6-0絲線縫合固定，皮片表面敷蓋凡士林油紗并用無菌紗布包扎覆蓋，創可貼包扎固定，單籠飼養。3 d后去掉凡士林油紗和無菌紗布，逐日觀察移植物排斥狀況。以皮片結痂、變硬、壞死、縮小到初始測量尺寸的50%時，定義為移植皮膚被排斥標準[13]。術后分成對照組和治療組[包括L-Tri組（100 μg/kg）和H-Tri組（200 μg/kg）]。治療組術后連續6 d腹腔注射Tri，對照組給予等體積溶劑（1%吐溫80）。
1.4 流式細胞術
移植術后第7天，分別制備各組小鼠的脾淋巴細胞懸液，將濃度調制5×106/mL。然后取1 mL細胞懸液加入FITC-抗CD4單抗（0.25 μg/106個細胞）和APC-抗CD25單抗（0.125 μg/106個細胞），室溫共孵育15 min，Foxp3-PE標記參照試劑盒操作指南進行破膜標記。標記后的細胞用冷PBS緩沖液（pH 7.4）洗2次。1%多聚甲醛300 μL重懸固定，調整細胞濃度為1×106個/mL，取400 μL上FACScan流式細胞儀進行分析。每份標本均設同型對照，取2次檢測結果均值進行統計學處理。以流式細胞儀雙色、三色分析法分別分析CD4+ CD25+ Foxp3+調節性T細胞的比例。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件及Graphpad Prism 5.0軟件進行數據處理，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Tri對移植皮膚存活時間的影響
對照組移植皮膚平均存活時間為（8.3±1.2）d，L-Tri組為（12.4±1.9）d，H-Tri組為（14.9±2.2）d；與對照組相比，L-Tri組和H-Tri組移植皮膚平均存活時間明顯延長，差異均有統計學意義（均P < 0.05）；與L-Tri組相比，H-Tri組移植皮膚平均存活時間明顯延長，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖1。
A B
A：三組移植皮膚的生存曲線；B：三組移植皮膚的平均生存時間，*P < 0.05，**P < 0.01
圖1 Tri對小鼠同種異體移植皮膚生存時間的影響
2.2 流式細胞檢測結果
皮膚移植術后第7天，Tri處理組脾細胞CD4+ CD25+ Foxp3+ T reg的比例明顯增加，H-Tri組為（16.1±2.1）%，明顯高于L-Tri組[（12.6±1.5）%]（P=0.00），且兩組均明顯高于對照組[（5.6±0.8）%]（P=0.01）。見圖2。
3 討論
器官移植已經成為治療終末期器官衰竭的最有效手段，但移植術后的免疫排斥反應卻長期影響著移植效果和患者的生存質量，免疫抑制藥物的合理應用是移植成敗的關鍵。目前常用的免疫抑制劑的作用效果仍不十分理想，長期應用可造成肝、腎功能受損、感染風險增加、腫瘤發生率增加等一系列不良反應。因此，研究開發新型、低毒、高效的抗排斥藥物，探索更為有效的免疫抑制方案仍然是當前迫切需要解決的問題[6]。
近幾年的研究顯示，Tri在體內、體外均具有較好的免疫抑制活性[14]，在器官移植領域有一定應用前景。在大鼠同種異體心臟移植模型中，Tri能夠明顯延長移植心臟的存活時間，并與他克莫司和環孢霉素均具有明顯協同作用[5]。在小鼠同種異體心臟移植研究中，Tri能夠延長移植心臟存活時間，并與雷帕霉素顯示出了良好的協同作用[6]。有學者研究顯示，在大鼠同種異體腎臟移植中，Tri同樣能夠明顯延長移植腎臟的存活時間[7]。鄭樹森等[8]研究證實，雷公藤多苷能夠輕度抑制大鼠異種原位肝移植排斥反應。He等[9]研究發現，Tri能夠減輕移植肺臟的缺血再灌注損傷，改善移植肺功能。本研究將Tri應用于小鼠同種異體皮膚移植模型，觀察到Tri能夠抑制其免疫排斥反應，有效延長移植物的存活時間，并且隨著Tri劑量的增加，其免疫抑制作用也明顯增強，提示Tri的抗排斥作用與藥物劑量有一定相關性。但Tri發揮免疫抑制作用的機制尚未完全闡明，國內外學者仍然存在較多的爭論。
近年來研究顯示，作為一種新的免疫抑制劑，Tri可抑制T細胞增殖，誘導T細胞和樹突狀細胞（DC）的凋亡，抑制抗原遞呈細胞的抗原遞呈，抑制DC表達主要組織相容性復合體Ⅰ類和Ⅱ類分子[15]，抑制IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、TNF-α等細胞因子的產生[16]。CD4+ CD25+調節性T細胞是Sakaguchi 等于1995 年首先發現，存在于外周血及脾臟組織的CD4+ T細胞中的一類具有獨特抑制功能的T細胞亞群。在小鼠體內占CD4+ T細胞的5%～10%，而在人體內只占2%～3%。近年來研究發現，CD4+ CD25+調節性T細胞作為一群具有免疫負調控功能的T細胞亞群，通過抑制其他免疫效應細胞的激活和增殖，對抑制移植排斥反應和誘導移植免疫耐受起重要作用[17-18]，而輸注CD4+ CD25+調節性T細胞可以促進移植物存活[19]。在同種移植中，有研究證實，CD4+ CD25+調節性T細胞對于預防或糾正慢性移植物抗宿主反應（GVHD）有重要作用[20]。許多研究表明，CD4+ CD25+調節性T細胞亦可以影響巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞、B細胞等的功能[6，21]。Foxp3（forkhead/winged helix transciption factor）作為叉頭狀轉錄因子，為CD4+CD25+ T細胞的發育和功能所必需[22]。Tri能夠促進Foxp3+調節性T細胞的產生[23-24]。
本實驗結果顯示，給予皮膚移植小鼠應用不同劑量Tri，能夠提高受體小鼠脾臟CD4+ CD25+ Foxp3+ T細胞的數量，延長移植皮膚的存活時間，并具有一定劑量依賴效應。由此推斷，Tri可能通過增加移植受體CD4+ CD25+ Foxp3+ T細胞的數量，誘導免疫耐受，從而發揮延長移植物存活時間的作用。但Tri誘導CD4+ CD25+ Foxp3+ T細胞上調的分子機制目前尚不清楚，還需進一步研究。
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